Name: Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Stammzelltransplantation in einem In-vitro-Ischämie/Reperfusion-Modell zur Untersuchung kardialer Zellinteraktionen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellviabilität und therapeutischen Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde von OTKA (Hungarian Scientific Research Fund) D45933, T049621, TET (Hungarian Science and Technology Foundation) A4/04, Arg-17/2006 und SIN, Bolyai, Öveges Stipendien und TÁMOP unterstützt 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 und 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Wir möchten William Gesztes für die Bereitstellung der Voice-over danken.

1. Vorbereitung H9c2 cardiomyoblast Zellen H9c2 Ratte cardiomyoblasts wurden von ATCC (Wesel, Deutschland) erhalten und ausgebaut in hoher Glukose (4,5 g / L) DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 4 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Die H9c2 Myoblasten-Zelllinie aus embryonalen Ratte Herzen abgeleitet wird, wird es als ein in vitro Modell für Skelett-und Herzmuskeln 8,9 verwendet. Bereiten Sie 12 gut Platte H9c2 Zellen: <ol><li> Entfernen Kulturmedium aus Petrischale H9c2 Zellen. </li><li> Wash Zellen zweimal mit 5 ml PBS und verdauen mit 2-3 ml 0,05% Trypsin / EDTA. </li><li> Legen Sie Petrischale für 5 Minuten in die 37 ° C Inkubator. </li><li> Inhibit Trypsin mit 10 ml DMEM Kulturmedium. </li><li> Spin down die Zellen bei 1200 RPM für 8 Minuten. </li><li> Nach Entfernen des Überstands, die Zellen in 1 ml DMEM Kulturmedium und Zählen von Zellen mit Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung.</li><li> Seed 30.000 H9c2 Zellen in 2 ml DMEM pro Well in einer 12-Well-Platte. </li><li> Legen Sie die Platte in die 37 ° C CO 2-Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 2. Simulierte Ischämie / Reperfusion Ischämie / Reperfusion simuliert wurde in vitro, indem Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) auf H9c2 Zellkulturen. Dieses Verfahren wurde auf der Bühne des Zeiss konfokalen Mikroskop mit dem Pecon Zellinkubation System (Erbach, Deutschland) erlaubt die Beobachtung der Zellen während der OGD durchgeführt. <ol><li> Entfernen Medium durch Absaugen von 12-Well-Platte des H9c2 Zellen. </li><li> Wash Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Add 3 ml Glucose-freiem Medium pro Vertiefung. </li><li> Legen Sie die Platte in die Zelle Inkubation System. </li><li> Starten Stickstoff, um den Sauerstoff aus der Inkubation System zu spülen. </li><li> Warten Sie, bis der Sauerstoffgehalt erreicht 0,5% dann den Timer zu starten. 0,5% Sauerstoff bedeutet ca. 3 mmHg teilweisen Spannung. Subject Zellen bis 150 Minuten von simulierten Ischämie. </li><li> Am Ende der simulierten Ischämie, entfernen Sie die Glukose-freiem Medium von den Zellen. </li><li> 2 ml normalen Kulturmedium in die Vertiefungen. </li><li> Legen Sie die 12-Well-Platte für 30 Minuten in die 37 ° C CO 2-Inkubator, das ist der &quot;Reperfusion Zeit&quot;. </li></ol> 3. Vorbereitung Rettung mesenchymalen Stammzellen Knochenmark menschlichen Ursprungs wurde in T75 Flaschen genommen und verdünnt mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Kultur-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin und 1 g / l Glukose. Die Kolben wurden bei 37 ° C in einem vollständig befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 für 3 Tage inkubiert. Nach der Inkubationszeit der BMSCs haftete an der Oberfläche des Flakons und die übrigen Komponenten des Knochenmarks wurden durch Waschen mit PBS entfernt. Die verwendeten BMSCs wurden zwischen 1 und 5 Passagen in den Experimenten. Die IdenTity der Zellen wurde durch die Anwesenheit von Lineage-spezifische Zelloberflächenmarker mit Durchflusszytometrie bestätigt. Hämatopoetische Lineage-spezifische Oberflächenmarker (CD34, CD45) und mesenchymalen Oberflächenmarker (CD73, CD90, CD105 und CD166) wurden untersucht. Während simulierten Ischämie, bereiten Rettung mesenchymale Stammzellen für die Transplantation. <ol><li> Verdünnen Sie die fluoreszierenden Farbstoff Vybrant in 1:200-Verhältnis in DMEM Kulturmedium DiD. </li><li> Absaugen Medium aus dem Rettungs-Zellen und 300 ul DMEM mit Vybrant DiD. </li><li> Legen Sie Petrischale für 30 Minuten in die 37 ° C CO 2-Inkubator. </li><li> Entfernen Kulturmedium aus Petrischale von mesenchymalen Stammzellen. </li><li> Wash Zellen zweimal mit 5 ml PBS und verdauen mit 2-3 ml 0,05% Trypsin / EDTA. </li><li> Legen Sie Petrischale für 5 Minuten in die 37 ° C Inkubator. </li><li> Inhibit Trypsin mit 10 ml DMEM Kulturmedium. </li><li> Spin down die Zellen bei 1200 RPM für 8 Minuten. </li><li> Nach dem Entfernen der Supernatant, die Zellen in 1 ml DMEM Kulturmedium und Zählen von Zellen mit Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung. </li><li> Nach 30 Minuten am Ende der Reperfusion add 20.000 mesenchymalen Stammzellen pro Vertiefung der postischämischen H9c2 kardiale Myoblasten. </li><li> Ort Co-Kultur von Zellen in die 37 ° C CO 2-Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 4. Die Analyse mit der konfokalen Mikroskopie Nach der simulierten Ischämie / Reperfusion, werden die Zellen in normalen Nährmedium für 24 Stunden inkubiert. <ol><li> Nach 24 Stunden waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Stain die Zellen in 500 ul Live / Dead-Farbstoff-Lösung für 30 Minuten (5 nM Calcein und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS) (5x10 4 Zellen / ml). </li></ol> Die Auswertung der konfokalen Bilder für lebende und tote Zellen durch Morphologie und Fluoreszenz ausgewählt werden können mit dem ImageJ Software (National Institutes of Health, USA) durchgeführt werden. Im Falle von co-Kulturen können MSCs aus H9c2 Zellen aufgrund ihrer Vybrant DiD Zelle gekennzeichnet werden. Das Verhältnis von abgestorbenen Zellen kann in 4 unabhängigen Sehfelder (Objektiv 10x) für jede Kultur in einem blinden fashion 10 ausgewertet werden. H9c2 cardiomyoblasts auf 42 mm Deckgläschen kultiviert kann auch mit Zeitraffer-Video-Mikroskopie, während und nach Ischämie / Reperfusion mithilfe der Zell-Inkubation System der konfokalen Mikroskop untersucht werden. Zell-Zell-Interaktionen wie Zell-Fusion und die Bildung von interzellulären Nanoröhrchen können im Laufe der Zeit untersucht werden. 5. Die Analyse mit Durchflusszytometrie Nach der simulierten Ischämie / Reperfusion, werden die Zellen in normalen Nährmedium für 24 Stunden inkubiert. <ol><li> Nach 24 Stunden ernten die Kulturmedien. Es ist sehr wichtig, um das Kulturmedium sammeln auch, weil einige tote Zellen könnten von der Kulturschale Oberfläche während der 24 Stunden Inkubation abgelöst habenTION. </li><li> Wash Zellen zweimal mit PBS und verdauen mit 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Inhibit Trypsin mit DMEM Kulturmedium. </li><li> Spin down der Zellen und die geernteten Kulturmedium bei 1200 RPM (ca. 150-200g) für 8 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Suspend die Zellen in 500 ul Live / Dead-Farbstoff-Lösung für 30 Minuten (5 nM Calcein und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS) (5x10 4 Zellen / ml). </li><li> Transfer-Zellen-Zytometrie Rohre fließen. </li><li> Starten Sie den CellQuest Pro Software. </li><li> So richten Sie das Durchflusszytometer für die Messung, bereiten Kontrollproben von lebenden und toten Zellen. <ol class="lalpha"><li> Platte H9c2 Zellen bei einer Dichte von 3x10 4 in 12-Well-Platten, wie in Punkt 1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie leben Zelle steuert mit einzelnen Trypsinierung wie in Punkt 1 beschrieben. </li><li> Bereiten tote Zelle steuert durch die Behandlung mit 10 uM H 2 O 2 für 1 Stunde. </li><li> Nach Trypsinierung, resuspend lebenden und toten Zellen steuert in 500 ul Live / Dead-Farbstofflösung (5 nM Calcein-AM und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS). </li></ol></li><li> Das Instrument Einstellungen sollten so eingestellt, die lebenden Zellen Calcein positiven und Ethidium Homodimer negativ sind, während die toten Zellen Calcein negativen und Ethidium Homodimer positive sind. </li><li> Der Anteil dieser Bevölkerungsgruppen ausgedrückt als Balken in einem Diagramm und die statistische Analyse auf diesen Werten durchgeführt werden kann. </li><li> Messen Sie die verschiedenen experimentellen Gruppen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Unsere Ergebnisse zeigten, dass hinzugefügt mesenchymalen Stammzellen könnte das Überleben der postischämischen kardialen Zellen zu verbessern. Die konfokale Mikroskopie-Bilder zeigten direkte Zell-Zell-Interaktionen, wie teilweise Membran-Verbindung oder interzelluläre-Nanoröhren, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen in den beobachteten Schutz 10. Diese Nanoröhren span über Entfernungen von mehreren Zell-diameters, und ihre Durchmesser wurden zwischen 200 und 500 nm (weiße Pfeile). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Nanotube-Bildung zwischen den Zellen. Nanotube-Bildung (weißer Pfeil) wurde zwischen Vybrant DiO gekennzeichnet cardiomyoblasts und Vybrant DiD gekennzeichnet mesenchymalen Stammzellen beobachtet. Durchflusszytometrie-Analyse zeigte die Bevölkerung zu überleben und nekrotische cardiomyoblasts und mesenchymalen Stammzellen. Interessanterweise haben wir auch beobachtet, eine dritte, &#39;verletzt&#39; cardiomyoblast Zellpopulation, die Calcein enthalten, sondern enthielt auch die Anzeige der toten Zellen, Ethidium Homodimer (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Vertreter dot-plot der verschiedenen Zellpopulationen nach simulierten Ischämie. Die Auswertung mehrerer Versuche showed, dass die Zugabe von mesenchymalen Stammzellen zu postischämischen H9c2 cardiomyoblast signifikant erhöht den Anteil der lebenden Zellen im Vergleich zu den kardialen Myoblasten allein nach Ischämie kultiviert (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. ., Die nach Zugabe erhöht: Einfluss der Stammzell-Therapie am postischämischen cardiomyoblasts Prozentsatz der lebenden Zellen war signifikant nach simulierten Ischämie im Vergleich zur Kontrollgruppe (90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p&gt; 0,001 Kontrolle vs IR-Modell) reduziert von mesenchymalen Stammzellen (IR-Modell vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p&gt; 0,001). Die Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit one-way Varianzanalyse mit mehreren Vergleich Tukey post hoc Test durchgeführt.

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<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Beweis-Protokoll ist ein in vitro Ansatz für die viel mehr komplexe Thema der Stammzellentherapie bei Herzinfarkt, mit allen Vor-und Nachteile eines solchen Modells. Natürlich kann es nicht spiegeln die komplexe (zB immunologische) stattfindenden Veranstaltungen während und nach Myokard-Infarkt, kann aber auf die direkten Auswirkungen der zusätzlichen Zellen auf der postischämischen Zellen konzentrieren. Die Auswirkungen der simulierten Ischämie auf H9c2 cardiomyoblasts in hohem Maße abhängig von der Zeit des OGD, a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Calcein-AM </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Ethidium Homodimer-2 </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant DiD </td><td> Molecular Probes </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Pecon Zellinkubation System für Zeiss-Mikroskope </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Equipment.

stem cell transplantation in einem in-vitro- simulierte ischämie / reperfusion-modell

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stammzelltransplantation Protokolle finden ihren Weg in die klinische Praxis 1,2,3. Getting bessere Ergebnisse, so dass die Protokolle mehr robust, und die Suche nach neuen Quellen für implantierbare Zellen stehen im Mittelpunkt der jüngsten Forschung 4,5. Untersuchung der Wirksamkeit von Zelltherapien ist keine leichte Aufgabe, und neue Werkzeuge sind nötig, um die Mechanismen in der Behandlung Verfahren 6 zu erforschen. Wir haben ein experimentelles Protokoll der Ischämie / Reperfusion, um die Beobachtung von zellulären Verbindungen und sogar subzelluläre Mechanismen während der Ischämie / Reperfusion und nach Stammzelltransplantation zu ermöglichen und die Wirksamkeit der Zelltherapie zu bewerten. H9c2 cardiomyoblast Zellen wurden auf Zellkulturplatten 7,8 platziert. Ischämie simuliert wurde mit 150 Minuten in einer Glucose-freiem Medium mit Sauerstoff unter 0,5%. Dann wurden normale Medien-und Sauerstoff wieder zu Reperfusion zu simulieren. Nach Sauerstoff Glukose Deprivation,die geschädigten Zellen wurden mit der Transplantation von markiertem menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen, indem sie in die Kultur behandelt. Mesenchymale Stammzellen sind in klinischen Studien bevorzugt, weil sie leicht zu erreichen mit minimal-invasiven Chirurgie, leicht erweiterbar und autologe sind. Nach 24-stündiger Kokultivierung wurden die Zellen mit Calcein und Ethidium-Homodimer gefärbt, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dieses Setup erlaubt uns, die interzellulären Verbindungen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen und die Überlebensrate von postischämischen Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Die konfokale Mikroskopie zeigte die Wechselwirkungen der beiden Zellpopulationen wie Zellfusion und die Bildung von interzellulären Nanoröhren. Durchflusszytometrie-Analyse ergab 3 Cluster von beschädigten Zellen, die in einem Diagramm dargestellt und können statistisch ausgewertet werden. Diese Populationen können separat untersucht werden und Rückschlüsse auf diese Daten über die Wirksamkeit der simulierten gezogen werdenTherapieansatz.

Wir zeigen, wie die Einrichtung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie / Reperfusion-Modell und wie man den Effekt der Stammzelltherapie am postischämischen Herzzellen zu bewerten.

Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Protokolle zur Stammzelltransplantation finden zunehmend Einzug in die klinische Praxis1,2,3. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, die Protokolle robuster zu gestalten und ...

Kardiale Zellen werden zur Simulation einer Ischämie in Zellkulturschalen gegeben. Die Ischämie im Reperfusionsmodell wird durch 150 Minuten in einem glucosefreien Medium bei einem Sauerstoffgehalt unter 0,5 % erreicht. Diese ischämische Phase führt zur Schrumpfung und Blabbing der meisten Zellen. Anschließend werden normales Medium und normale Sauerstoffkonzentrationen wiederhergestellt, um die Reperfusion zu simulieren.Es werden mesenchymale Stammzellen hinzugefügt und gemeinsam mit den geschädigten Zellen kultiviert. Nach 24-stündiger Kokultivierung werden die Zellen mit Calcium und Ethidiumhomodimer gefärbt, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden. Die konfokale Mikroskopie zeigt deutlich die beiden Zellpopulationen und ihre Wechselwirkungen. Die Durchflusszytometrie-Analyse offenbart drei Cluster geschädigter Zellen, die grafisch dargestellt und statistisch ausgewertet werden können. Stammzelltransplantation. Protokolle finden zunehmend Eingang in die klinische Praxis; bessere Ergebnisse zu erzielen, die Protokolle robuster zu machen und neue Quellen für implantierbare Zellen zu finden, steht im Fokus aktueller Forschung.Die Untersuchung der Wirksamkeit von Zelltherapien ist keine leichte Aufgabe, und es werden neue Werkzeuge benötigt, um die an dem Behandlungsprozess beteiligten Mechanismen zu erforschen. Wir haben ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Beobachtung zellulärer Verbindungen und sogar subzellulärer Mechanismen während der Ischämie, der Perfusionsverletzung und nach der Stammzelltransplantation zu ermöglichen. Unsere Konstruktionskriterien, unser vollständig in vitro arbeitendes System, enthalten jedoch nur Wirt- und Spenderzellen.So ist sie vom umgebenden Gewebe isoliert. Kontinuierliche Messung der Zellviabilität vor, während und bis zu 24 Stunden nach der Verletzung. Und eindeutige Identifizierung beider Zellpopulationen, sodass das Schicksal der transplantierten Zellen verfolgt werden kann.Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir einen Protokollablauf zur Sauerstoff- und Glukoseentzug, üblicherweise als OGD abgekürzt, gefolgt von einer Reoxygenierungsphase, etabliert. Als Wirtszellen wählten wir Alter neun C zwei Zellen, eine bekannte rote kardiale Myoblastenzelllinie. Nach OGD wurden die geschädigten Zellen durch die Transplantation von aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen unterstützt, indem diese der Kultur hinzugefügt wurden.Mit dieser Versuchsanordnung konnten wir die interzellulären Verbindungen mittels konfokaler Mikroskopie untersuchen und die Überlebensrate geschädigter Zellen durchflusszytometrisch quantifizieren. Beginnen wir und sehen wir, wie wir es machen. Entfernen Sie das Kulturmedium von H nine C two-Zellen.Die Zellen zweimal mit PBS waschen und mit 0,05 % Trypsin-EDTA für fünf Minuten in Petrischalen inkubieren. Trypsin in einem 37-Grad-Inkubator mit DMEM-Kulturmedium hemmen. Die Zellen bei 1200 U/min für acht Minuten abzentrifugieren.Nach dem Entfernen des Überstandes die Zellen in einem Milliliter DMEM-Kulturmedium resuspendieren, die Zellen mit einem Hämocytometer unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zählen und 30.000 H9c2-Zellen pro Vertiefung aussäen. Die Platte in einem 12-Loch-Platte in den 37-Grad-CO₂-Inkubator für 24 Stunden stellen. Das Medium durch Absaugen entfernen und die Zellen zweimal mit PBS waschen.Geben Sie drei Milliliter glucosefreies Medium hinzu. Stellen Sie die Platte in das Zellinkubationssystem. Beginnen Sie mit der Zufuhr von Stickstoffgas, um den Sauerstoff aus dem Inkubationssystem zu verdrängen.Warten Sie, bis der Sauerstoffgehalt 0,5 % erreicht. Starten Sie dann die Stoppuhr. Ein Sauerstoffgehalt von 0,5 % entspricht einer partiellen Spannung von etwa drei Millimeter Quecksilber; setzen Sie die Zellen 150 Minuten lang einer simulierten Ischämie aus. Während der Ischämie lösen sich die Zellen von der Oberfläche und ihre Membran beginnt, Blasen zu bilden. Wir stellten fest, dass jede Population leicht unterschiedliche Zeiträume benötigt, um ein Zellbild mit 60 bis 80 % erreichen zu können.Deshalb empfehlen wir, mit der zweistündigen R- Inkubation zu beginnen. Und falls dies nicht ausreicht, verlängern Sie die Dauer der OGD. In unserem Fall benötigen in der Regel neun Tage alte C2-Zellen 150 bis 70 Minuten OGD am Ende der simulierten Ischämie.Entfernen Sie das glucosefreie Medium von den Zellen und pipettieren Sie normales Kulturmedium in die Vertiefungen. Stellen Sie eine 12-Loch-Platte für 30 Minuten in den 37-Grad-CO₂-Inkubator. Dies ist die Reperfusionsphase.Während der simulierten Ischämie bereiten Sie Rettungszellen für die Transplantation vor. Verdünnen Sie die fluoreszierende Nahrung, vibrant DID, im Verhältnis 1 zu 200 in DMEM-Kulturmedium. Aspirieren Sie das Medium von den Rettungszellen und geben Sie 300 Mikroliter DMEM aus vibrant Brent Place-Petrischalen für 30 Minuten in den 37-Grad-CO₂-Inkubator hinzu.Nach 30 Minuten am Ende der Reperfusion fügen Sie tausend mesenchymale Stammzellen pro Vertiefung zu den postischämischen H9c2-Kardiomyoblasten hinzu. Die anfänglichen Schritte sind dieselben wie beim Ansäen der H9c2-Zellen: zweimaliges Waschen mit PBS, Behandlung mit Trypsin und Zählen. Bringen Sie die Kokultur der Zellen für 24 Stunden in den 37-Grad-CO₂-Inkubator.Nach 24 Stunden. Gewinnen Sie das Kulturmedium und die anhaftenden Zellen aus den Vertiefungen mit ization. Es ist sehr wichtig, das Kulturmedium ebenfalls zu sammeln, da sich einige tote Zellen während der 24-stündigen Inkubation von der Oberfläche der Kulturschale gelöst haben könnten.Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter Live-Dead-L&ouml;sung, f&uuml;nf NMO Calcium und 400 NMO Ethanolumdimer in PBS mit f&uuml;nf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter. Im Fall von Kokulturen werden mesenchymale Stammzellen von H9c2-Zellen durch die jeweilige fluoreszierende Zellmarkierung unterschieden. Auf diese Weise ist es m&ouml;glich, Zellfusionen und Zell-Zell-Kontaktstellen nachzuweisen.Das Verhältnis abgestorbener Zellen kann in vier unabhängigen Gesichtsfeldern mithilfe eines 10-fachen Objektivs für jede Kultur in verblindeter Weise ausgewertet werden, was ein reproduzierbares Ergebnis der Zellzählung liefert. Überführen Sie die Zellen in Durchflusszytometrie-Röhrchen. Starten Sie die Cell-Quest-Pro-Software, um den Durchflusszytometer für die Messung einzurichten.Bereiten Sie Kontrollproben aus lebenden und toten Zellen vor. Lebende Zellen werden bei gleicher Dichte unter normalen Bedingungen kultiviert und mit Calcium gefärbt. Tote Zellen werden durch eine einstündige Behandlung mit 10 Mikromol Wasserstoffperoxid hergestellt, mit Ethidium-Homodimer gefärbt und auf die gleiche Weise geerntet. Die Instrumenteneinstellungen sollten so angepasst werden, dass die lebenden Zellen calciumpositiv und ethidium-homodimer-negativ sind.Während tote Zellen kalziumnegativ und Ethidium-Homodimer-positiv sind, können die Anteile dieser Populationen als Balken in einem Diagramm dargestellt und statistisch ausgewertet werden. Wir fanden heraus, dass die Zugabe gesunder Stammzellen das Verhältnis überlebender Zellen in der Population erhöht. Interessanterweise beobachteten wir außerdem, dass die Zellen, die nach der Verletzung gerettet wurden, von den toten Zellen, aber auch von denjenigen, die weiterhin lebendig blieben, abgegrenzt werden können.Wir sind der Ansicht, dass diese Population weitere Untersuchungen erfordert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ischämische Simulationsexperimente mit der in-vitro-Stammzelltransplantation standardisiert durchführt. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Falls Sie technische Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Wir stehen Ihnen gerne zur Verfügung.

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Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

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Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

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