High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Pflanzen, die mit Wurzelgallennematoden befallen sind, zu untersuchen. Züchten Sie zunächst gesunde Keimlinge in sandigem Boden oder Wachstumstaschen. Erzeugen Sie anschließend ein Inokulum stark infizierter juveniler Stadien zweiter Ordnung von Wurzelgallennematoden.

Dann die Sämlinge ordnungsgemäß impfen und infizieren. Schließlich die Entwicklung von Nematoden-Eimassen am Wurzelsystem des Wirts bewerten. Wir werden einen Hochdurchsatz- und Niedrigdurchsatz-Screening von Pflanzen mit Wurzeln, nicht mit Nematoden, demonstrieren.

Die wichtigsten Vorteile des Hochdurchsatzsystems sind der geringe Platzbedarf für das Pflanzenwachstum und die einfache Beurteilung der Infektion. Diese Ansätze führen daher zu einer reproduzierbaren und einheitlichen Infektion der Pflanzenwurzeln mit Nematoden und ermöglichen eine bessere Bewertung des Wirtstatus der Pflanze. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Beurteilung von Pflanzen mit Wurzeln im Zusammenhang mit Nematoden sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht das geeignete Entwicklungsstadium verwenden, um die Wurzeln mit Nematoden zu infizieren.

Sowie durch die Verwendung mehrere Tage alter infektiöser juveniler Stadien, die typischerweise eine geringe Infektiosität aufweisen. Den Ablauf wird Hug Up Atian, Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Ich werde das Verfahren zur Untersuchung in Wachstumstaschen für Topfversuche vorführen. Pflanzen Sie Tomatensamen in einen einzelnen Topf mit humusreichem Boden, wie beispielsweise Sunshine Mix, und halten Sie im Gewächshaus nach der Keimung eine Temperatur von 22 bis 28 Grad Celsius ein.

Einmal wöchentlich mit Miracle-Gro düngen, etwa zwei Wochen nach der Keimung. Im Stadium der zwei echten Blätter einzelne Sämlinge in Töpfe mit sterilisierter sandiger Erde (90 % Sand und 10 % organischer Stoff) umtopfen. Osmocote-Flüssigdünger mit langsamer Freisetzung hinzufügen und zwei Wochen lang in einem Gewächshaus bei 22 bis 28 Grad Celsius kultivieren. Fortlaufend einmal wöchentlich mit Miracle-Gro düngen.

Für Hochdurchsatz-Screenings säen Sie Pflanzensamen direkt in Schalen mit sandigem Boden. Bedecken Sie die Schalen mit Plastikfolie bis zur Keimung und pflegen Sie sie wie zuvor beschrieben. Nach der Keimung fügen Sie Osmocote Langzeitdünger hinzu und düngen wöchentlich mit Miracle-Gro. Keimen Sie Samen in einer mit mehreren Lagen Kim-Wipe-Papier ausgelegten Petrischale in einem Inkubator bei 25 bis 28 Grad Celsius, und überführen Sie anschließend die Keimlinge in einzelne Beutel.

Alternativ die Samen in die Papiernut legen, um sie direkt in einzelnen Beuteln keimen zu lassen. Die Beutel in einem Plastikhängemappenordner pro Ordner platzieren und die Ordner auf einem Gestell in senkrechter Position anordnen.

Stellen Sie den Rack in eine kontrollierte Umgebungskammer, die bei einer Temperatur von 25 bis 28 Grad Celsius und 16 Stunden Licht gehalten wird. Achten Sie auf einen 8-stündigen Dunkelzyklus und bewässern Sie die Beutel ein- oder zweimal täglich mit umgekehrt osmotischem Wasser, etwa 10 bis 14 Tage nach der Aussaat. Sobald ein ausreichend entwickeltes Wurzelsystem mit Wurzelspitzen der dritten Ordnung vorhanden ist, sind die Keimlinge bereit für die Inokulation. Vor Beginn der Ei-Extraktion waschen Sie den Arbeitsbereich und alle Werkzeuge gründlich mit heißem Wasser, um Kontaminationen zu vermeiden.

Stellen Sie einen Eimer in ein Waschbecken, um die Lösung aufzufangen, und platzieren Sie eine Drahtgitterablage darüber. Stapeln Sie drei Siebe von oben nach unten in abnehmender Porengröße, sodass die Eier im 25-Mikron-Sieb gesammelt werden. Schneiden Sie die Spitzen der befallenen Pflanzen ab und entsorgen Sie sie sorgfältig.

Entfernen Sie die Pflanze aus dem Topf und waschen Sie die Wurzeln, indem Sie sie in einen vollen Plastikeimer mit Wasser tauchen. Spülen Sie die Wurzeln anschließend weiter unter fließendem Wasser, bis die Bodenpartikel entfernt sind. Danach gewinnen Sie Eier des Wurzelknollen-Nematoden aus befallenen Tomatenwurzeln.

Schneiden Sie zunächst die Wurzeln mit einer Schere in kleine Stücke, wobei die Pfahlwurzel entfernt wird. Geben Sie die gehackten Wurzeln einer einzelnen Pflanze in ein großes Plastikgefäß mit Deckel und fügen Sie gerade so viel 10 %ige Bleichlösung hinzu, dass die Wurzeln bedeckt sind. Schließen Sie den Deckel und schütteln Sie das Gefäß zwei Minuten lang.

Öffnen Sie das Gefäß und gießen Sie die Wurzeln auf das obere Sieb. Spülen Sie sie gründlich mit einem Schlauch, der an eine Sprühdüse angeschlossen ist, bis der gesamte Geruch von Bleiche verschwunden ist. Benutzen Sie einen Gummihammer, um die Seiten der Siebe zu bearbeiten, um ein Verstopfen der Siebe zu vermeiden.

Pausieren, das obere Sieb entfernen und die Rückstände abspülen. Und das zweite Sieb. Das zweite Sieb entfernen und die feinen Rückstände sammeln, wozu die Eier aus dem letzten Sieb mit einem sanften Wasserstrahl aus einer Wasserflasche abgespült werden.

Bewegen Sie die Rückstände auf eine Seite des Siebs. Sammeln Sie die Rückstände und Eier mit einer geringstmöglichen Menge Wasser in einem sauberen Becher. Führen Sie das im Eimer gesammelte Wasser durch das 25-Mikron-Sieb, um eventuell entgangene Eier einzufangen.

Gründlich mit Wasser spülen und im selben Becher auffangen. Einen sauberen Metallkorb mit mehreren Lagen Kimwischpapier auskleiden. Abwischen und auf eine Glaspetrischale setzen, wobei zwischen dem Boden des Korbs und der Schale ein Abstand von einem Zentimeter verbleibt.

Geben Sie die extrahierten Nematodeneier auf das Papier in dem Drahtkorb. Fügen Sie so viel Flüssigkeit hinzu, dass der Boden des Drahtkorbs die Wasseroberfläche berührt, aber nicht im Wasser eingetaucht ist.

Decken Sie die Oberseite jeden Tag mit einem Plastikdeckel ab. Prüfen Sie auf Wasserverdunstung und geben Sie etwas Wasser in die Petrischale, sodass der Boden des Korbs das Wasser berührt. Um zu verhindern, dass die Eier alle zwei Tage über einen Zeitraum von sechs bis acht Tagen austrocknen, sammeln Sie das Wasser, das die juvenilen Larven des zweiten Stadiums oder J-Zweien aus der Petrischale enthält, in einem Becher auf.

Falls nicht sofort verwendet, das gesammelte Inokulum umgehend bei Raumtemperatur mit einer Laborluftversorgung oder Luft aus einer Aquarienpumpe belüften. Beginnen Sie mit dem nächsten Schritt, indem Sie das Inokulum auf einem magnetischen Rührer bei niedriger Drehzahl umrühren. Verwenden Sie drei Aliquots der gesammelten Nematoden.

Zur Bestimmung der Anzahl der J-Zweier in der Abrechnung. Rutschen- oder Schälchenmethode anwenden, den Durchschnitt berechnen und das gewünschte Inokulationsvolumen ermitteln. Dies sind J-Zweier, wie sie unter dem Mikroskop sichtbar sind.

Üblicherweise werden 3000 J-Zweien pro Pflanze in Töpfen und 500 J-Zweien für in Sämlingsgefäßen kultivierte Pflanzen verwendet. Stellen Sie vor der Inokulation der Pflanzen sicher, dass der Boden feucht, aber nicht zu nass ist. Für die Inokulation im Topf werden drei Löcher von etwa der halben Topftiefe in dem Sand um jedes Tomatenwurzelsystem angelegt.

Bepflanzen Sie jede Pflanze mit einem Bleistift, indem Sie die J-Zweien mit einer Pipette in die drei Löcher einbringen. Danach decken Sie die Löcher für die Hochdurchsatz-Screens in Schalen ab. Verwenden Sie eine modifizierte, versiegelte Nadelspitze mit seitlichen Löchern, die an eine fünf Milliliter umfassende Pipette geklebt ist.

Pipettieren Sie entlang einer Pipettenspitze, um die J-Zweien in den Boden zu bringen. Pflegen Sie die Pflanzen sechs bis acht Wochen lang in einem Gewächshaus bei 24 bis 27 Grad Celsius. Düngen Sie weiterhin zweimal pro Monat mit Miracle-Gro.

Zur Beurteilung der Infektion. Schneiden Sie die Pflanzenspitzen ab und entfernen Sie die Pflanzen vorsichtig aus den Töpfen, anschließend waschen Sie die Wurzeln. Färben Sie dann die Eimassen blau, indem Sie die Wurzeln in eine Lösung von einem Milligramm pro Liter eintauchen.

Belüften Sie 15 Minuten lang. Spülen Sie die Wurzeln mit Wasser ab und bewerten Sie, indem Sie die gefärbten Eimassen an einzelnen Wurzelsystemen zählen. Eine beleuchtete Stereolupe kann verwendet werden, um die Eimassen besser sichtbar zu machen, die Nematoden zu zählen, das Inokulum aufzubereiten und wie zuvor beschrieben auf einer magnetischen Rührplatte zu rühren.

Entfernen Sie die Beutel aus den Hängemappen und legen Sie sie auf eine horizontale Fläche. Inokulieren Sie jeden Beutel mit 1.500 J2-Stadien in fünf Millilitern. Heben Sie die Kunststoffabdeckung des Beutels an und verteilen Sie die Nematoden gleichmäßig über die Wurzeloberfläche.

Halten Sie die Beutel 24 Stunden nach der Inokulation in horizontaler Position unter abgedeckt mit dunklem Papier, um Licht auszuschließen. Danach bringen Sie die Beutel in die hängenden Ordner in der Wachstumskammer zurück und versorgen Sie sie mit Wasser. Die Pflanzen müssen ein- oder zweimal täglich für etwa drei Tage mit einer halbstarken Hoagland-Lösung versorgt werden, bis eine Reaktion auf den Dünger beobachtet wird.

Typischerweise verstärkte Blattvergrünung und kräftigerer Triebwuchs. Nach drei Tagen die Taschen mit Wasser feucht halten. Ungefähr 30 Tage nach der Inokulation jede Tasche mit etwa 10 bis 20 Milliliter 75 Milligramm pro Liter infundieren.

Überflutendes Beschichten. Die Beutel über Nacht in horizontaler Position mit der Farblösung überflutet halten. Am nächsten Tag die Beutel entleeren und die Wurzelsysteme auswerten, indem die Eimassen unter einer beleuchteten Schreibtischunterlage gezählt werden.

Im Vergrößerungsansicht sind hier die Wurzeln einer stark befallenen Tomatenpflanze mit den weit verbreiteten Eimassen zu sehen, die blau angefärbt sind. Die Verwendung von Schalen ermöglicht die Untersuchung von Hunderten von Pflanzen in einem kleinen Anbauvolumen. Wachstumstaschen erlauben außerdem eine schnelle und ausreichende, nicht-destruktive Beurteilung der Wurzeln, ohne dass eine Wurzelreinigung erforderlich ist, um Nematodenbefall festzustellen.

Diese Methode ermöglicht auch das Hochdurchsatz-Screening von Tausenden von Pflanzen in einem kleinen Wachstumsraum. Hier zeigt das Wurzelsystem einer in einer Hülle gezogenen Kuh P-Pflanze blau angefärbte Eimassen nach Inokulation. Der Zeitpunkt der Infektion ist für Pflanzenassays mit Nematoden sehr kritisch.

So kann eine Verzögerung der Infektion bereits um wenige Tage zu sehr geringen Infektionsgraden führen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Pflanzen mit Wurzelknollen-Nematoden infiziert und bewertet werden. Vergessen Sie nicht, dass Wurzeln, die mit Nematoden infiziert sind, sachgemäß behandelt werden müssen.

Das Autoklavieren der Wurzeln vor der Entsorgung begrenzt die Ausbreitung des Nematoden. Außerdem ist Vorsicht bei der Verwendung von Glyphosat in hohen Dosen geboten, da es krebserregend ist.

Daher müssen Sie Handschuhe tragen, sowohl beim Umgang mit Wurzeln, die mit dieser Chemikalie infiziert sind, als auch bei der Zubereitung dieser Chemikalie.