Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Das Massen-Squirm-Protokoll zielt darauf ab, die Lysin-Demethylase-Aktivität unter Verwendung von Isotopenmethylierung zu quantifizieren, und die Maldi-Massenspektrometrie führt zunächst enzymkatalysierte Demethylierungsreaktionen an Peptiden durch, die methyliertes Lysin enthalten. Rückstände methylieren dann chemisch die Peptidprodukte der Demethylase-Reaktion mit deuteriertem Formaldehyd, um gleichmäßig methylierte Peptide herzustellen, die auf die gleiche Weise ionisieren. Maldi fährt mit der Quantifizierung jeder Peptidspezies mit Multi- bis Massenspektrometrie fort und berücksichtigt die Isotopenüberlappung. Um die relativen Mengen von un-Mono-Farbstoff- und Trimm-methylierten Peptiden zu identifizieren, bestimmen die Massen-Squirm-Ergebnisse die relativen Mengen jedes Demethylase-Reaktionsprodukts basierend auf Massenänderungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der routinemäßigen Schimmel-Massenspektrometrie besteht darin, dass der Massenscore Unterschiede in der Ionisation zwischen unterschiedlich methylierten Peptiden berücksichtigt. Die Idee zu diesem Ansatz hatten wir erst, als wir eine Methode zur Messung des Histonacetylierungsgrades mit isotopenreichem Essigsäureanhydrid entwickelten. Die Herausforderung bei dieser Technik besteht darin, Daten über die Peakfläche zu extrahieren, was durch die Überlappung der Peptidisotopenhüllen erschwert werden kann.

Für die Demethylase-Reaktion wurden 125 Nanogramm rekombinantes Lysin-spezifisches Demethylase-Enzym mit 0,25 Mikrogramm biotinyliertem Dimethylhison H-3-Peptid in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern Demethylase-Puffer kombiniert. Bereiten Sie ebenfalls eine Kontrollprobe mit 0,25 Mikrogramm Peptid ohne LSD, ein Enzym, vor, inkubieren Sie die Reaktions- und Kontrollröhrchen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes werden zur Vorbereitung von R zwei 20-Mikron-Porenkügelchen mit gleichen Volumina von Kügelchen und Methanol vermischt.

Geben Sie dann 10 Volumen TFA-Ameisensäure hinzu, fügen Sie jeder Probe acht Mikroliter poröse Kügelchen hinzu und rühren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit zwei C 18 Reißverschlussspitzen konditionieren. Zweimal pipettieren mit 20 Mikrolitern 0,1 % TFA, viermal mit 70 % Acetonitril, 0,1 % TFA und viermal mit 0,1 % TFA.

Laden Sie als Nächstes die beiden Proben auf die konditionierten Zip-Spitzen. Schieben Sie das Volumen mit einer Pipette durch das C 18 Harz. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Gesamtvolumen beider Proben durch die Zip-Spitzen gedrückt wurde.

Waschen Sie dann die Zip-Spitzen zweimal mit 20 Mikrolitern 0,1 % TFA-Eluierungsproben in 40 Mikrolitern Illusionspuffer und trocknen Sie anschließend vollständig mit einem Speed Vac-Konzentrator. Zuerst wird die Probe in 100 Mikrolitern 50 millimolaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert. Fügen Sie dann acht Mikroliter Dimethylamin und 16 Mikroliter minderwertiges Formaldehyd hinzu.

Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie die reduktive Methylierung, indem Sie bohrendes Dimethyllamin und deuteriertes Formaldehyd hinzufügen und zwei Stunden lang inkubieren. Beim dritten Mal bohrendes Dimethyllamin hinzufügen und 15 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.

Reaktion wird mit 12,5 Mikrolitern eines molaren Tris. pH 7,4 abgeschreckt, um mit einem Speed Vac-Konzentrator vollständig zu trocknen. Erste Rese, suspendieren Sie die Kontroll- und Demethylase-Reaktionsproben in 100 Mikrolitern 50 millimolaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4.

Geben Sie nun acht Mikroliter poröse Kügelchen zu den Kontroll- und Demethylase-Reaktionsproben und sammeln Sie sie mit Reißverschlussspitzen, wie zuvor gezeigt. In zwei Mikrolitern Volumen auf eine MALDI-Probenplatte geben und bei Raumtemperatur bis zur Kristallisation trocknen lassen. Fahren Sie mit der Analyse der Proben durch Massenspektrometrie fort.

Öffnen Sie die Spectro-Dateien in der Arbeitssoftware und exportieren Sie sie in die Software M über Z. Weitere Verifizierung von Reaktionsprodukten durch Tandem-Massenspektrometrie. Bestimmen Sie zunächst das Peakflächenverhältnis der Isotope Kohlenstoff 13 C zwei und der Isotope 13 C vier relativ zum Monoisotopen-Peak für die Kontrollprobe.

Verwenden Sie diese berechneten Verhältnisse, um die relative Menge an Peptid zu quantifizieren, die in jeder Modifikation vorhanden ist. Zustand der Demethylase-Reaktionsprobe. Das LSD-Eins-Enzym kann effektiv bei der Massen-Squirm-Quantifizierung der Lysin-Demethylierung eingesetzt werden.

Da die Kontrollreaktion keine reduktive Methylierung erfährt, zeigt sie die typische Isotopenhülle für dieses Peptid an. Die resultierenden Peakbereiche bestimmen die Hintergrundverhältnisse des Peptids, das in Kohlenstoff 13 C zwei und Kohlenstoff 13 C vier vorhanden ist. Isotopenzustände, Peakbereiche aus dem Massenspektrum für die Kontrollreaktion, ermöglichen die Quantifizierung der relativen Menge an Peptid, die in jedem Modifikationszustand vorhanden ist. In der Demethylasereaktion bestimmen die Peakbereiche aus diesen Kontroll- und Demethylasereaktionen 33,7 % Dimethyllysin 4, 42 0,3 % Monomethyllysin vier und 24 % unmethyliertes Lysin vier.

Dieser Mass Squam-Ansatz bietet wichtige Einblicke in das Gebiet der Histon-Epigenetik, z. B. wie die Demethylierung von Histon-Lysin-Resten zu verschiedenen Krankheiten beiträgt. Während dieser Methylierungsassay zur Untersuchung von Demethylasen angewendet wurde, kann er auch zur Untersuchung von Methyltransferasen verwendet werden.