Name: High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp. /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Lernen Sie Hoch- und Niedrigdurchsatz-Screenings von Pflanzen mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp. Diese Methoden ermöglichen reproduzierbare Infektionen und unterstützen Züchtungsprogramme für resistente Sorten.

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Research in Kaloshian Labor wird durch einen Zuschuss aus United States National Institute of Food and Agriculture (2007-35607-17765) gefördert. Forschung im Labor Roberts wird durch Zuschüsse aus United States Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 und EDH-A-00-07-00005) und der California Dry Bean Beirat finanziert.

1. Tomato Sämlingswachstum in Töpfe und Schalen <ol><li> Für Topf-Assays, Pflanzen Tomatensamen in einem Topf in einem organisch-reichen Boden wie Sunshine Mix. Pflegen Sie in einem Gewächshaus bei 22-28 ° C. Nach der Keimung, einmal in der Woche düngen mit Miracle-Gro. </li><li> Etwa zwei Wochen nach der Keimung, bei der zwei wahre-Blatt-Stadium, die Sämlinge einzeln in Töpfe (10 cm Durchmesser und 17 cm tief) mit sterilem Sandboden mit 90% Sand und 10% Bio-Mischung gefüllt. Fügen Sie Osmocote Langzeitdünger und pflegen in einem Gewächshaus bei 22-28 ° C für zwei Wochen. Weiter zum Pflanzen einmal pro Woche mit Miracle-Gro befruchten. </li><li> Für High-Throughput-Screens, Pflanzensamen direkt in Schalen auf sandigem Boden, bedecken Sie das Fach mit Klarsichtfolie bis zur Keimung und zu pflegen wie oben. Nach der Keimung, fügen Osmocote Langzeitdünger düngen und einmal pro Woche mit Miracle-Gro. </li></ol> 2. Cowpea Wachstum in Sämling Beutel <ol><li> Seeds werden entweder in einer Petrischale keimten, gefüttert mit mehreren Lagen Kimwipe Papier, übertragen und einzeln an Beuteln oder direkt in das Papier Nut der Beutel platziert und zum Keimen gebracht. </li><li> Legen Sie die Beutel in einer Kunststoff-hängenden Aktenordner, zwei pro Ordner, und ordnen Sie die Ordner in einem Rack in einer senkrechten Position. Legen Sie die Ablage in einer Klimakammer oder bei einer Temperatur von 25-28 ° C und 16 h Licht / 8 h Dunkel-Zyklus gehalten. Racks können auch in einem Gewächshaus gehalten werden, sondern erfordern eine Folie oder steifem Papier Abdeckung über dem Regal auf beiden Seiten der Pflanzenstängel platziert, um Potenzial für Pilzbefall zu reduzieren. </li><li> Wasser die Beutel ein-oder zweimal pro Tag mit Umkehrosmose-Wasser. Etwa 10 bis 14 Tage nach der Aussaat, wenn eine ausreichende Wurzelsystem mit tertiären Wurzelspitzen entwickelt hat (Abbildung 1), sind die Setzlinge bereit für die Impfung. </li></ol> 3. Extraktion von Nematodeneiern Extraktion von EGGS aus infizierten Wurzeln wird aus einem Protokoll, das von Hussey und Barker (1973) entwickelt, modifiziert. <ol><li> Drei bis vier Tage vor Nematoden Inokulation extrahieren Wurzel-Nematode Eier aus infizierten Tomaten Wurzeln. Vor Beginn der Extraktion Ei, waschen Sie die Arbeitsfläche gründlich mit heißem Wasser, um eine Kontamination zu vermeiden. Auch in heißem Wasser waschen ein Mixer, zwei Eimer, ein Drahtgeflecht-Unterstützung, ein Gummihammer, drei Siebe von 425, 90 und 25 um Apertur, ein Messzylinder und eine Schere. </li><li> Stapeln Sie die Siebe von oben nach unten in folgender Reihenfolge: 425, 90 und 25 um Apertur. Die Eier werden auf der 25 um Sieb am Boden gesammelt werden. Setze die Siebe auf einem Drahtnetz in einem Spülbecken unterstützt. Setzen Sie einen Eimer unter das Drahtgeflecht um die Durchlauf-Lösung sammeln. </li><li> Schneiden Sie die Spitzen der infizierten Pflanze (n), als Quelle des Inokulum verwendet, und entsorgen. Entfernen Sie vorsichtig die Pflanze aus dem Topf. Waschen Sie die Wurzeln durch Eintauchen in eine Kunststoff-Eimer voll Wasser. Spülen Sie die Wurzeln weiter laufen unterNing Wasser, bis die Bodenteilchen von den Wurzeln gewaschen werden. </li><li> Schneiden Sie die Wurzeln mit einer Schere in kleine Stücke. Entsorgen Sie die Pfahlwurzel. </li><li> Legen Sie die gehackte Wurzeln, aus einer einzigen Pflanze in einem großen Kunststoffbehälter mit Deckel, gerade genug, fügen Sie 10% Bleichmittel, um die Wurzeln bedecken und den Deckel schließen. </li><li> Schütteln Sie das Glas mit den Wurzeln für 2 min. </li><li> Öffnen Sie das Glas gießen und die Wurzeln auf das obere Sieb waschen und mit einem Schlauch an einem Vernebelungsdüse. Gut waschen, bis das gesamte Bleichmittel Geruch ist verschwunden. Verwenden Sie einen Hammer, um die Seiten der Siebe tippen, um eine Verstopfung des Siebes Poren. </li><li> Entfernen Sie die obere Sieb und spülen Sie die Trümmer auf dem zweiten Sieb. </li><li> Entfernen Sie die zweite Sieb und sammeln die feinen Schmutz, der die Eier, aus dem letzten Sieb umfasst. Mit einem sanften Strahl aus einer Flasche Wasser, bewegen Sie den Schutt auf eine Seite des Siebes. Sammeln Sie die Trümmer und Eier in ein sauberes Becherglas mit möglichst wenig Wasser. </li><li> Sieb wieder das Wasser in das gesammelteEimer über den 25 um-Sieb, um alle Eier, die freigesetzt wurden zu sammeln. Gründlich mit Wasser und sammeln im selben Becher. </li><li> Entsorgen Sie die Pflanzenreste aus dem oberen Sieb und waschen Sie gründlich alle drei Siebe mit Druckwasser. Berühren Sie nicht die Mesh-Teil der Siebe, da es die Porengröße kann verzerren. </li></ol> 4. Hatching Nematodeneiern <ol><li> Linie eine saubere Metall-Korb mit ein paar Lagen Papier Kimwipe und passen auf eine Glas-Petrischale. Willkommen einer 1-cm Abstand zwischen dem Boden des Korbes und der Schüssel. </li><li> Gießen Sie die extrahierten Nematoden Eier auf das Papier in den Drahtkorb. In genug Flüssigkeit, so daß der Boden der Drahtkorb die Wasseroberfläche berührt, jedoch nicht in Wasser eingetaucht. Decken Sie die Oberseite mit einem Plastikdeckel. </li><li> Jeden Tag zur Wasserverdampfung zu überprüfen und etwas Wasser in der Petrischale, so dass der Boden des Korbes das Wasser berührt. Dadurch werden die Eier vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Jeden zweiten Tag, sammeln das water, die die J2S aus den Petrischalen in einen Becher enthält. Wenn nicht sofort verwendet wird, belüften den gesammelten Inokulum bei Raumtemperatur mit Hilfe eines Labor Luftzufuhr oder Luft durch ein Aquarium Pumpe erzeugt. Verwenden Sie den belüfteten Inokulum innerhalb von 2 Tagen. J2S kann aus dem Schlüpfen bis über einen Zeitraum von 6-8 Tagen gesetzt gesammelt werden. </li></ol> 5. Tomato Wurzelinfektion in Töpfe oder Schalen und Auswertung der Infektion <ol><li> Verwenden drei Aliquots der gesammelten Nematoden, die Anzahl der in einem J2S Zählen Folie oder Schale zu zählen, der Mittelwert zu bestimmen, und das gewünschte Volumen zur Inokulation verwendet. Typischerweise 3000 J2S sind pro Pflanze in Töpfen und 500 J2S für Pflanzen in Sämling Tabletts gewöhnt. </li><li> Rühren Sie das Inokulum auf einer Magnetrührplatte bei niedrigen Drehzahlen. </li><li> Bevor Sie die Pflanzen impfen, stellen Sie sicher, dass der Boden feucht, aber nicht zu nass ist. Für Topf Impfung, machen drei Löcher von etwa einem halben Pot-Tiefe im Sand um jede Tomate Wurzelsystem mit einem Bleistift (Abbildung 2 </strong&gt;). Beimpfen jede Pflanze durch Auslieferung der J2S in die drei Löcher mit einer Pipette. Danach decken Sie die Löcher. </li><li> Für die High-Throughput-Screens in Trays, verwenden eine modifizierte versiegelten Spitze Nadel mit Löchern an den Seiten geklebt, um eine 5-ml-Pipettenspitze entlang einer Pipette (Abbildung 3), um die J2S in den Boden zu liefern. Alternativ kann Nematoden nach Schritt 5.3 verschickt werden. </li><li> Pflegen Sie die Pflanzen in einem Gewächshaus bei 24-27 ° C für 6-8 Wochen. Weiter zu befruchten zweimal im Monat mit Miracle-Gro. </li><li> Für die Auswertung der Infektion, entfernen Sie vorsichtig die Pflanzen aus den Töpfen und waschen Sie die Wurzeln (wie in Schritt 3.3 beschrieben). </li><li> Färben die Eier blau Massen durch Eintauchen der Wurzeln in der 1 mg / L Erioglaucin, für 15 min. </li><li> Spülen Sie die Wurzeln in Wasser und evaluieren durch Zählen der gefärbten Eier Massen auf einzelne Wurzelsystem. Ein beleuchteter Schreibtisch Lupe kann zur besseren Visualisierung der Eigelege werden. </li><li> Wenn die gerasterten Pflanzen werden für die weitere g nötigenetic Studien, nicht schneiden die Spitzen vor dem Waschen die Wurzeln für die Bewertung. Nach der Färbung und Zählung der Eigelege, die Sämlinge in organischen Böden, die Spitzen zu beschneiden, um die Transpiration stark zu reduzieren, und in einem Gewächshaus zu halten. </li></ol> 6. Cowpea Wurzelinfektion in Beutel und Auswertung der Infektion <ol><li> Zählen Sie die Nematoden Inokulum und rühren auf einer Magnetrührplatte wie oben beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die Beutel aus den Hängemappen und Ort auf einer horizontalen Fläche. Beimpfen jedem Beutel mit 1500 J2S in 5 ml. Heben Sie die Plastikabdeckung der Tasche und verteilen Sie die Nematoden gleichmäßig über die Oberfläche der Wurzeln. </li><li> Halten Sie die Beutel in einer horizontalen Position für 24 h nach der Inokulation mit dunklem Papier überzogen, um Licht auszuschließen, dann zu den Hängemappen in der Klimakammer zurückzukehren. </li><li> Wasser die Pflanzen je nach Bedarf einmal oder zweimal täglich, mit halber Stärke Hoagland-Lösung (Hoagland &amp; Arnon, 1950; Tabelle 1 </strong&gt;), bis eine Reaktion auf den Dünger beobachtet wird, in der Regel erhöhte Laub Begrünung und kräftiger Sprosswachstum. Normalerweise werden die Pflanzen mit halber Stärke Hoagland 3 Tage in Folge abgeschwächt. Danach halten die Beutel mit Wasser feucht. </li><li> Etwa 30 Tage (Spanne 28-35 Tage) nach der Impfung, ziehen jeden Beutel mit ca. 10-20 ml 75 mg / L Erioglaucin. Halten der Beutel mit dem Farbstoff in einer horizontalen Position über Nacht geflutet. </li><li> Lassen Sie die Beutel und bewerten die Wurzelsysteme durch Zählung der Eigelege unter einem beleuchteten Schreibtisch Lupe. </li><li> Wenn die Pflanzen abgeschirmt für weitere genetische Untersuchungen oder züchterische Arbeit benötigt werden, ziehen Sie vorsichtig die Wurzeln aus der Papier-, Transplantations in organischen Boden in Töpfen und in einem Gewächshaus zu halten. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Die entsprechenden Stufen der Tomate und Augenbohnen Pflanzen für Nematoden Impfungen für die beiden beschriebenen Systeme sind in den Abbildungen gezeigt1 und 2. Darüber hinaus sind Beispiele für gut infizierten Wurzeln von Tomaten und Kuherbsen in den 4 und 5 gezeigt. Wie in den meisten Krankheitsresistenz Bildschirmen, ist es ratsam, mindestens 6-10 Pflanzen pro Genotyp für Nematoden-Impfung verwenden, um den Durchschnitt der Infektionsrate zu berechnen. Variation in Nematodeninfektion zwischen Pflanzen, des gleichen Genotyps kann durch die Verwendung einheitlicher Größe der Anlage und genaue Menge und Lieferung von Inokulum reduziert werden. Der Einsatz von Schalen und Beuteln Wachstum ermöglicht Screening von Hunderten bis Tausenden von Pflanzen in einem kleinen Raum Wachstum. Das Wachstum Beutel ermöglichen auch eine schnelle und effiziente nicht-destruktiven Bewertung von Wurzel-Nematode Infektionen, ohne dass zum Waschen Wurzeln (Abbildung 4). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine zwei Wochen alte cowpea Anlage in einem Beutel gewachsen und bereit für den Root-Knoten NEMATode Impfung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein drei Wochen altes Tomatenpflanze bereit für Wurzel-Nematode Impfung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Abbildung 3. Eine modifizierte Nadel und Pipettenspitze für High-Throughput-Impfung von Nematoden eingesetzt. Der Boden einer Nadel wurde verschlossen und drei Sätze von Löchern in der Nadel mit einem Laserstrahl gebohrt. Dann wurde das modifizierte Nadel mit einem 5-ml-Pipettenspitze geklebt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Abbildung 4. Eine Tomate Wurzelsystem mit Wurzelknoten-Nematoden infiziert. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Bild 5. Ein Kuherbsen Wurzelsystem mit Eiermassen mit Erioglaucin gefärbt 30 Tage nach der Inokulation bei gezüchtet28 ° C.

<ol><li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li>
<li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Circ%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li>
<li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.%2C+including+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li>
<li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li>
<li>Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatkin%2C+OA+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Manual%22">Calif. Agric. Exp. Stn. Manual</a>. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).</li>
<li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li>
<li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li>
<li>Perry, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+RN+%22Root-Knot+Nematodes%22">Root-Knot Nematodes</a>. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).</li>
<li>Starr, J. L., Cook, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStarr%2C+JL+%22Resistance+to+Parasitic+Nematodes%22">Resistance to Parasitic Nematodes</a>. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Es gibt zwei kritische Schritte für eine erfolgreiche Nematoden Bildschirm: Vorbereitung einer hoch infektiösen Inokulums und Verwendung von Pflanzen im richtigen Entwicklungsstadium. Schlupfrate der Wurzel-Nematode Eier ist sehr variabel und liegt zwischen 5 - 50%. Deshalb, um ein optimales Niveau von Luke und hoch infektiöse J2S zu erhalten, muss besonderes Augenmerk auf die Gewinnung und Ei Schlüpfen Verfahren bezahlt werden. Eier sollten zum Bleichen für einen minimalen Zeitraum ausgesetzt werden und Bleichmittel sollte gut werden, von der Wurzel Mischung gespült. Beim Schlüpfen der Eier sollte die Aufschlämmung, die die Eier nicht in Wasser getaucht werden. Darüber hinaus vermeiden verschütten die Eier in das darunter liegende Petrischale, wo die geschlüpften Jungtiere werden gesammelt. Eine Möglichkeit, damit kein die Eier während der Brut-Prozess ist nicht mit Wasser direkt in das Kimwipe als das Papier brechen könnte. Stattdessen fügen Sie das Wasser direkt in der Petrischale. Für beste Ergebnisse verwenden frisch geschlüpften J2S. Wenn die hatch ist niedrig und mehr Inokulum benötigt wird, kann J2S bei 15 ° C über einen längeren Zeitraum gespeichert werden. Erwärmen Sie die gespeicherten Inokulum auf Raumtemperatur, um die Nematoden vor der Impfung wieder zu beleben. Jedoch nicht speichern die J2S über einen längeren Zeitraum sogar bei 15 ° C wie ausgehungerte J2S nicht effizient zu infizieren. Junge Sämlinge sind die beste Entwicklungsstadium für Wurzel-Nematode Impfung. Dies muss jedoch ausgewogen sein mit der Bildung einer ausreichenden Wurzelsystem eine ausreichende Anzahl von Wurzelspitzen als Ansatzpunkte für den J2S. Sicherstellen der optimalen Pflanzenwachstum Bedingung ist auch entscheidend für die Bildschirme. Vermeiden Sie zu Bewässerung von Pflanzen speziell diejenigen in Beuteln gewachsen. Over-Bewässerung der Beutel, wie durch stehendes Wasser in der Unterseite der Tasche, kann das Pilzwachstum fördern und zu verringern Wurzel Gesundheit. Sowohl Assays weitere Auswertung Nematodeninfektion und Berechnung der Anzahl von Eiern / Wurzelsystems und Eier / g Frequenzsh Root ausgeführt werden kann. Für die Tomaten-Assays, werden einzelne Wurzeln gewogen und Eier extrahiert, wie für Inokulumzubereitung (Abschnitt 3) beschrieben. Bei der Verarbeitung großer Anzahl von Pflanzenproben konnten einzelne Wurzel-Systeme mazeriert mit einem Mixer für Ei-Extraktion werden. Die Anzahl der Eier sollten in mindestens drei Aliquots gezählt werden und die Eier / Gramm der frischen Wurzel-System berechnet. Für den Beutel Assays wird das Wurzelsystem aus dem Papier-Einsatz gezogen, gewogen und Eier entnommen.

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Wurzelknoten-Nematoden (Gattung Meloidogyne) sind obligat Pflanzenparasiten. Sie sind extrem polyphag und als eine der wirtschaftlich bedeutendsten Werk Nematoden. Die mikroskopische zweiten Stufe juvenile (J2), einmal im Ei gemausert, ist der infektiösen Stadium. Die J2S schlüpfen aus den Eiern, bewegen sich frei im Boden innerhalb von einem Wasserfilm, und suchen Sie Wurzelspitzen von geeigneten Pflanzenarten. Nach dem Durchdringen der Pflanzenwurzeln, sie gegenüber der vaskulären Zylinder migrieren, wo sie eine Futterstelle einzurichten und zu initiieren Fütterung mit ihrem Stilett. Die vielzelligen Futterstelle aus mehreren erweiterten mehrkernige Zellen, die sogenannten &quot;Riesenzellen&quot;, die aus Zellen, die Karyokinese (wiederholte Mitose) ohne Zytokinese unterzog gebildet bestehen. Benachbarte Perizykel Zellen teilen und vergrößern in der Größe, die zu einer typischen Galle oder Root-Knoten, die charakteristische Symptom der Wurzel-Nematode Infektion. Nach Fütterung eingeleitet wird, werden J2S sesshaften und UNdergo drei weitere Häutungen, erwachsen zu werden. Die erwachsenen Weibchen legt 150-250 Eier in einer gallertartigen Matrix auf oder unterhalb der Oberfläche der Wurzel. Aus den Eiern schlüpfen neue infektiöse J2S und einen neuen Zyklus beginnen. Die Wurzel-Nematode Lebenszyklus wird in 4-6 Wochen bei 26-28 ° C abgeschlossen Hier präsentieren wir die traditionellen Protokoll, um Pflanzen, in Töpfen gezogen, mit Wurzelknoten-Nematoden und zwei Methoden für die Hochdurchsatz-Assays zu infizieren. Die erste High-Throughput-Verfahren wird für Pflanzen mit kleinen Samen wie Tomaten verwendet, während der zweite ist für Pflanzen mit großen Samen wie Augenbohnen und gemeinsame Bohne. Große Samen unterstützen erweiterte Sämlingswachstum mit minimalem Nahrungsergänzungsmittel. Der erste Assay mit hohem Durchsatz verwendet Sämlinge in Sand in Böden gewachsen, während in der zweiten Assay Pflanzen in Beuteln in Abwesenheit des Bodens angebaut werden. Die Sämlingswachstum Beutel besteht aus einem 15,5 x 12,5 cm Papier Docht gemacht, gefaltet an der Spitze, eine 2-cm-tiefen Trog, in dem der Samen oder Sämling gelegt zu bilden. DiePapier Docht wird in einem durchsichtigen Kunststoffbeutel enthalten. Diese Wachstumsfaktoren Beutel ermöglichen die direkte Beobachtung der Nematodeninfektion Symptome, Fressen von Wurzeln und Eimasseproduktion unter der Oberfläche eines transparenten Beutel. Beide Methoden erlauben die Verwendung der abgeschirmten Pflanzen, nach Phänotypisierung, für die Überquerung oder Samenproduktion. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung des Wachstums Beutel ist der geringe Platzbedarf, da Beutel aus Kunststoff Hängemappen in Racks angeordnet sind gespeichert.

Zwei verschiedene Methoden, um Bildschirm-Anlagen mit Wurzelknoten-Nematoden werden beschrieben. Die beschriebenen Ansätze sind in High-Throughput-Screens mit Nematoden in einer zerstörungsfreien Art und Weise zur Erleichterung der Nutzung dieser Pflanzen in Zuchtprogrammen.

High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp.</em

Wurzelgallennematoden (Gattung Meloidogyne) sind obligate Pflanzenparasiten. Sie sind extrem polyphag und werden als eine der wirtschaftlich bedeutendsten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Pflanzen, die mit Wurzelgallennematoden befallen sind, zu untersuchen. Züchten Sie zunächst gesunde Keimlinge in sandigem Boden oder Wachstumstaschen. Erzeugen Sie anschließend ein Inokulum stark infizierter juveniler Stadien zweiter Ordnung von Wurzelgallennematoden.Dann die Sämlinge ordnungsgemäß impfen und infizieren. Schließlich die Entwicklung von Nematoden-Eimassen am Wurzelsystem des Wirts bewerten. Wir werden einen Hochdurchsatz- und Niedrigdurchsatz-Screening von Pflanzen mit Wurzeln, nicht mit Nematoden, demonstrieren.Die wichtigsten Vorteile des Hochdurchsatzsystems sind der geringe Platzbedarf für das Pflanzenwachstum und die einfache Beurteilung der Infektion. Diese Ansätze führen daher zu einer reproduzierbaren und einheitlichen Infektion der Pflanzenwurzeln mit Nematoden und ermöglichen eine bessere Bewertung des Wirtstatus der Pflanze. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Beurteilung von Pflanzen mit Wurzeln im Zusammenhang mit Nematoden sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht das geeignete Entwicklungsstadium verwenden, um die Wurzeln mit Nematoden zu infizieren.Sowie durch die Verwendung mehrere Tage alter infektiöser juveniler Stadien, die typischerweise eine geringe Infektiosität aufweisen. Den Ablauf wird Hug Up Atian, Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Ich werde das Verfahren zur Untersuchung in Wachstumstaschen für Topfversuche vorführen. Pflanzen Sie Tomatensamen in einen einzelnen Topf mit humusreichem Boden, wie beispielsweise Sunshine Mix, und halten Sie im Gewächshaus nach der Keimung eine Temperatur von 22 bis 28 Grad Celsius ein.Einmal w&ouml;chentlich mit Miracle-Gro d&uuml;ngen, etwa zwei Wochen nach der Keimung. Im Stadium der zwei echten Bl&auml;tter einzelne S&auml;mlinge in T&ouml;pfe mit sterilisierter sandiger Erde (90 % Sand und 10 % organischer Stoff) umtopfen. Osmocote-Fl&uuml;ssigd&uuml;nger mit langsamer Freisetzung hinzuf&uuml;gen und zwei Wochen lang in einem Gew&auml;chshaus bei 22 bis 28 Grad Celsius kultivieren. Fortlaufend einmal w&ouml;chentlich mit Miracle-Gro d&uuml;ngen.Für Hochdurchsatz-Screenings säen Sie Pflanzensamen direkt in Schalen mit sandigem Boden. Bedecken Sie die Schalen mit Plastikfolie bis zur Keimung und pflegen Sie sie wie zuvor beschrieben. Nach der Keimung fügen Sie Osmocote Langzeitdünger hinzu und düngen wöchentlich mit Miracle-Gro. Keimen Sie Samen in einer mit mehreren Lagen Kim-Wipe-Papier ausgelegten Petrischale in einem Inkubator bei 25 bis 28 Grad Celsius, und überführen Sie anschließend die Keimlinge in einzelne Beutel.Alternativ die Samen in die Papiernut legen, um sie direkt in einzelnen Beuteln keimen zu lassen. Die Beutel in einem Plastikhängemappenordner pro Ordner platzieren und die Ordner auf einem Gestell in senkrechter Position anordnen.Stellen Sie den Rack in eine kontrollierte Umgebungskammer, die bei einer Temperatur von 25 bis 28 Grad Celsius und 16 Stunden Licht gehalten wird. Achten Sie auf einen 8-stündigen Dunkelzyklus und bewässern Sie die Beutel ein- oder zweimal täglich mit umgekehrt osmotischem Wasser, etwa 10 bis 14 Tage nach der Aussaat. Sobald ein ausreichend entwickeltes Wurzelsystem mit Wurzelspitzen der dritten Ordnung vorhanden ist, sind die Keimlinge bereit für die Inokulation. Vor Beginn der Ei-Extraktion waschen Sie den Arbeitsbereich und alle Werkzeuge gründlich mit heißem Wasser, um Kontaminationen zu vermeiden.Stellen Sie einen Eimer in ein Waschbecken, um die Lösung aufzufangen, und platzieren Sie eine Drahtgitterablage darüber. Stapeln Sie drei Siebe von oben nach unten in abnehmender Porengröße, sodass die Eier im 25-Mikron-Sieb gesammelt werden. Schneiden Sie die Spitzen der befallenen Pflanzen ab und entsorgen Sie sie sorgfältig.Entfernen Sie die Pflanze aus dem Topf und waschen Sie die Wurzeln, indem Sie sie in einen vollen Plastikeimer mit Wasser tauchen. Spülen Sie die Wurzeln anschließend weiter unter fließendem Wasser, bis die Bodenpartikel entfernt sind. Danach gewinnen Sie Eier des Wurzelknollen-Nematoden aus befallenen Tomatenwurzeln.Schneiden Sie zunächst die Wurzeln mit einer Schere in kleine Stücke, wobei die Pfahlwurzel entfernt wird. Geben Sie die gehackten Wurzeln einer einzelnen Pflanze in ein großes Plastikgefäß mit Deckel und fügen Sie gerade so viel 10 %ige Bleichlösung hinzu, dass die Wurzeln bedeckt sind. Schließen Sie den Deckel und schütteln Sie das Gefäß zwei Minuten lang.Öffnen Sie das Gefäß und gießen Sie die Wurzeln auf das obere Sieb. Spülen Sie sie gründlich mit einem Schlauch, der an eine Sprühdüse angeschlossen ist, bis der gesamte Geruch von Bleiche verschwunden ist. Benutzen Sie einen Gummihammer, um die Seiten der Siebe zu bearbeiten, um ein Verstopfen der Siebe zu vermeiden.Pausieren, das obere Sieb entfernen und die Rückstände abspülen. Und das zweite Sieb. Das zweite Sieb entfernen und die feinen Rückstände sammeln, wozu die Eier aus dem letzten Sieb mit einem sanften Wasserstrahl aus einer Wasserflasche abgespült werden.Bewegen Sie die Rückstände auf eine Seite des Siebs. Sammeln Sie die Rückstände und Eier mit einer geringstmöglichen Menge Wasser in einem sauberen Becher. Führen Sie das im Eimer gesammelte Wasser durch das 25-Mikron-Sieb, um eventuell entgangene Eier einzufangen.Gründlich mit Wasser spülen und im selben Becher auffangen. Einen sauberen Metallkorb mit mehreren Lagen Kimwischpapier auskleiden. Abwischen und auf eine Glaspetrischale setzen, wobei zwischen dem Boden des Korbs und der Schale ein Abstand von einem Zentimeter verbleibt.Geben Sie die extrahierten Nematodeneier auf das Papier in dem Drahtkorb. Fügen Sie so viel Flüssigkeit hinzu, dass der Boden des Drahtkorbs die Wasseroberfläche berührt, aber nicht im Wasser eingetaucht ist.Decken Sie die Oberseite jeden Tag mit einem Plastikdeckel ab. Prüfen Sie auf Wasserverdunstung und geben Sie etwas Wasser in die Petrischale, sodass der Boden des Korbs das Wasser berührt. Um zu verhindern, dass die Eier alle zwei Tage über einen Zeitraum von sechs bis acht Tagen austrocknen, sammeln Sie das Wasser, das die juvenilen Larven des zweiten Stadiums oder J-Zweien aus der Petrischale enthält, in einem Becher auf.Falls nicht sofort verwendet, das gesammelte Inokulum umgehend bei Raumtemperatur mit einer Laborluftversorgung oder Luft aus einer Aquarienpumpe belüften. Beginnen Sie mit dem nächsten Schritt, indem Sie das Inokulum auf einem magnetischen Rührer bei niedriger Drehzahl umrühren. Verwenden Sie drei Aliquots der gesammelten Nematoden.Zur Bestimmung der Anzahl der J-Zweier in der Abrechnung. Rutschen- oder Schälchenmethode anwenden, den Durchschnitt berechnen und das gewünschte Inokulationsvolumen ermitteln. Dies sind J-Zweier, wie sie unter dem Mikroskop sichtbar sind.Üblicherweise werden 3000 J-Zweien pro Pflanze in Töpfen und 500 J-Zweien für in Sämlingsgefäßen kultivierte Pflanzen verwendet. Stellen Sie vor der Inokulation der Pflanzen sicher, dass der Boden feucht, aber nicht zu nass ist. Für die Inokulation im Topf werden drei Löcher von etwa der halben Topftiefe in dem Sand um jedes Tomatenwurzelsystem angelegt.Bepflanzen Sie jede Pflanze mit einem Bleistift, indem Sie die J-Zweien mit einer Pipette in die drei Löcher einbringen. Danach decken Sie die Löcher für die Hochdurchsatz-Screens in Schalen ab. Verwenden Sie eine modifizierte, versiegelte Nadelspitze mit seitlichen Löchern, die an eine fünf Milliliter umfassende Pipette geklebt ist.Pipettieren Sie entlang einer Pipettenspitze, um die J-Zweien in den Boden zu bringen. Pflegen Sie die Pflanzen sechs bis acht Wochen lang in einem Gewächshaus bei 24 bis 27 Grad Celsius. Düngen Sie weiterhin zweimal pro Monat mit Miracle-Gro.Zur Beurteilung der Infektion. Schneiden Sie die Pflanzenspitzen ab und entfernen Sie die Pflanzen vorsichtig aus den Töpfen, anschließend waschen Sie die Wurzeln. Färben Sie dann die Eimassen blau, indem Sie die Wurzeln in eine Lösung von einem Milligramm pro Liter eintauchen.Belüften Sie 15 Minuten lang. Spülen Sie die Wurzeln mit Wasser ab und bewerten Sie, indem Sie die gefärbten Eimassen an einzelnen Wurzelsystemen zählen. Eine beleuchtete Stereolupe kann verwendet werden, um die Eimassen besser sichtbar zu machen, die Nematoden zu zählen, das Inokulum aufzubereiten und wie zuvor beschrieben auf einer magnetischen Rührplatte zu rühren.Entfernen Sie die Beutel aus den Hängemappen und legen Sie sie auf eine horizontale Fläche. Inokulieren Sie jeden Beutel mit 1.500 J2-Stadien in fünf Millilitern. Heben Sie die Kunststoffabdeckung des Beutels an und verteilen Sie die Nematoden gleichmäßig über die Wurzeloberfläche.Halten Sie die Beutel 24 Stunden nach der Inokulation in horizontaler Position unter abgedeckt mit dunklem Papier, um Licht auszuschließen. Danach bringen Sie die Beutel in die hängenden Ordner in der Wachstumskammer zurück und versorgen Sie sie mit Wasser. Die Pflanzen müssen ein- oder zweimal täglich für etwa drei Tage mit einer halbstarken Hoagland-Lösung versorgt werden, bis eine Reaktion auf den Dünger beobachtet wird.Typischerweise verstärkte Blattvergrünung und kräftigerer Triebwuchs. Nach drei Tagen die Taschen mit Wasser feucht halten. Ungefähr 30 Tage nach der Inokulation jede Tasche mit etwa 10 bis 20 Milliliter 75 Milligramm pro Liter infundieren.Überflutendes Beschichten. Die Beutel über Nacht in horizontaler Position mit der Farblösung überflutet halten. Am nächsten Tag die Beutel entleeren und die Wurzelsysteme auswerten, indem die Eimassen unter einer beleuchteten Schreibtischunterlage gezählt werden.Im Vergrößerungsansicht sind hier die Wurzeln einer stark befallenen Tomatenpflanze mit den weit verbreiteten Eimassen zu sehen, die blau angefärbt sind. Die Verwendung von Schalen ermöglicht die Untersuchung von Hunderten von Pflanzen in einem kleinen Anbauvolumen. Wachstumstaschen erlauben außerdem eine schnelle und ausreichende, nicht-destruktive Beurteilung der Wurzeln, ohne dass eine Wurzelreinigung erforderlich ist, um Nematodenbefall festzustellen.Diese Methode ermöglicht auch das Hochdurchsatz-Screening von Tausenden von Pflanzen in einem kleinen Wachstumsraum. Hier zeigt das Wurzelsystem einer in einer Hülle gezogenen Kuh P-Pflanze blau angefärbte Eimassen nach Inokulation. Der Zeitpunkt der Infektion ist für Pflanzenassays mit Nematoden sehr kritisch.So kann eine Verzögerung der Infektion bereits um wenige Tage zu sehr geringen Infektionsgraden führen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Pflanzen mit Wurzelknollen-Nematoden infiziert und bewertet werden. Vergessen Sie nicht, dass Wurzeln, die mit Nematoden infiziert sind, sachgemäß behandelt werden müssen.Das Autoklavieren der Wurzeln vor der Entsorgung begrenzt die Ausbreitung des Nematoden. Außerdem ist Vorsicht bei der Verwendung von Glyphosat in hohen Dosen geboten, da es krebserregend ist.Daher müssen Sie Handschuhe tragen, sowohl beim Umgang mit Wurzeln, die mit dieser Chemikalie infiziert sind, als auch bei der Zubereitung dieser Chemikalie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

In diesem Video demonstrieren wir einen Screening-Assay, um die Wirksamkeit von niedermolekularen Nematiziden gegen Nematoden zu identifizieren. Nematizide gelten als wirksam, wenn sie nach der Exposition zu einer Abnahme der Anzahl mobiler Nematoden in der Probe führen.

Screening-Assay für niedermolekulare Nematizide: Eine Methode mit mittlerem Durchsatz zum Screening potenzieller Nematizide gegen Ditylenchus dipsaci

Nematoden sind Bodenbewohner-Rundwürmer, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Wir zeigen, Stichprobenverfahren zur Isolierung dieser Nematoden aus dem Boden mit zwei Techniken: das Insekt Hetze und die modifizierte Weiß Falle, für die Gewinnung von Nematoden aus Bodenproben und infizierten Insektenkadaver auf.

Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Hier wird ein Protokoll für das schnelle zerstörungsfreie Screening von Baumwollgenotypen auf reniforme Nematodenresistenz vorgelegt. Das Protokoll beinhaltet die visuelle Untersuchung der Wurzeln von nematodeninfizierten Baumwollsämlingen, um die Infektionsreaktion zu bestimmen. Der vegetative Trieb aus jeder Pflanze wird dann vermehrt, um Pflanzen für die Saatgutproduktion zurückzugewinnen.

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Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Kultivierung, Sammlung und zum Screening von Ditylenchus dipsaci.

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Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

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Das Protokoll beschreibt die Infektion der Wurzeln von Solanum tuberosum mit pflanzenparasitären Nematoden unter in vivo Gewächshausbedingungen und von in vitro transgenen Wurzeln von Kartoffeln für die histochemische Analyse der Wurzelstruktur durch optische Mikroskopie.

In vivo und in vitro Infektion von Kartoffelwurzeln mit pflanzenparasitären Nematoden zur Beurteilung induzierter Strukturveränderungen

Wir stellen zwei Methoden vor, mit denen Landwirte entomopathogene Nematoden massenhaft als Bioinsektizide vermehren können. Die erste Methode verwendet Polyacrylamidgel als Nematoden-Kultivierungssubstrat, während die zweite polymerbeschichtete Baumwolle als Kultivierungssubstrat verwendet. Beide Methoden basieren auf der in vivo Vermehrung von Nematoden in Insektenkadaver.

Pflanzenbasierte in vivo Vermehrung entomopathogener Nematoden

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Lernen Sie Hoch- und Niedrigdurchsatz-Screenings von Pflanzen mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp. Diese Methoden ermöglichen reproduzierbare Infektionen und unterstützen Züchtungsprogramme für resistente Sorten.

High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp.

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