Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Kardiale Zellen werden zur Simulation einer Ischämie in Zellkulturschalen gegeben. Die Ischämie im Reperfusionsmodell wird durch 150 Minuten in einem glucosefreien Medium bei einem Sauerstoffgehalt unter 0,5 % erreicht. Diese ischämische Phase führt zur Schrumpfung und Blabbing der meisten Zellen. Anschließend werden normales Medium und normale Sauerstoffkonzentrationen wiederhergestellt, um die Reperfusion zu simulieren.

Es werden mesenchymale Stammzellen hinzugefügt und gemeinsam mit den geschädigten Zellen kultiviert. Nach 24-stündiger Kokultivierung werden die Zellen mit Calcium und Ethidiumhomodimer gefärbt, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden. Die konfokale Mikroskopie zeigt deutlich die beiden Zellpopulationen und ihre Wechselwirkungen. Die Durchflusszytometrie-Analyse offenbart drei Cluster geschädigter Zellen, die grafisch dargestellt und statistisch ausgewertet werden können. Stammzelltransplantation. Protokolle finden zunehmend Eingang in die klinische Praxis; bessere Ergebnisse zu erzielen, die Protokolle robuster zu machen und neue Quellen für implantierbare Zellen zu finden, steht im Fokus aktueller Forschung.

Die Untersuchung der Wirksamkeit von Zelltherapien ist keine leichte Aufgabe, und es werden neue Werkzeuge benötigt, um die an dem Behandlungsprozess beteiligten Mechanismen zu erforschen. Wir haben ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Beobachtung zellulärer Verbindungen und sogar subzellulärer Mechanismen während der Ischämie, der Perfusionsverletzung und nach der Stammzelltransplantation zu ermöglichen. Unsere Konstruktionskriterien, unser vollständig in vitro arbeitendes System, enthalten jedoch nur Wirt- und Spenderzellen.

So ist sie vom umgebenden Gewebe isoliert. Kontinuierliche Messung der Zellviabilität vor, während und bis zu 24 Stunden nach der Verletzung. Und eindeutige Identifizierung beider Zellpopulationen, sodass das Schicksal der transplantierten Zellen verfolgt werden kann.

Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir einen Protokollablauf zur Sauerstoff- und Glukoseentzug, üblicherweise als OGD abgekürzt, gefolgt von einer Reoxygenierungsphase, etabliert. Als Wirtszellen wählten wir Alter neun C zwei Zellen, eine bekannte rote kardiale Myoblastenzelllinie. Nach OGD wurden die geschädigten Zellen durch die Transplantation von aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen unterstützt, indem diese der Kultur hinzugefügt wurden.

Mit dieser Versuchsanordnung konnten wir die interzellulären Verbindungen mittels konfokaler Mikroskopie untersuchen und die Überlebensrate geschädigter Zellen durchflusszytometrisch quantifizieren. Beginnen wir und sehen wir, wie wir es machen. Entfernen Sie das Kulturmedium von H nine C two-Zellen.

Die Zellen zweimal mit PBS waschen und mit 0,05 % Trypsin-EDTA für fünf Minuten in Petrischalen inkubieren. Trypsin in einem 37-Grad-Inkubator mit DMEM-Kulturmedium hemmen. Die Zellen bei 1200 U/min für acht Minuten abzentrifugieren.

Nach dem Entfernen des Überstandes die Zellen in einem Milliliter DMEM-Kulturmedium resuspendieren, die Zellen mit einem Hämocytometer unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zählen und 30.000 H9c2-Zellen pro Vertiefung aussäen. Die Platte in einem 12-Loch-Platte in den 37-Grad-CO₂-Inkubator für 24 Stunden stellen. Das Medium durch Absaugen entfernen und die Zellen zweimal mit PBS waschen.

Geben Sie drei Milliliter glucosefreies Medium hinzu. Stellen Sie die Platte in das Zellinkubationssystem. Beginnen Sie mit der Zufuhr von Stickstoffgas, um den Sauerstoff aus dem Inkubationssystem zu verdrängen.

Warten Sie, bis der Sauerstoffgehalt 0,5 % erreicht. Starten Sie dann die Stoppuhr. Ein Sauerstoffgehalt von 0,5 % entspricht einer partiellen Spannung von etwa drei Millimeter Quecksilber; setzen Sie die Zellen 150 Minuten lang einer simulierten Ischämie aus. Während der Ischämie lösen sich die Zellen von der Oberfläche und ihre Membran beginnt, Blasen zu bilden. Wir stellten fest, dass jede Population leicht unterschiedliche Zeiträume benötigt, um ein Zellbild mit 60 bis 80 % erreichen zu können.

Deshalb empfehlen wir, mit der zweistündigen R- Inkubation zu beginnen. Und falls dies nicht ausreicht, verlängern Sie die Dauer der OGD. In unserem Fall benötigen in der Regel neun Tage alte C2-Zellen 150 bis 70 Minuten OGD am Ende der simulierten Ischämie.

Entfernen Sie das glucosefreie Medium von den Zellen und pipettieren Sie normales Kulturmedium in die Vertiefungen. Stellen Sie eine 12-Loch-Platte für 30 Minuten in den 37-Grad-CO₂-Inkubator. Dies ist die Reperfusionsphase.

Während der simulierten Ischämie bereiten Sie Rettungszellen für die Transplantation vor. Verdünnen Sie die fluoreszierende Nahrung, vibrant DID, im Verhältnis 1 zu 200 in DMEM-Kulturmedium. Aspirieren Sie das Medium von den Rettungszellen und geben Sie 300 Mikroliter DMEM aus vibrant Brent Place-Petrischalen für 30 Minuten in den 37-Grad-CO₂-Inkubator hinzu.

Nach 30 Minuten am Ende der Reperfusion fügen Sie tausend mesenchymale Stammzellen pro Vertiefung zu den postischämischen H9c2-Kardiomyoblasten hinzu. Die anfänglichen Schritte sind dieselben wie beim Ansäen der H9c2-Zellen: zweimaliges Waschen mit PBS, Behandlung mit Trypsin und Zählen. Bringen Sie die Kokultur der Zellen für 24 Stunden in den 37-Grad-CO₂-Inkubator.

Nach 24 Stunden. Gewinnen Sie das Kulturmedium und die anhaftenden Zellen aus den Vertiefungen mit ization. Es ist sehr wichtig, das Kulturmedium ebenfalls zu sammeln, da sich einige tote Zellen während der 24-stündigen Inkubation von der Oberfläche der Kulturschale gelöst haben könnten.

Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter Live-Dead-Lösung, fünf NMO Calcium und 400 NMO Ethanolumdimer in PBS mit fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter. Im Fall von Kokulturen werden mesenchymale Stammzellen von H9c2-Zellen durch die jeweilige fluoreszierende Zellmarkierung unterschieden. Auf diese Weise ist es möglich, Zellfusionen und Zell-Zell-Kontaktstellen nachzuweisen.

Das Verhältnis abgestorbener Zellen kann in vier unabhängigen Gesichtsfeldern mithilfe eines 10-fachen Objektivs für jede Kultur in verblindeter Weise ausgewertet werden, was ein reproduzierbares Ergebnis der Zellzählung liefert. Überführen Sie die Zellen in Durchflusszytometrie-Röhrchen. Starten Sie die Cell-Quest-Pro-Software, um den Durchflusszytometer für die Messung einzurichten.

Bereiten Sie Kontrollproben aus lebenden und toten Zellen vor. Lebende Zellen werden bei gleicher Dichte unter normalen Bedingungen kultiviert und mit Calcium gefärbt. Tote Zellen werden durch eine einstündige Behandlung mit 10 Mikromol Wasserstoffperoxid hergestellt, mit Ethidium-Homodimer gefärbt und auf die gleiche Weise geerntet. Die Instrumenteneinstellungen sollten so angepasst werden, dass die lebenden Zellen calciumpositiv und ethidium-homodimer-negativ sind.

Während tote Zellen kalziumnegativ und Ethidium-Homodimer-positiv sind, können die Anteile dieser Populationen als Balken in einem Diagramm dargestellt und statistisch ausgewertet werden. Wir fanden heraus, dass die Zugabe gesunder Stammzellen das Verhältnis überlebender Zellen in der Population erhöht. Interessanterweise beobachteten wir außerdem, dass die Zellen, die nach der Verletzung gerettet wurden, von den toten Zellen, aber auch von denjenigen, die weiterhin lebendig blieben, abgegrenzt werden können.

Wir sind der Ansicht, dass diese Population weitere Untersuchungen erfordert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ischämische Simulationsexperimente mit der in-vitro-Stammzelltransplantation standardisiert durchführt. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Falls Sie technische Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Wir stehen Ihnen gerne zur Verfügung.