Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, humane Gelenkknorpelzellen in synovialem Fluid über Langzeitkulturen zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem die Chondrozyten zunächst in Alginate-Kügelchen eingeschlossen werden. Anschließend werden die Chondrozyten in synovialem Fluid kultiviert, wodurch sie in einer 3D-Umgebung proliferieren können, die ihren normalen Wachstumsbedingungen ähnelt.

Das Kulturmedium muss regelmäßig gewechselt werden, um den Zellen einen ausreichenden Zugang zu Nährstoffen zu ermöglichen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Chondrozyten aus den Alginate-Kügelchen zu gewinnen, um sie anschließend auf Genexpression und histologisch zu analysieren. Diese Analysen bestätigen, dass in Alginate-Kügelchen kultivierte Chondrozyten vital, proliferierend sind und eine beträchtliche Menge an Knorpelmatrix exprimieren.

Die wichtigsten Vorteile der Anwendung dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden liegen darin, dass wir die Knorpelzellen in einem dreidimensionalen Umfeld anstelle eines zweidimensionalen analysieren. Außerdem verwenden wir Synovialflüssigkeit als Kulturmedium anstelle eines künstlichen Mediums. Die Kombination aus der Nutzung eines dreidimensionalen Konstrukts und der Verwendung von Synovialflüssigkeit ermöglicht es uns, die Zellen in einer natürlicheren Umgebung zu untersuchen, im Gegensatz zur zweidimensionalen Kultur auf einer Platte und in künstlichem Medium.

Die Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Knorpelbiologie und Gewebeengineering zu beantworten. Zum Beispiel: Wie verhalten sich Knorpelzellen oder Chondrozyten langfristig in Synovialflüssigkeit? Und sollten wir die Knorpelzellen vor der Transplantation in den Wirt an die Synovialflüssigkeit gewöhnen?

Bereiten Sie ein eintausend Milliliter fassendes Gefäß mit humanen artikulären Chondrozyten oder Hacks vor, indem Sie es eine Minute lang in warmem Wasser auftauen. Anschließend mischen Sie die Hacks in ein Gefäß, das zwei Milliliter vorgewärmtes Chondrozyten-Wachstumsmedium enthält. Um das Einfriermedium, das DMSO enthält, zu entfernen, pelletieren Sie die Zellen bei 3000 U/min für drei bis fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in sieben Milliliter Chondrozyten-Wachstumsmedium.

Überführen Sie die Zellen anschließend in eine 10 cm-Platte und kultivieren Sie sie, bis die Zellen konfluent sind. Die Zellen sollten in einer Passagezahl von nicht höher als drei oder vier verwendet werden. Nach Erreichen der Konfluenz waschen Sie die Zellen mit einer Natriumchloridlösung statt mit PBS.

Sammlen Sie die Zellen anschließend durch Behandlung mit 0,5 Milliliter Standard-Trypsin-EDTA-Lösung. Sobald sich die Zellen gelöst haben, zentrifugieren Sie sie ab; sie sind dann bereit für die 3D-Einbettung. Heben Sie das Zellpellet auf, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einer 1,2 %igen Alginate-Lösung mit einer Dichte von 800.000 Zellen pro Milliliter.

Bereiten Sie nun eine Calciumchlorid-Lösung mit dem Fünffachen des Volumens der Hack-Alginat-Lösung vor. Rühren Sie die Lösung langsam um, während die Hack-Alginat-Lösung hergestellt wird. Pipettieren Sie die Hack-Alginat-Lösung in eine 12-Milliliter-Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel verbunden ist.

Wenn das Calciumchlorid bereit ist, halten Sie die Spritze etwa 15 cm über der Oberfläche der Calciumchlorid-Lösung. Die Höhe der Spritze ist nun erreicht. Die Calciumchlorid-Lösung ist wirklich wichtig.

Wenn Sie es nicht hoch genug halten, werden die Kugeln nicht kugelförmig und geformt. Dann geben Sie die Hack-Alginat-Mischung tropfenweise hinzu. Typischerweise ergeben die Kugeln einen Durchmesser von zwei Millimetern mit etwa 10 hoch vier Zellen pro Kugel.

Um die Integrität der Kugeln zu verbessern, lassen Sie die Kugeln 20 bis 25 Minuten in Lösung rühren. Sobald das Rühren der Kugeln abgeschlossen ist, lassen Sie sie absetzen und dekantieren Sie die Calciumchloridlösung ab. Anschließend waschen Sie die Kugeln zwei bis drei Mal mit Natriumchloridlösung, die etwa zwei- bis dreimal das Volumen der Kugeln beträgt.

Statt Filter zu verwenden, halten Sie die Perlen feucht, indem Sie sie zwischen den Wechseln der Waschlösung absetzen lassen. Führen Sie nach den Calciumchlorid-Waschungen eine Wäsche mit Chondrozyten-Differenzierungsmedium durch. Überführen Sie die Perlen anschließend mit einem Spatel in Kulturschalen und kultivieren Sie sie 48 Stunden lang in Chondrozyten-Wachstumsmedium, bevor Sie auf Chondrozyten umstellen.

Differenzierungsmedium mit Synovialflüssigkeit, die unmittelbar nach der Gewinnung vorbereitet werden muss. Frische Synovialflüssigkeit in 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und sofort 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugieren. Um Zelltrümmer zu entfernen, ist der klare Überstand die Synovialflüssigkeit; diese in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen portionieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis eine optimale Konzentration der Synovialflüssigkeit bestimmt ist.

Verwenden Sie verschiedene Kulturmedien, die aus Synovialflüssigkeit und Chondrozyten-Differenzierungsmedium in unterschiedlichen volumetrischen Verhältnissen bestehen, bei konstanter Konzentration an Ascorbinsäure und Calciumchlorid-Kultur. Inkubieren Sie die Platten auf einer schwingenden Plattform in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bevor Sie das alte Medium entfernen.

Verdünnen Sie es mit Calciumchloridlösung, um die Viskosität zu verringern und gleichzeitig die Stabilität der Kugeln zu erhöhen. Danach pipettieren Sie die Suspension langsam von den Platten ab. Die Kugeln können vor der Ernte bis zu vier Wochen kultiviert werden, abhängig von ihrer Proliferationsmatrixproduktion und den Versuchszielen.

Wenn die Hacks aus den Alginate-Kügelchen für die Genexpression oder histologische Analyse gewonnen werden, spülen Sie die Alginate-Kügelchen dreimal in Calciumchlorid-Lösung, ohne einen Filter für die Genexpressionsanalyse zu verwenden. Isolieren Sie die Chondrozyten, indem Sie sie in Natriumcitrat einlegen, dessen Volumen das Vier- bis Fünffache des Volumens der Kügelchen beträgt. Schütteln Sie die Mischung 20 bis 30 Minuten lang und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend in 15-Milliliter-Röhrchen.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Puffer zur Zelllyse aus einem herkömmlichen Kit, und fahren Sie mit dem standardisierten RNA-Reinigungsprotokoll fort, um die gewaschenen Perlen für die Fixierung vorzubereiten. Schließen Sie an die Calciumchlorid-Waschungen ein Übernachtsinkubation in Wash Inc. Chondro-Differenzierungsmedium an.

Fixieren Sie die Kügelchen in zwei Milliliter 70%igem Ethanol für mehr als 15 Minuten bei vier Grad Celsius und führen Sie anschließend die histologische Analyse auf DAPPY-Färbung durch. Inkubieren Sie die Alginate-Kügelchen eine Stunde lang unter leichtem Schütteln in DAPI-Lösung. Waschen Sie die Kügelchen danach dreimal mit Calciumchlorid-Lösung, bevor Sie die Alginate-Kügelchen unter einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren.

Die Kügelchen können außerdem für die histologische Schnittuntersuchung mit Ian-Blue- und H&E-Färbung präpariert werden. Histo­logische Schnitte von DAPI-gefärbten Alginkügelchen, überlagert mit Hellfeldbildern, zeigten eine gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Kügelchen, die unter allen Bedingungen – von Medium ohne Synovialflüssigkeit bis hin zu vollständig auf Synovialflüssigkeit basierendem Medium – kultiviert wurden. Am Ende der 21-tägigen Kulturphase wurde die Genexpression von humanen Gelenkchondrozyten gemessen, die in Synovialflüssigkeit kultiviert worden waren, welche aus sechs Patienten mit Osteoarthritis gepoolt wurde, was mit früheren Berichten übereinstimmt. Chondrozyten am Tag null wiesen minimale Expression von Knorpel-Matrix-Genen auf. Die 3D-Kultur von Chondrozyten mit Chondrozyten-Differenzierungsmedium oder mit Medium, das mit Synovialflüssigkeit ergänzt war, führte zu einer signifikanten Steigerung der Knorpel-Genexpression von Kollagen II, ACAN und MMP13, was auf eine Re-Differenzierung der Chondrozyten hindeutet.

Am Tag 21 führte eine Erhöhung des Synovialflüssigkeitsanteils im Kulturmedium zu vergleichbaren Spiegeln von Knorpel-Matrixmarkern. Die Expression von Kollagen zwei und ANDCAN mRNA in Chondrozyten, die in 100 % Synovialflüssigkeit kultiviert wurden, zeigte sogar eine Abnahme der Expression des knorpelabbauenden Enzyms MMP-13 mRNA im Vergleich zu Zellen, die allein im Kulturmedium gezüchtet wurden. Interessanterweise nahm die Expression des Zelltod-Markers Caspase drei mit steigendem Synovialflüssigkeitsanteil allmählich ab, was darauf hindeutet, dass die Kultivierung in Synovialflüssigkeit zu einer verminderten Apoptose geführt hat.

Daher ist die Kultivierung menschlicher artikulärer Chondrozyten und hoher Konzentrationen von Synovialflüssigkeit in einem dreidimensionalen Umfeld eine machbare Technologie. Sobald die Technik beherrscht ist, könnte die Einbettungstechnik weniger als eine Stunde zum Abschluss benötigen. Sie sollten sicherstellen, dass Sie die Kügelchen gründlich zwischen den Mediumwechseln spülen.

Und außerdem sollten Sie darauf achten, die Perlen beim Gebrauch der Pipette nicht zu beschädigen.