Name: Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die ex vivo Kultur von Kaninchen- und menschlichen Spenderhornhäuten zur Untersuchung von Herpes-simplex-Virus-Typ-I-Infektionen. Dieses Modell bietet eine physiologisch relevante Alternative zu herkömmlichen Zellkulturen.

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Die Unterstützung der Lions Eye Bank of Delaware Valley war für diese Arbeit von unschätzbarem Wert. Primäre Maus-monoklonaler Antikörper gegen ICP8 war eine Art Geschenk von Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Wir danken auch Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) und Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) für hilfreiche Diskussionen und Know-how.

Alle Reagenzien und Ausrüstung wurden gekauft wurden steril oder vor dem Verfahren sterilisiert. Dieser Artikel beschreibt die Schritte zum Einrichten der ex vivo-Modell beginnt mit einer Pre-entkernte Auge. In unseren Experimenten verwenden wir frische ganze Augäpfel aus jungen (8-12 Wochen) Albino-Kaninchen (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Darüber hinaus nutzen wir die menschliche Hornhäute von der örtlichen Hornhautbank erhalten. Bei Durchführung Enukleation selbst darauf achten, dass eine Beschädigung der Hornhaut oder den Limbus während des Verfahrens. Kaninchen Enukleation Protokolle können an anderer Stelle 2 zu entnehmen. Teil 1: Die Exzision des korneoskleralen Knopf <ol><li> Befeuchten Sie einen schmalen Streifen aus Gaze mit PBS und wickeln Sie es um den Augapfel zu erleichtern hielt sie während des Verfahrens. </li><li> Mit einem scharfen Skalpell einen tangentialen Einschnitt in der Sklera zu machen, etwa 0,5 cm vom Limbus. </li><li> Verwenden Sie eine scharfe Schere, um den Einschnitt und vollständig Verbrauchsteuern die corneoscleral Taste. </li><li> Sobald die korneoskleralen Taste isoliert, necken sich die Blende während die Sklera Felge mit einer Pinzette. Vermeiden Sie Schäden am Endothel bzw. auszuüben übermäßige Belastung auf der Hornhaut. </li></ol> Teil 2: Einführung der Cornea in Organotypische Kultur <ol><li> Explantierten Hornhäute werden in Minimum Essential Medium (MEM) mit Non-Essential Amino Acids (1X), L-Glutamin (2 mM), Penicillin (200 U / ml) und Streptomycin (200 ug / ml) kultiviert. Ein Antipilzmittel, wie Amphotericin, können ebenfalls zugesetzt werden, wenn notwendig. </li><li> Vorbereiten einer 1% igen Lösung in Kulturmedium und halten es bereit bei 55 ° C </li><li> Gründlich die Hornhaut in sterile PBS enthaltend Penicillin (200 U / ml) und Streptomycin (200 ug / ml). </li><li> Legen Sie die Hornhaut epithelialen Seite nach unten in eine Vertiefung einer sterilen Tüpfelplatte. </li><li> Fügen Sie die Agarose-haltigem Medium auf die endotheliale Konkavität der Hornhaut gerade genug, umfüllen Sie es vollständig aus. Lassen Sie ~ 1 min für die Agarose zu verfestigen. </li><li> Legen Sie die Hornhaut mit dem tragenden Gerüst Gel epithelialen Seite nach oben in eine 35 mm Gewebekulturschale und fügen Kulturmedium, um die Epithelzellen bedecken. </li><li> Die Hornhaut kann auf diese Weise über eine Woche kultiviert werden, wobei das Medium alle 48 Stunden. </li></ol> Teil 3: Eine Infektion mit HSV-1 und Behandlung mit experimentellen Drogen <ol><li> 1 ml Medium, enthaltend die gewünschte Menge des Virus in eine 35 mm Gewebekulturschale. Wir arbeiten normalerweise mit 1x10 4 PFU von Stamm KOS HSV-1 pro Hornhaut zu infizieren. Unser Lager Titer indem Plaque-Assays auf CV-1 Monolayer bestimmt. </li><li> Legen Sie die Hornhaut zusammen mit dem Agarose Gerüst epithelialen Seite nach unten in die Virus-haltigem Medium. </li><li> Platzieren Sie die Hornhaut in einer Gewebekultur-Inkubator für 1 Stunde mit intermittierenden Schaukelstuhl alle 10-15 min infizieren. </li><li> Nach 1 Stunde absaugen Virus-ContaiNing mittleren und spülen 2-3 mal mit PBS, um alle restlichen virale Partikel zu entfernen. </li><li> Platzieren der Hornhaut wieder in seine vorherige Position und frisches Kulturmedium, um die epitheliale Oberfläche bedeckt. </li><li> Experimentelle Therapien können vor oder nach der Infektion gestartet werden kann, je nach Art des Experiments. </li><li> Kulturmedium wird alle 48 Stunden gewechselt. </li></ol> Teil 4: Probenahme <ol class="lalpha"><li> Medium für die Plaque-Assay-Analyse. Mischen Sie die Medium gut und verwenden Sie es sofort für einen Plaque-Assay oder bei -80 ° C für eine spätere Verwendung, wenn Sammeln von Proben zu verschiedenen Zeitpunkten. </li><li> DNA, RNA, Protein oder Zellen von Hornhautepithel <ol><li> Entfernen Sie die Agarose Gerüst und spülen Sie die Hornhaut gut mit PBS. </li><li> Excise der Ring aus Skleragewebe von der Hornhaut, dass nur Hornhautepithels Materials gewährleistet ist, gesammelt. </li><li> Usingen ein Skalpell, schaben die kornealen Epithelzellen in die entsprechenden Puffer in Abhängigkeit von der Art des Materials zu isolieren. Für die Isolierung von DNA und RNA, verwenden wir die DNeasy Blood &amp; Tissue Kit und die RNeasy Mini Kit bzw. (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Für die Sammlung von Proteinlysate, verwenden wir Laemmli Puffer. Für Flusszytometrie Analyse Hornhautepithelzellen wir vorher inkubiere die Hornhäute in einer kleinen Menge von Trypsin, um die Zellen lösen, und verdrängen sie in Trypsin mit einem Skalpell. Da Abkratzen des Hornhautepithel ergibt keine gleiche Mengen von Gewebe, ist es wichtig, geeignete Kontrollen beinhalten bei der Analyse der Proben. Wir verwenden 18S rRNA als Referenz Transkript in qRT-PCR, GAPDH als Referenz-Gen in qPCRs und Nukleolin als Ladekontrolle für Western-Blots. </li></ol></li><li> Gewebeproben für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz <ol><li> Entfernen Sie die Agarose Gerüst und spülen Sie den Maisea gut mit PBS. </li><li> Abhängig von Ihrer experimentellen Ziel, verwenden Sie die Hornhaut ein Paraffin Gewebe Block oder eine gefrorene Gewebe Block zu machen, wie in dem Video gezeigt. Wir folgen Standardverfahren bei der Vorbereitung Hornhautgewebe Abschnitte. </li></ol></li></ol> Repräsentative Ergebnisse Die meisten der verfügbaren Methoden zur Untersuchung von Zellen in Gewebekultur kann leicht für den Einsatz in Hornhäute mit HSV-1 ex vivo infiziert angepasst werden. Sehen Sie hier repräsentative Ergebnisse für einige der am häufigsten verwendeten Techniken für das Studium HSV-1-Infektion - qPCR (1D), qRT-PCR (Abbildung 1B), Western Blot (1F), Plaque-Assay (Abbildung 1C) und Gewebe Immunfluoreszenz (1E). <img src="/files/ftp_upload/3631/3631fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Analyse der Hornhäute mit HSV-1 ex v infiziertivo. (A) Schematische Darstellung der ex vivo Modell der akuten Hornhautepithels HSV-1-Infektion. (BF) Analyse der Augenhornhaut infiziert mit der Methode in diesem Video Artikel beschrieben. Explantierten Kaninchenhornhäuten wurden mit 1x10 4 PFU / Hornhaut Stamm KOS HSV-1 infiziert und kultiviert in Gegenwart (PAA) oder Abwesenheit (Mock) von Phosphonoessigsäure (400 ug / ml), ein bekannter Inhibitor von HSV-Replikation. (B) Gesamt RNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt, und die virale Transkription wurde durch qRT-PCR mit Primern für HSV-1-Polymerase beurteilt. Primern gegen 18S rRNA wurden als Referenz benutzt. n = 3 ist. Fehlerbalken zeigen ± SEM. (C) Das Kulturmedium wurde auf 48 hpi gesammelt und infektiöses Partikel Produktion wurde durch Plaque-Assay auf CV-1-Monoschichten beurteilt. (D) Gesamt-DNA wurde bei 48 hpi gesammelt und viralen Genom-Replikation wurde beurteilt ein qPCR Assay mit Primern für die HSV-1-Genom. PrIMers gegen GAPDH wurden als Referenz benutzt. n = 3 ist. Fehlerbalken zeigen ± SEM. (E) Mock-behandelten Hornhäute wurden auf 48 hpi, geschnitten, schockgefroren und analysiert durch indirekte Immunfluoreszenz auf die Anwesenheit eines viralen frühen Proteins (ICP8) innerhalb des infizierten Epithels. Kerne werden mit Höchst 33.258 gegengefärbt. (F) Proteinlysate wurden bei 48 hpi gesammelt, und die Expression eines viralen Proteins (ICP0) wurde durch Western-Blot bestimmt. BCA-Assay wurde verwendet, um gleiche Belastung der Proben zu gewährleisten. hpi = Stunden nach der Infektion.

<ol><li>Kaye, S., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex keratitis.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).</li>
<li>Holmberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+exotic+pets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enucleation of exotic pets.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).</li>
<li>Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+herpes+simplex+virus+keratitis%3A+the+pathogenesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul.+Immunol.+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited.</a> Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).</li>
<li>Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+organ+culture+model+for+assessing+the+effects+of+growth+factors+on+corneal+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization.</a> Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).</li>
<li>Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy.</a> J. Control Release. 124, 107-133 (2007).</li>
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<li>Bhattacharjee, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+ocular+HSK+with+a+human+apolipoprotein+E+mimetic+peptide+in+a+mouse+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model.</a> Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).</li>
<li>Novitskaya, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difficulties+imaging+herpes+simplex+keratitis+with+fluorescein+isothiocynate-labeled+anti-HSV-1+antibodies+in+an+ex+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model.</a> Cornea. 28, 421-425 (2009).</li>
<li>Sharma, A., Shimeld, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunofluorescence+to+diagnose+herpes+simplex+virus+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung akuter Hornhautepithels HSV-1-Infektion in einem ex vivo-Modell. Dieses Modell ist ein nützliches Sprungbrett zwischen den in vitro und in vivo Modellen, weil es für physiologisch genaue Validierung der Zellkultur Ergebnisse ermöglicht und dadurch begrenzt die Menge von Tierversuchen, die durchgeführt werden müssen. Zusätzlich stellt die ex vivo Modell eine einzigartige Gelegenheit, und wertvolle epithelialen Herpe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien / Zubehör </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Mediatech </td><td> 10-010-CV </td></tr><tr><td> Non-Essential Amino Acids (100x Lösung) </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td></tr><tr><td> Penicillin G Sodium Salt </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td></tr><tr><td> Streptomycin Sulfatsalz </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> Vorbereitet im Labor </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA (1x) &lt;/ Td&gt; <td> Mediatech </td><td> 25-053-CI </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Laemmli Buffer </td><td> Vorbereitet im Labor </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Whole Kaninchen Eyes (Young) </td><td> Pel-Freez </td><td> 41211-2 </td></tr><tr><td> Menschliche Hornhäute und Whole Augen </td><td> Lokale Eye Bank </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 12 Well Porzellan Tüpfelplatte </td><td> Avogadro-Lab Versorgung </td><td> 1877 </td></tr><tr><td> 35 mm Gewebekulturschale </td><td> Falke </td><td> 353001 </td></tr><tr><td> 6 WellZellkulturplatte </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Cryomold Intermediate </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4566 </td></tr></tbody></table>

ex vivo organotypische corneal modell der akuten epithelial herpes simplex virus typ i infection

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes-Keratitis ist einer der schwerwiegendsten Pathologien, die mit dem Herpes-simplex-Virus-Typ 1 (HSV-1) zugeordnet ist. Herpes Keratitis ist derzeit die führende Ursache von sowohl Hornhaut abgeleitet und Infektion verbundene Blindheit in der entwickelten Welt. Typische Präsentation von Herpes-Keratitis umfasst Infektion der Hornhautepithel und manchmal die tiefere Hornhautstroma und Endothel, was zu solchen dauerhaften Hornhaut Pathologien als Narbenbildung, Ausdünnung, und Opazität ein. Kornealen HSV-1 Infektion ist traditionell in zwei Typen von experimentellen Modellen untersucht. Die in vitro-Modell, in dem kultivierten Monolayer von Hornhautepithelzellen in einer Petrischale infiziert sind, bietet Einfachheit, hohe Reproduzierbarkeit und schnelle Experimente und relativ niedrigen Kosten. Auf der anderen Seite bietet das in vivo Modell, in dem Tiere wie Kaninchen oder Mäuse direkt in der Hornhaut geimpft, eine hochentwickelte physiologischeSystem, hat aber höhere Kosten, längere Experimenten tierischen notwendigen Sorgfalt und einen größeren Grad an Variabilität. In diesem Video Artikel stellen wir eine detaillierte Demonstration einer neuen ex vivo Modell der Hornhautepithels HSV-1-Infektion, das die Stärken sowohl der in vitro und in vivo Modellen kombiniert. Die ex vivo-Modell nutzt intakten Hornhaut organotypically in Kultur gehalten und infiziert mit HSV-1. Die Verwendung des ex vivo-Modell ermöglicht eine hohe physiologische Basis Schlussfolgerungen, doch ist es sehr preiswert und erfordert Zeitaufwand vergleichbar mit der in vitro-Modell.

In diesem Video Artikel beschreiben wir die Verwendung eines neuen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell der akuten Herpes-simplex-Virus Typ I Hornhautepithels Infektion.

Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

Die Herpeskeratitis ist eine der schwersten Pathologien im Zusammenhang mit dem Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1). Die Herpeskeratitis ist derzeit die führende ...

Ich bin Jane Clifford, Ökon. Ich bin Professorin und Leiterin der Biochemie und Molekularbiologie am College of Medicine der Drexel University, und mein Name ist Ola Iv und ich bin ein MD-PhD-Student im Labor von Dr. Clifford. Das Video, das Oli und ich für Sie vorbereitet haben, demonstriert die ex vivo-Kultur von aus Kaninchen und menschlichen Spendergeweben gewonnenen Hornhäuten.Wir haben diese Korneen zur Untersuchung der Herpesvirusinfektion verwendet und sie eignen sich sicherlich auch für die Erforschung anderer Erkrankungen der Kornea. Es handelt sich um ein besonders relevantes ex vivo-Modell im Vergleich zu Zellen und Mono-Kulturen. Die Herpeskeratitis ist eine der schwerwiegendsten Pathologien, die mit dem Herpes-simplex-Virus Typ 1 assoziiert sind. Gegenwärtig ist sie die häufigste Ursache für eine infektionsbedingte, korneal bedingte Erblindung in den entwickelten Ländern.Die Herpes-Keratitis wird traditionell in zwei Arten experimenteller Modelle untersucht. Das In-vitro-Modell, bei dem kultivierte Mono-Schichten von Hornhaut-Epithelzellen in einer Petrischale infiziert werden, bietet Einfachheit, ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit, schnelle Experimente und relativ geringe Kosten. Demgegenüber bietet das In-vivo-Modell der Herpes-Keratitis, bei dem Tiere wie Kaninchen oder Mäuse direkt in die Hornhaut inoculiert werden, ein hochentwickeltes physiologisches System, ist jedoch mit höheren Kosten, längeren Versuchszeiten, notwendiger Tierversuchspflege und einem größeren Grad an Variabilität verbunden.In diesem Video-Artikel stellen wir eine detaillierte Darstellung eines neuen ex vivo-Modells einer akuten HSV-Typ-1-Infektion des Hornhautepithels vor, das die Vorteile sowohl der in-vitro- als auch der in-vivo-Modelle vereint. Das ex vivo-Modell verwendet intakte, typischerweise in Kultur gehaltene Hornhäute, die mit HSV infiziert werden. Die Anwendung des ex vivo-Modells ermöglicht physiologisch hochgradig relevante Schlussfolgerungen und ist dabei vergleichsweise kostengünstig sowie mit einem personellen Aufwand verbunden, der dem des in-vitro-Modells ähnelt.Bereiten Sie Folgendes vor Beginn des Verfahrens vor: Petrischale, gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Kornea-Kultur- und Scaffold-Medien, Spot-Platte, Gaze-Streifen, frisches Augapfel, Skalpell, Pinzette und scharfe Schere. Befeuchten Sie einen schmalen Gaze-Streifen mit PBS und wickeln Sie ihn um das Augapfel, um es sicher zu fixieren.Verwenden Sie während des Eingriffs ein scharfes Skalpell, um eine tangentiale Inzision in der Sklera etwa einen halben Zentimeter vom Limbus entfernt anzulegen. Entfernen Sie die korneosklerale Knopfprobe vollständig mit einer Schere. Wenn die Inzision verlängert wird, nimmt der Druck innerhalb des Augapfels ab, wodurch das Halten und Bearbeiten des Gewebes erschwert wird.Aus diesem Grund empfehlen wir, in diesem Schritt ein zuverlässiges, scharfes Paar Scheren zu verwenden. Sobald die Kornea-Sklera-Plombe isoliert ist, lösen Sie die Iris vorsichtig unter gleichzeitigem Halten des Sklerarandes mit einer Pinzette. Vermeiden Sie es, das Endothel zu beschädigen oder die Kornea übermäßig zu belasten.Stellen Sie eine 1 %ige Agarose-Lösung in Medium her und halten Sie diese bereit. Spülen Sie die Hornhaut bei 55 Grad Celsius gründlich in steriler PBS-Lösung mit Penicillin und Streptomycin aus. Legen Sie die Hornhaut mit der epithelialen Seite nach unten in die Vertiefung einer sterilen Spotlight-Platte.Agarose mit Medium in die endotheliale Vertiefung der Hornhaut geben, gerade genug, um sie vollständig zu füllen. Etwa eine Minute warten, damit sich die Agarose verfestigen kann.Legen Sie die Hornhaut mit der unterstützenden Agros-Platte epithelseitig nach oben in eine Zellkulturschale und geben Sie ergänztes MEM-Medium hinzu, um die epiteliale Oberfläche zu bedecken. Die Hornhaut kann auf diese Weise über eine Woche lang kultiviert werden, wobei das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird. Geben Sie ein Milliliter Medium, das die gewünschte Menge Virus enthält, in eine Zellkulturschale.Legen Sie die Hornhaut mit der Agro-Scaffold-Epithelseite nach unten in das Virus enthaltende Medium. Stellen Sie die Hornhaut für eine Stunde in den Gewebekultur-Inkubator, um die Infektion unter intermittierendem Schwenken alle 10 bis 15 Minuten durchzuführen. Saugen Sie danach das virushaltige Medium ab und waschen Sie zwei bis drei Mal mit PBS, um restliche virale Partikel zu entfernen.Beim Spülen mit PBS darauf achten, dass die Hornhaut nicht vom Agro-Scaffold gelöst wird. Frisches Medium hinzufügen, um die epiteliale Oberfläche zu bedecken. Experimentelle Behandlungen können je nach Versuchsansatz vor oder nach der Infektion begonnen werden.Das Kulturmedium wird alle 48 Stunden gewechselt. Das Medium gründlich mischen und sofort für einen Plaque-Assay verwenden oder für eine spätere Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wenn Proben zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt werden, die Hornhaut gründlich mit PBS spülen.Entfernen Sie das Agro-Scaffold, lösen Sie den Ring des skleralen Gewebes von der Hornhaut, um sicherzustellen, dass ausschließlich hornhautepitheliales Material gesammelt wird. Schaben Sie mithilfe eines Skalpells die Hornhautepithelzellen in den geeigneten Puffer, abhängig von der Art des zu isolierenden Materials. Das Entfernen des skleralen Randes ermöglicht es der Hornhautstruktur, schnell durch Wasseraufnahme anzuschwellen.Da die Schwellung das Abkratzen erschweren kann, empfehlen wir, den Schritt schnell durchzuführen und die Petrischale abzuspülen, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe gesammelt wurde. Entfernen Sie das Agro-Scaffold und spülen Sie die Hornhaut gründlich mit PBS ab.Verwenden Sie die Hornhaut, um je nach experimentellem Ziel einen Paraffin-Gewebeklotz oder einen gefrorenen Gewebeklotz herzustellen, wie hier gezeigt. Einbetten der Hornhaut in eine optimale Schneidetemperatur-Verbindung innerhalb einer Probenschale. Schnellgefrieren der Hornhaut in einem Ethanol-Trockeneis-Bad. Was wir in diesem Video gezeigt haben, ist die Vorbereitung von Hornhäuten, die Dissektion der Hornhaut, das Einbringen in eine ex vivo-Kultur und die Infektion von Hornhäuten mit Herpesvirus.Dies hat die Technik für ein Modell bereitgestellt, das uns bei der Untersuchung der Herpesvirusinfektion ex vivo sehr nützlich war, und wir hoffen, dass es auch anderen für ihre Experimente mit Hornhautzellen von Nutzen sein wird.

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Die meisten Studien über Herpes Hornhauterkrankung verwenden Primärinfektion Modell. Allerdings bedeutet primäre Infektion mit HSV-1 in der Regel nicht für die menschliche Erkrankung führen. Hier beschreiben wir ein wiederkehrendes Muster von herpetischer korneale Erkrankung, die näher Verhalten menschlicher Erkrankung.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Einrichtung eines ex vivo-Modells für bakterielle Keratitis unter Verwendung eines Hornhautknopfes, der aus dem Schweineauge präpariert wurde. Geimpfte Bakterien durchlaufen die Einschnitte in das Hornhautepithel, um in das darunter liegende Stroma einzudringen und eine Infektion im Hornhautgewebe zu etablieren, die die In-vivo-Infektion nachahmt.

Schweine-Ex-vivo-Hornhautmodell der bakteriellen Keratitis: Eine Technik zur Etablierung einer bakteriellen Infektion in Hornhautepithelzellen

Dieses Video zeigt die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit einem Virus, das aus infizierter Schweinehornhaut gewonnen wurde. Die Schweinehornhaut wird verwendet, um die antivirale Wirksamkeit von experimentellen Medikamenten zu testen.

Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit experimenteller Arzneimittel durch einen Plaque-Assay

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Die Haut ist ein Zielgewebe des humanpathogenen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1). Um den Invasionsweg von HSV-1 in das Gewebe zu untersuchen, haben wir ein ex vivo Infektionsmodell von murinen Epidermisschichten etabliert, die die äußerste Hautschicht darstellen.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.

Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Erfahren Sie die ex vivo Kultur von Kaninchen- und menschlichen Spenderhornhäuten zur Untersuchung von Herpes-simplex-Virus-Typ-I-Infektionen. Dieses Modell bietet eine physiologisch relevante Alternative zu herkömmlichen Zellkulturen.

Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

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