Name: Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Lernen Sie die MassSQUIRM-Methode zur quantitativen Messung von Lysin-Demethylase-Aktivität mittels MALDI-Massenspektrometrie und isotopischer Markierung. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen epigenetischer Modifikationen.

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Wir danken der UAMS Proteomics-Fazilität für die massenspektrometrische Unterstützung. Finanzierung für dieses Projekt wurde durch die NIH Zuschüsse P20RR015569, P20RR016460 und R01DA025755 zur Verfügung gestellt.

Dieses Protokoll wird von Blair et al modifiziert. 6. 1. LSD1 Demethylierung Assay <ol><li> In einem Endvolumen von 20 mL, 125 ng rekombinantem kombiniert mit 0,25 ug LSD1 Di-Methyl-Histon H3-Peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-Biotin) im Demethylase-Puffer (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 5% Glycerin). Darüber hinaus führen Sie eine Peptid allein Kontrolle ohne Enzym. Die Steuerung ist für Abschnitt 3 und braucht keine reduktive Methylierung. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden bei 37 ° C </li><li> Um die Peptide zu sammeln, fügen 8 ul POROS R2 20-Mikron-Perlen zu jeder Probe und agitieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten POROS Perlen durch die Aussetzung ein Volumen von Perlen mit 1 Volumen Methanol, und fügen Sie dann 10 Volumen 5% Ameisensäure / 0,2% TFA. </li><li> Zustand zwei C 18 ZipTips durch Absaugen 20 uL 0,1% TFA in die Spitze und drücken Sie es wieder aus mit einer Pipette. Tun Sie dies zweimal mit 0,1% TFA, viermal mit 70% Acetonitril / 0,1% TFA, und viermal erneut mit 0,1% TFA. </li><li> Legen Sie die zwei Proben (Kontrolle und die Reaktion Demethylase) auf die konditionierte C 18 ZipTips durch Pipettieren die Kügelchenaufschlämmung hinter dem C 18-Harz in den ZipTips und schieben Sie die Lautstärke durch eine Pipette. </li><li> Waschen Sie ZipTips zweimal mit 20 ul 0,1% TFA. </li><li> Man eluiert in 40 ul 70% Acetonitril / 0,1% TFA. </li><li> Lyophilisieren jedes Elutionsmittel vollständig mit einer SpeedVac Konzentrator. </li></ol> 2. Reduktive Methylierung Dieser Teil des Protokolls wird von Blair et al modifiziert. Und Rayment et al. 6,7. <ol><li> Erneut zu suspendieren die Demethylase Reaktion in 100 ul 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. </li><li> Um die Reaktion Demethylase, fügen 8 &amp;mgr; l 15 mg / ml Borandimethylamin. Boran-Dimethylamin in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 gelöst, die 15 mg / ml Stammlösung.Dies sollte frisch zubereitet werden. </li><li> Um die Reaktion Demethylase, fügen Sie 16 ul 250 mM deuteriertem Formaldehyd. Der 250 mm deuteriertem Formaldehyd wird durch Verdünnen der Lager in H 2 0 vorbereitet. Dies sollte frisch zubereitet werden. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2, 2.3 &amp; 2.4. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt 2.2. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für ca. 15 Stunden. </li><li> Zum Demethylase Probe wird mit 12,5 ul 1 M Tris, pH 7,4, um die reduktive Methylierung zu quenchen. </li></ol> 3. MALDI-Massenspektrometrie <ol><li> Fügen Sie POROS R2 20-Mikron-Perlen zum Demethylase Reaktion, und sammeln Sie auf ZipTips wie in den Schritten von 1,3 bis 1,6 beschrieben. </li></ol> Hinweis: Die Re-suspendieren die Kontrolle in 100 ul 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 und zu behandeln, als die andere Probe ab Schritt 3.1. <ol start="2"><li> Eluieren die Kontrolle und Demethylase Reaktion Proben aus den ZipTips auf eine MALDI-Platte mit 2 ul von 33% zu sättigend 2,5-Dihydroxybenzoesäure. Zur Herstellung der 33% 2,5-Dihydroxybenzoesäure, machen Sie eine gesättigte Lösung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure in 70% Acetonitril / 0,1% TFA verdünnt und dann auf 33% in 70% Acetonitril / 0,1% TFA gesättigt. Lassen Sie die eluierten Proben zu trocknen und kristallisieren. </li><li> Sammle Massenspektren mit einem PerkinElmerSciex MALDI-Massenspektrometer oder prOTOF verfügbar hochauflösende MALDI-Massenspektrometer 8,9,10. </li><li> Alle Spektren extrahieren und Peakflächen mit PerkinElmerSciex TOFworks Software oder Software, die vom Massenspektrometer Herstellers. </li><li> Stellen Sie sicher, Reaktionsprodukte von MS 2 mit einem verfügbaren massenspektrometrischen System, das Tandem-Massenspektrometrie-Fähigkeiten. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Um den Isotopen Überlappung mit schweren Formaldehyd (1B) verursacht werden können, bestimmen die Peakfläche (A)-Verhältnis von 13 C 2 und 13 C 4-Isotopen relativee an den monoisotopischen Peak für die Kontrollprobe, die nicht reduktive Methylierung (2A) unterzogen wurde. Gl 1: Ein 13C2 / A 12C = r 1 Gl 2: Ein 13C4 / A 12C = r 2 Dadurch erhalten Sie das Verhältnis von Peptid bestehenden Zustände in diesen Isotopen (r 1 &amp; r 2) spezifisch für Ihr Experiment und Massenspektrometer. </li><li> Mit dem R 1 &amp; R 2-Werte in den folgenden Formeln zur Quantifizierung der relativen Menge an Peptid in den einzelnen Änderungen in der staatlichen Reaktion Demethylase Probe (Abb. 2B): Gl 3: H3K4me2 = A 1 Gleichung 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1) Gleichung 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))] </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Mit LSD1, zeigen wir die Wirksamkeit der MassSQUIRM zur QuantifizierungLysin-Demethylierung. Wie in dem Protokoll Text beschrieben, haben wir eine Demethylase-Assay mit 125 ng von LSD 1 und 0,25 ug Di-Methyl-Histon H3-Peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-Biotin). Die Steuerung und Demethylase Reaktion Proben wurden reduktive Methylierung und MALDI Massenspektrometrie unterzogen. Die Kontroll-Reaktion, die nicht unterzogen wurden reduktive Methylierung zeigten die typische Isotopenverhältnis Umschlag für dieses Peptid und zur Verfügung gestellt Peakflächen für Gleichungen 1 und 2 (Abbildung 2A). Das Massenspektrum für die Reaktion zur Verfügung gestellt Demethylase Peakflächen für Gleichungen 3-5 (Abbildung 2B). Unter Verwendung der Peakflächen von der Steuerung und Demethylase Reaktion haben wir festgestellt, dass das Peptid LSD1 demethyliert, um die folgenden Reaktionsprodukte geben: 33,7% Di-Methyl Lys4, 42,3% mono-Methyl Lys4, und 24% un-methylierter Lys 4. Siehe Blair et al. Für die vollständige Analyse der LSD1 Demethylase sowie Inhibitorstudien 6. Beachten Sie, dass sich ändernden Variablen wie Reaktionszeit, EnzymKonzentrations-und Substrat-Konzentration wird für eine eingehende Analyse der Tätigkeit zu ermöglichen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Abbildung 1. MassSQUIRM Überblick. (A) ein N-terminales Peptid von Histon H3 wird dargestellt als un-(grün), Mono-(rot), oder Di-(blau) an Lysin 4 methyliert. Die Variation in der chemischen Zusammensetzung von jedem Peptid führt zu-Differential-Ionisation machen Quantifizierung komplex. (B) reduktive Methylierung konvertiert alle Lysinreste an den di-methyl Staat, der alle Peptide zu ionisieren, ähnlich verursacht. Die Verwendung von schweren Formaldehyd in der reduktiven Methylierung ermöglicht die Beibehaltung der Identität des ursprünglichen Methylierung. Offene Kreise zeigen Licht-Methylierung während geschlossene Kreise schweren Methylierung zeigen. Geändert von Blair et al. 2011 6. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figure 2. MassSQUIRM kann verwendet werden, um differentiell methylierte Peptide zu quantifizieren. (A)-A-di-methylierten synthetischen Histon H3-Peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-Biotin) wurde unter Verwendung der Massenspektrometrie und Peak-Verhältnisse relativ zu dem monoisotopischen Peaks wurden als r 1 und r 2 in den Gleichungen 1 und 2 angegeben. (B) Das gleiche synthetische Peptid wurde mit 125 ng LSD1 in Demethylase Puffer für zwei Stunden bei 37 ° C inkubiert Die Proben wurden dann einer Analyse MassSQUIRM. Eine gemischte Bevölkerung von überlappenden Peaks stellt drei unterschiedliche Methylierung Zustände wie in 1B gesehen. Bereiche, die unter monoisotopischen Peaks wurden als A 1, A 2 und A 3 notiert haben. Die Peakflächen wurden in den Gleichungen 3-5 hatten. Offene Kreise zeigen Licht-Methylierung während geschlossene Kreise schweren Methylierung zeigen. Geändert von Blair et al. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

MassSQUIRM ist eine preisgünstige und quantitative Methode zur umfassenden Analyse der Aktivität von Lysin Demethylasen in Mono-und Di-Methylierung beteiligt. MassSQUIRM bietet nicht nur die Quantifizierung des Produkts der Reaktion, sondern auch für die Zwischenprodukte. Dieser Test kann als ein mächtiges Werkzeug bei der Untersuchung des Mechanismus von LSD 1 und andere Histondemethylasen verwendet werden. Es sind auch nützlich für die Klassifizierung wie die neu entdeckten Lysin Demethylase Enzyme wie PHF8 und könnte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-Biotin-Peptid </td><td> hergestellt im Haus </td><td> keiner </td></tr><tr><td> POROS R2 20-Mikron-Perlen </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Fischer </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-Dihydroxybenzoesäure </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borandimethylamin </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopisch schwere d 2-Formaldehyd- </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fischer </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fischer </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fischer </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fischer </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-Phosphat </td><td> Fischer </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrator </td><td> Gelehrter </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-Massenspektrometer und prOTOF TOFworks Software </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> keiner </td></tr></tbody></table>

die anwendung des masssquirm für quantitative messungen von lysin-demethylase

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

In jüngster Zeit haben epigenetische Regulatoren als wichtige Akteure in vielen verschiedenen Krankheiten 3.1 entdeckt worden. Als ein Ergebnis sind diese Enzyme Hauptziele für kleine Moleküle Studien und Entwicklung von Arzneimitteln 4. Viele epigenetische Regulatoren haben erst vor kurzem entdeckt und sind noch im Gange klassifiziert. Unter diesen Enzymen sind Lysin Demethylasen die Methylgruppen von Lysine an Histonen und andere Proteine ​​zu entfernen. Durch die neuartige Charakter dieser Klasse von Enzymen, haben einige Tests entwickelt worden, um ihre Aktivität zu studieren. Dies war eine Straßensperre sowohl die Einstufung und hohem Durchsatz Studie Histondemethylasen. Derzeit existieren nur sehr wenige Demethylase Assays. Diejenigen, die es gibt, sind in der Regel in der Natur qualitativen und können nicht gleichzeitig zwischen den verschiedenen Lysin Methylierungszustände zu erkennen (un-, mono-, di und tri-). Die Massenspektrometrie wird häufig verwendet, um Demethylase-Aktivität zu bestimmen, aber die aktuellen massenspektrometrischen Assays tunnicht ansprechen, ob differentiell methylierte Peptide anders zu ionisieren. Differential-Ionisation von Peptiden methylierte macht den Vergleich Methylierung Staaten schwierig und schon gar nicht quantitativ (Abbildung 1A). So verfügbaren Assays sind nicht für die umfassende Analyse der Demethylase optimiert. Hier beschreiben wir ein Verfahren genannt MassSQUIRM (massenspektrometrische Quantifizierung unter Verwendung Isotopen reduktive Methylierung), die auf der reduktiven Methylierung Amingruppen mit deuteriertem Formaldehyd zu erzwingen, Lysine sein di-methylierten basiert, sodass sie im wesentlichen die gleichen chemischen Spezies und daher ionisieren gleichen (Abbildung 1B). Die einzige chemische Unterschied nach der reduktiven Methylierung ist Wasserstoff und Deuterium, die keinen Einfluss auf MALDI-Ionisierung Wirkungsgrade. Die MassSQUIRM Nachweis ist spezifisch für Demethylase Reaktionsprodukte mit un-, mono-oder di-methylierte Lysine. Der Assay ist auch anwendbar auf Lysin-Methyltransferasen geben die saIch Reaktionsprodukte. Wir verwenden hier eine Kombination aus der reduktiven Methylierung Chemie und MALDI-Massenspektrometrie, um die Aktivität von LSD 1 zu messen, eine Lysin-Demethylase entfernen kann di-und mono-Methylgruppen, einem synthetischen Peptid Substrat 5. Dieser Assay ist einfach und leicht zugänglich einem der Labor mit Zugang zu einem MALDI-Massenspektrometer im Labor oder durch eine Proteomik-Anlage. Der Test hat ~ 8-fach dynamischen Bereich und ist leicht skalierbar, um Platten-Format 5.

Wir stellen eine Methode für die Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie und reduktive Methylierung Chemie auf Veränderungen in Lysinmethylierung quantifizieren.

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

In jüngster Zeit wurden epigenetische Regulatoren als Schlüsselakteure bei vielen verschiedenen Erkrankungen entdeckt 1-3. Infolgedessen stellen diese Enzyme primäre Zielstrukturen für kleine ...

Das Mass-Squirm-Protokoll zielt darauf ab, die Aktivität von Lysin-Demethylasen mittels isotopischer Methylierung und MALDI-Massenspektrometrie zu quantifizieren. Führen Sie zunächst enzymatisch katalysierte Demethylierungsreaktionen an Peptiden mit methyliertem Lysin durch. Anschließend methylieren Sie die Peptidprodukte der Demethylase-Reaktion chemisch mit deuteriertem Formaldehyd, um einheitlich methylierte Peptide zu erhalten, die in der MALDI-Ionisation gleichartig ionisieren. Danach quantifizieren Sie jede Peptidart mittels Massenspektrometrie und berücksichtigen dabei isotopische Überlappungen. Um die relativen Mengen an un-, mono-, di- und trimethylierten Peptiden zu identifizieren, bestimmt die Mass-Squirm-Analyse die relativen Anteile jedes Demethylase-Reaktionsprodukts anhand von Massenänderungen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der routinemäßigen Massenspektrometrie liegt darin, dass die Massenbewertung Unterschiede in der Ionisierung zwischen unterschiedlich methylierten Peptiden berücksichtigt. Die Idee zu diesem Ansatz entstand ursprünglich, als wir eine Methode zur Messung von Histon-Acetylierungsgraden unter Verwendung isotopisch schwerer Essigsäureanhydrid entwickelten. Die Herausforderung bei dieser Technik besteht in der Extraktion der Peakflächenwerte, was durch die Überlappung der isotopischen Hüllen der Peptide erschwert werden kann.Für die Demethylase-Reaktion wurden 125 Nanogramm rekombinantes lysinspezifisches Demethylase-Enzym Typ eins mit 0,25 Mikrogramm biotinyliertem dimethyliertem Histon-H3-Peptid in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern Demethylase-Puffer kombiniert. Bereiten Sie außerdem eine Kontrollprobe mit 0,25 Mikrogramm Peptid ohne das LSD1-Enzym vor und inkubieren Sie die Reaktions- und Kontrollröhrchen zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Als Nächstes mischen Sie zur Herstellung von R2 20-Mikrometer-Porösen Kügelchen gleiche Volumina Kügelchen und Methanol.Anschließend 10 Volumina Trifluoressigsäure-Formiat hinzufügen, acht Mikroliter poröser Kügelchen zu jeder Probe geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. In der Zwischenzeit zwei C18-ZipTips konditionieren, indem zweimal mit 20 Mikrolitern 0,1 %iger TFA, viermal mit 70 %igem Acetonitril in 0,1 %iger TFA und erneut viermal mit 0,1 %iger TFA pipettiert wird.Als Nächstes laden Sie die beiden Proben auf die konditionierten ZipTips auf. Drücken Sie das Volumen mit einer Pipette durch das C 18-Harz. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gesamtvolumen beider Proben durch die ZipTips gedrückt wurde.Anschließend die Zip-Spitzen zweimal mit 20 Mikrolitern 0,1 %iger TFA waschen, die Proben in 40 Mikrolitern Illusionspuffer eluieren und vollständig mit einem Speed-Vac-Konzentrator trocknen. Zunächst die Probe in 100 Mikrolitern 50 Millimolar Phosphatpuffer, pH 7,4, resuspendieren. Danach acht Mikroliter Bor-dimethylamin und 16 Mikroliter verdünntes Formaldehyd hinzufügen.Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Wiederholen Sie die reduktive Methylierung durch Zugabe von unmarkiertem Dimethylamin und deuteriertem Formaldehyd und inkubieren Sie für zwei Stunden. Beim dritten Mal fügen Sie unmarkiertes Dimethylamin hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für 15 Stunden.Stoppen Sie die Reaktion mit 12,5 Mikrolitern eines einmolar Tris-Puffers, pH 7,4, und trocknen Sie die Probe vollständig in einem Vakuum-Konzentrator. Resuspendieren Sie zunächst die Kontroll- und Demythylase-Reaktionsproben in 100 Mikrolitern eines 50 Millimolar Phosphatpuffers, pH 7,4.Jetzt acht Mikroliter poröse Kügelchen zu den Kontroll- und Demethylase-Reaktionsproben hinzufügen und wie zuvor gezeigt auf Zip-Tips sammeln. Mit zwei Mikroliter-Volumina eluieren und auf einer MALDI-Probenplatte bei Raumtemperatur zur Kristallisation trocknen lassen. Danach die Proben mittels Massenspektrometrie analysieren.Öffnen Sie die Spektrodateien in der Arbeitssoftware und exportieren Sie sie in die M/z-Software. Überprüfen Sie die Reaktionsprodukte anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie. Bestimmen Sie zunächst das Peakflächenverhältnis der Kohlenstoff-13C2- und Kohlenstoff-13C4-Isotope relativ zum monoisotopischen Peak der Kontrollprobe.Verwenden Sie diese berechneten Verhältnisse, um die relative Menge an Peptid in jeder Modifikationsform zu quantifizieren, die im Demethylase-Reaktionsansatz vorliegt. Das Enzym LSD1 kann effektiv in der Massenspektrometrie zur Quantifizierung der Lysin-Demethylierung eingesetzt werden.Da die Kontrollreaktion keine reduktive Methylierung durchläuft, zeigt sie das typische isotopische Muster für dieses Peptid. Die resultierenden Peakflächen bestimmen die Hintergrundverhältnisse des Peptids in den Isotopenzuständen Kohlenstoff-13C₂ und Kohlenstoff-13C₄. Die Isotopenzustände sowie die Peakflächen aus dem Massenspektrum der Kontrollreaktion ermöglichen die Quantifizierung der relativen Menge des Peptids in jedem Modifikationszustand. In der Demethylase-Reaktion ergeben die Peakflächen aus diesen Kontroll- und Demethylase-Reaktionen 33,7 % dimethyliertes Lysin 4, 42,0 % monomethyliertes Lysin 4 und 24 % unmethyliertes Lysin 4.Dieser Massensquam-Ansatz liefert wichtige Erkenntnisse für das Gebiet der histonbezogenen Epigenetik, beispielsweise darüber, wie die Demethylierung von Histon-Lysinresten zu verschiedenen Erkrankungen beiträgt. Obwohl dieses Methylierungs-Assay zur Untersuchung von Demethylasen eingesetzt wurde, kann es auch zur Untersuchung von Methyltransferasen verwendet werden.

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Biologie

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