Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch ¹³ C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, den bakteriellen Stoffwechsel mit Hilfe der Kohlenstoff-13-gestützten Stoffwechselanalyse zu untersuchen. Zu Beginn werden Mikroben in Gegenwart von markierten Kohlenstoffsubstraten gezüchtet, die in die mikrobiellen Proteine eingebaut werden. Die Mikroben werden dann geerntet und Aminosäuren extrahiert, hydrolysiert und derivatisiert.

Die Proben werden auf einen Gaschromatographen und ein Massenspektrometer (GCMS) aufgebracht. Durch die Verfolgung der atomaren Übergangswege zwischen Metaboliten im biochemischen Netzwerk können die von der Mikrobe genutzten funktionellen Stoffwechselwege bestimmt werden. Ich bin Bert Burla.

Die hier vorgestellte Methode kann als Ergänzung zur Transkriptomik und Proteomik zur Bestimmung der Stoffwechselwege in Mikroben verwendet werden. Wir haben diese Technik verwendet, um photosynthetische Mikroben wie Cyanobakterien auf myotrophe oder heterotrophe Kohlenstoffverwertung zu untersuchen. In diesem Video werden wir ANOTHE 5 1 1 42 als Modellstamm verwenden, um die Verwendung von markierten Kohlenstoffsubstraten zur Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.

Die Prozedur wird von mir, Li Yu und Chu Yang Fang demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Cyana-Thesei-Bakterien in einem unmarkierten Medium züchten. Wenn die Bakterien die mittlere logarithmus Wachstumsphase erreichen, inokulieren Sie 3 Vol.-% in das mit Kohlenstoff 13 markierte Medium.

Dann, um die Einführung von unmarkiertem Kohlenstoff aus der ursprünglichen Inokulum-Subkultur in das gleiche markierte Medium in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase zu vermeiden. Wenn die mit Kohlenstoff 13 markierten Cy Thesei-Bakterien die mittlere logarithmus Wachstumsphase erreichen, ernten Sie 10 Milliliter durch Zentrifugation. Das Pellet wird in 1,5 Millilitern sechsmoliger Salzsäure erneut suspendiert und in ein klares Glas-Gaschromatographie- oder GC-Fläschchen mit Schraubverschluss überführt.

Verschließen Sie die Fläschchen und stellen Sie sie für 24 Stunden in einen 100 Grad Celsius heißen Ofen, um die Biomasseproteine in Aminosäuren zu hydrolysieren. Bei der Hydrolyse von Biomassepellets werden 16 der 20 gängigen Aminosäuren gewonnen, nach der Hydrolyse wird die Aminosäurelösung in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und dann fünf Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Nach der Hydrolyse die Aminosäurelösung in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und dann fünf Minuten lang bei 20.000 GS zentrifugieren, um feste Partikel abzuscheiden.

Übertragen Sie die Überstände nach dem Schleudern in neue GC-Fläschchen, um feste Partikel in der Hydrolyselösung zu entfernen, damit sie nicht in die GC-Säule gelangen. Als nächstes werden die Aminosäuren getrocknet, um sie zu verarbeiten. Die getrockneten Proben werden mit 150 Mikrolitern Tetraeder, THF und 150 Mikrolitern Butyldimethylsilo und Methyltrifluor gelöst.

Acetamid, T-B-D-M-S Derivitisierungsreagenz Inkubieren Sie alle Proben in einem Ofen zwischen 65 und 80 Grad Celsius für eine Stunde. Die Proben gelegentlich vortexen, um sicherzustellen, dass die Metaboliten im Fläschchen aufgelöst sind. Die Proben werden 10 Minuten lang bei 20.000 GS zentrifugiert und dann der Überstand in neue GC-Fläschchen überführt.

Der Überstand sollte ein klares gelbliches Lösungsprogramm sein. Die GC-Temperaturen werden wie folgt gemessen, halten sie zwei Minuten lang bei 150 Grad Celsius. Erhöhen Sie die Temperatur um drei Grad Celsius pro Minute auf 280 Grad Celsius.

Erhöhen Sie die Temperatur bei 20 Grad Celsius pro Minute auf 300 Grad Celsius und halten Sie sie dann fünf Minuten lang. Stellen Sie dann für eine 30-Meter-GC-Säule die Lösungsmittelverzögerung auf etwa fünf Minuten und den Bereich des Masse-Ladungs-Verhältnisses auf 60 bis 500 ein. Analysieren Sie die Proben mittels GCMS mit einem Injektionsvolumen von einem Mikroliter bis fünf oder einem Verhältnis von 1 zu 10 und einem Trägergas Helium von 1,2 Millilitern pro Minute nach dem Lauf.

Analysieren Sie die GCMS-Daten mit Microsoft Excel. Die GC-Retentionszeit und die einzigartigen Peaks des Massen-Ladungs-Verhältnisses für jede Aminosäure sind in dieser Abbildung dargestellt. T-B-D-M-S. Abgeleitete Aminosäuren werden durch MS in der Regel eindeutig in zwei geladene Fragmente gespalten: Fragment M minus 57, das die gesamte Aminosäure enthält, und Fragment M minus 1 59, dem die Alpha-Carboxylgruppe der Aminosäure für Leucin und Iso-Leucin fehlt.

Der M minus 57 Peak wurde von anderen Massenpeak-Fragmenten überlagert. Mit N minus 15 kann die gesamte Aminosäuremarkierung analysiert werden. Außerdem wird die F 3 0 2-Gruppe häufig in den meisten Aminosäuren nachgewiesen und enthält nur die erste Alpha-Carboxylgruppe und die zweiten Kohlenstoffe in einem Aminosäurerückgrat.

Da dieser Ms.Peak jedoch häufig hohe Rausch-Signal-Verhältnisse aufweist, wird F 3 0 2 für die quantitative Analyse der Stoffwechselflüsse nicht empfohlen. Die Ableitung von Aminosäuren oder zentralen Metaboliten führt zu signifikanten Mengen natürlich markierter Isotope, darunter Kohlenstoff 13, Sauerstoff 18, Silizium 29 und Silizium 30. Das Messrauschen von natürlichen Isotopen im Rohmassenisotop oder -spektrum kann mit Hilfe veröffentlichter Software korrigiert werden.

Die endgültigen Daten zur Isotopenmarkierung werden als Massenfraktionen angegeben. Zum Beispiel M null, M1, M zwei, M drei und M vier, die Fragmente darstellen, die null bis vier mit Kohlenstoff 13 markierte Kohlenstoffe cyana enthalten. Diese 5 1 1 2 enthalten nicht das Enzym Drei-Anin-Ammoniak-Lyase, das die Umwandlung von Drei-Anin- in Zwei-Keto-Butyrat im typischen Inselsyntheseweg katalysiert.

Um den Inselweg in diesem Organismus aufzulösen, wurde Cyana THESEI 5 1 1 42 in ASP zwei Medium mit 54 Millimolar Glycerin gezüchtet und mit GCMS analysiert, wie in diesem Video beschrieben, wie hier gezeigt, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 verwendet Glycerin der zweiten Position als Hauptkohlenstoffquelle, und wir beobachteten, dass Thianin und Alanin, deren Vorläufer Pyruvat ist, haben einen markierten Kohlenstoff, während ISO-Leucin mit drei Kohlenstoffen markiert wurde. Daher können Synthese und Cyana, diese 5 1 1 4 2 nicht aus dem Thianinweg abgeleitet werden, der von den meisten Organismen verwendet wird. Auf der anderen Seite haben Leucin und ISO-Leucin identische Markierungsmuster, die auf Fragment M minus 15 und Fragment M minus 1 59 basieren.

Zum Beispiel zeigten die Isotope oder Daten von N minus 15, die UNFRAGMENTIERTE Aminosäuren enthielten, eine identische Markierung für Leucin und ISO-Leucin. Daher müssen Leucin und ISO-Leucin aus den gleichen Vorläufern, Pyruvat und Acetyl-CoA, synthetisiert werden. Diese Beobachtung stimmt mit dem markierten Kohlenstoffübergang im Citra-Malatweg für die Inselsynthese überein.

Diese Methode kann verwendet werden, um den Stoffwechsel einer Vielzahl von Mikroben zu untersuchen, und kann nach der Beherrschung in etwa einer Woche von Anfang bis Ende durchgeführt werden.