Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung des dendritischen Baumes der Burkini-Zellen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst organotypische Schnittkulturen des postnatalen Kleinhirns der Maus angelegt werden. Als nächstes kultivieren Sie die Schnittkulturen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Testen Sie zum Beispiel die Wirkung von MGL R one-Agonisten, fixieren Sie dann die Kulturen und decken Sie die Morphologie einzelner Bikinizellen, dendritischer Bäume, durch Anti-Calbindin-Immunfärbung auf. Der letzte Schritt besteht darin, die dendritischen Bäume der Perkin-Zellen zu analysieren. Die unter kontrollierten oder experimentellen Bedingungen gezüchteten Ergebnisse ergeben sich schließlich aus der Fluoreszenzmikroskopie der Immunos-Färbezellen von Perkin-Zellen, und die quantitative Bewertung der Größe und Verzweigung ihres dendritischen Baumes zeigen, dass die Aktivierung des Neurotransmitterrezeptors, insbesondere MGL R, die Entwicklung des dendritischen Baumes pro Kinji-Zelle tiefgreifend beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass fast das vollständige Auswachsen der Endrechte der Perkin-Zellen während der Kulturperiode stattfindet und somit ein sehr komplexes Thema wie die Entwicklung eines dendritischen Baumes in einer in vitro Umgebung untersucht werden kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, z. B. wie Aktivität das Wachstum und die Entwicklung neuronaler Prozesse beeinflusst. Um dieses Verfahren zu beginnen, sezieren Sie das Kleinhirn aus dem Gehirn eines PA-Mauswelpen in eiskaltem Präparationsmedium unter einem Stereomikroskop

Schneiden Sie als Nächstes das Kleinhirn mit einem McIlwain-Zerkleinerer in 350 Mikrometer dicke Scheiben in sagittaler Ausrichtung. Nachdem Sie die Scheiben getrennt haben, legen Sie die Scheiben mit etwa sechs Scheiben pro Einsatz auf Millipore-Zellkultureinsätze. Dann inkubieren Sie sie in sechs Well-Platten, die mit 0,75 Millilitern Inkubationsmedium pro Well in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius vorgefüllt sind.

Beginnen Sie die pharmakologischen Behandlungen am dritten Tag in vitro, indem Sie das PMA oder DHPG in der gewünschten Konzentration in das Kulturmedium geben. Erneuern Sie die Arzneimittel zusammen mit dem Wechsel des Nährmediums jeden zweiten oder dritten Tag. Für die Fixierung auf Kultur.

Entfernen Sie zuerst das Nährmedium und fügen Sie dann vorsichtig drei Milliliter Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzu, die die Kleinhirnscheiben enthält, die an der Membran der Millizelle befestigt sind. Einfügen. Entfernen Sie nach einer Fixierung der Kulturen über Nacht das Fixiermittel. Spülen Sie die Kulturen anschließend mit Phosphatpuffer.

Als nächstes fügen Sie der Kultur Kaninchen-Anti-Kuh-Bindung hinzu, verdünnt in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Kaninchen-Anti-Calbindin bei eins zu 1000 zur selektiven Visualisierung von Pro-Kinji-Zellen und monoklonales Anti-Neu-N bei eins zu 500. Zur selektiven Visualisierung von Körnerzellen in Blocklösung.

Inkubieren Sie die Kulturen damit über Nacht bei vier Grad Celsius unter Tötungsrührung. Am nächsten Tag spülen Sie die Kulturen dreimal mit 0,1 molaren Phosphatpuffer und verdünnen Sie die Sekundärantikörper. Ziege Anti Kaninchen, Alexa 5 68 und Ziege Anti Maus Alexa 4 88 bei eins zu 500 in 0,1 molar Phosphatpuffer, plus 0,1% Triton X 100.

Inkubieren Sie die Kulturen damit für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Kulturen dreimal in Phosphatpuffer gespült haben, entfernen Sie die Fleckenscheiben mit einem Pinsel aus der Kulturmulde und montieren Sie sie auf die Super Frosts plus Objektträger. Platzieren Sie die Deckgläser mit einem geeigneten Eindeckmedium.

Betrachten Sie die Kulturen dann auf einem normalen Mikroskop mit Epi-Fluoreszenzgeräten oder mit einem konfokalen Mikroskop mit der Fluoreszenzmarkierung von Bikinizellen. Die Größe des dendritischen Baumes einer bestimmten Zelle kann leicht gemessen werden, wenn sich der Baum nicht mit anderen Zellen überlappt. Sobald eine Bikinizelle mit einem nicht überlappenden dendritischen Baum identifiziert ist, wird sie mit der 20-fach-Linse betrachtet.

Ein Bild wird mit einer Digitalkamera aufgenommen und anschließend mit einem Bildanalyseprogramm analysiert. In unserem Laborbild kommt Pro plus zum Einsatz. Es ermöglicht die Umrandung des dendritischen Baums der Zelle mit einem einzigen Mausklick.

Mit dem Zauberstab-Werkzeug im Messmodus berechnet das Programm dann die Fläche, die vom dendritischen Baum bedeckt ist, und exportiert sie nach Ms.Xl. Dann erfolgt die statistische Analyse der Daten mit der GraphPad Prism-Software für die Anzahl der Verzweigungspunkte. Aufgrund der stark verzweigten und feinen Morphologie des ENDR-Baums der Kinji-Zellen müssen diese manuell gezählt werden. Die 20-fache Bilddatei der Kinji-Zellen wird mit Adobe Photoshop so vergrößert, dass sie den größten Teil des Bildschirms einnimmt.

Dann wird jeder Abzweigpunkt gezählt und mit einem roten Punkt markiert. Die identifizierten Bikinizellen wurden wiederholt fotografiert, um das Wachstum des dendritischen Baumes zu überwachen. Von Div zwei bis Div sieben nahm die Verzweigung der Dendriten kontinuierlich zu.

Von Div 4 bis Div 11 hatte sich der dendritische Baum erheblich erweitert. Gezeigt. Hier sind die Beispiele für die Hemmung der Entwicklung des dendritischen Baumes der Bikinizellen durch p KC oder mgl R eins, Stimulation A und D zeigt die unbehandelten Kontrollzellen mit einem gut entwickelten dendritischen Baum. Nach neuntägiger PMA-Behandlung erscheinen die Dendri verdickt, und der dendritische Baum ist stark verkleinert, wie bei BNE gezeigt.

Auf der anderen Seite. CNF zeigen, dass dieser dendritische Baum nach neun Tagen DHPG-Behandlung stark verkleinert war. Im Gegensatz zur PMA-Behandlung waren an den primären und sekundären Dendriten viele sehr feine und kurze Seitenäste vorhanden.

Die quantitativen Messungen hier zeigen, dass sowohl die Größe der dendritischen Bäume im oberen Balkendiagramm als auch die Anzahl der Verzweigungspunkte im unteren Balkendiagramm nach der PMA- oder DHPG-Behandlung stark reduziert waren. Die Unterschiede zwischen den kontrollierten dendritischen Bäumen und den dendritischen Bäumen von Bikinizellen aus behandelten Kulturen waren signifikant. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie z.B. Elektrophysiologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die funktionellen Implikationen einer veränderten Morphologie des dendritischen Baumes. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Kleinhirnschnittkulturen einrichtet und wie man Kinia-Zellen und Mythologie analysiert.