Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entwicklung des dendritischen Baums der Burkini-Zelle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst organspezifische Schnittkulturen des postnatalen Mauskleinhirns angelegt werden. Anschließend werden die Schnittkulturen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen kultiviert.

Beispielsweise lässt sich der Effekt von MGL R1-Agonisten testen, anschließend werden die Kulturen fixiert und die Morphologie einzelner Bikini-Zellen sowie der dendritischen Bäume mittels Anti-Calbindin-Immunfärbung sichtbar gemacht. Der letzte Schritt besteht in der Analyse der dendritischen Bäume der Purkinje-Zellen. Das Wachstum unter Kontroll- oder experimentellen Bedingungen führt letztendlich zu fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen der immungestärkten Purkinje-Zellen, und die quantitative Auswertung von Größe und Verzweigung ihrer dendritischen Bäume zeigt, dass die Aktivierung des Neurotransmitterrezeptors, insbesondere von MGL R1, die Entwicklung der dendritischen Bäume der Purkinje-Zellen erheblich beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nahezu das gesamte Auswachsen des Perkin-Zellfortsatzes während der Kultivierungszeit erfolgt, wodurch ein sehr komplexer Vorgang wie die Entwicklung eines dendritischen Baums in einem In-vitro-Setup untersucht werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, beispielsweise wie Aktivität das Wachstum und die Entwicklung neuronaler Fortsätze beeinflusst. Um dieses Verfahren zu beginnen, dissezieren Sie das Kleinhirn aus dem Gehirn eines PA-Mauswelpen in eiskaltem Präparationsmedium unter einem Stereomikroskop.

Schneiden Sie anschließend das Kleinhirn mit einem McIlwain-Gewebeschneider in 350 Mikrometer dicke Schnitte in sagittaler Orientierung. Nach dem Separieren der Schnitte legen Sie etwa sechs Schnitte pro Insert auf Millipore-Zellkultur-Einlagen. Inkubieren Sie diese dann in sechs-Loch-Platten, die pro Loch mit 0,75 Milliliter Inkubationsmedium vorbefüllt sind, in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.

Beginnen Sie die pharmakologischen Behandlungen am dritten Tag in vitro, indem Sie PMA oder DHPG in der gewünschten Konzentration dem Kulturmedium hinzufügen. Erneuern Sie die Wirkstoffe zusammen mit dem Wechsel des Kulturmediums alle zwei bis drei Tage. Zur Fixierung der Kulturen.

Entfernen Sie zuerst das Kulturmedium und geben Sie anschließend vorsichtig drei Milliliter Paraformaldehyd in jede Vertiefung, die die auf der Membran des Millicell-Inserts befestigten Kleinhirnschnitte enthält. Nach einer Übernacht-Fixierung der Kulturen entfernen Sie das Fixativ. Spülen Sie die Kulturen danach mit Phosphatpuffer aus.

Fügen Sie anschließend Kaninchen-anti-Kuh-Bindung, in Blockierungslösung verdünnt, der Kultur hinzu. Verdünnen Sie Kaninchen-anti-Calbindin im Verhältnis 1 zu 1000, um Per-Kinji-Zellen selektiv sichtbar zu machen, und monoklonalen anti-new N im Verhältnis 1 zu 500, um Granulazellen in der Blockierungslösung selektiv sichtbar zu machen.

Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei vier Grad Celsius unter schwacher Agitation damit. Am nächsten Tag spülen Sie die Kulturen dreimal mit 0,1 molarer Phosphatpufferlösung aus und verdünnen die sekundären Antikörper. Ziegen-anti-Kaninchen, Alexa 568 und Ziegen-anti-Maus, Alexa 488 im Verhältnis 1:500 in 0,1 molarer Phosphatpufferlösung mit 0,1 % Triton X-100.

Inkubieren Sie die Kulturen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur damit. Nachdem Sie die Kulturen dreimal mit Phosphatpuffer gespült haben, entfernen Sie die Färbeschnitte mit einem Pinsel aus der Kulturmulde und bringen Sie auf Super-Frost-plus-Glasobjektträgern auf. Legen Sie die Deckgläser mit einem geeigneten Einbettmedium auf.

Danach die Kulturen an einem herkömmlichen Mikroskop mit Epifluoreszenz-Ausrüstung oder an einem konfokalen Mikroskop mit der fluoreszenten Markierung von Bikini-Zellen betrachten. Die Größe des dendritischen Baums einer bestimmten Zelle kann leicht gemessen werden, wenn der Baum sich nicht mit anderen Zellen überlappt. Sobald eine Bikini-Zelle mit einem nicht überlappenden dendritischen Baum identifiziert ist, wird sie mit dem 20×-Objektiv betrachtet.

Ein Bild wird mit einer digitalen Kamera aufgenommen und anschließend mit einem Bildanalyseprogramm ausgewertet. In unserem Labor wird Image Pro Plus verwendet. Es ermöglicht, den dendritischen Baum der Zelle mit einem einzigen Mausklick zu umreißen.

Mithilfe des Zauberstab-Werkzeugs im Messmodus berechnet das Programm anschließend die von dem dendritischen Baum bedeckte Fläche und exportiert diese nach Ms. Xl. Anschließend erfolgt die statistische Analyse der Daten mit der GraphPad-Prism-Software hinsichtlich der Anzahl der Verzweigungsstellen. Aufgrund der stark verzweigten und feinen Morphologie der Kinji-Zellen-ENDR-Bäume müssen diese manuell gezählt werden. Die 20×-Bilddatei der Kinji-Zellen wird mithilfe von Adobe Photoshop so herangezoomt, dass sie den größten Teil des Bildschirms einnimmt.

Dann wird jeder Verzweigungspunkt gezählt und mit einem roten Punkt markiert. Die identifizierten Bikini-Zellen waren wiederholt fotografiert worden, um das Wachstum des dendritischen Baums zu überwachen. Von Tag zwei bis Tag sieben zeigte sich ein kontinuierliches Wachstum der Dendritenverzweigungen.

Von div vier bis div 11 hatte sich der dendritische Baum erheblich ausgedehnt. Dargestellt sind hier Beispiele für die Hemmung der dendritischen Baum-Entwicklung der Bikini-Zelle durch p KC oder mgl R eins, Stimulation A und D zeigen unbehandelte Kontrollzellen mit einem gut entwickelten dendritischen Baum. Nach neun Tagen PMA-Behandlung erscheinen die Dendriten verdickt, und der dendritische Baum ist stark in der Größe reduziert, wie in BNE gezeigt.

Andererseits zeigen die CNF, dass nach neun Tagen DHPG-Behandlung der dendritische Baum stark in seiner Größe reduziert war. Im Gegensatz zur PMA-Behandlung waren an den primären und sekundären Dendriten zahlreiche sehr feine und kurze Seitenäste vorhanden.

Die quantitativen Messungen hier zeigen, dass sowohl die Größe des dendritischen Baums im oberen Balkendiagramm als auch die Anzahl der Verzweigungspunkte im unteren Balkendiagramm nach PMA- oder DHPG-Behandlung stark reduziert waren; die Unterschiede zwischen den kontrollierten dendritischen Bäumen und den dendritischen Bäumen von Bikini-Zellen aus behandelten Kulturen waren signifikant. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie die Elektrophysiologie durchgeführt werden, um weitere Fragen hinsichtlich der funktionellen Auswirkungen einer veränderten Morphologie des dendritischen Baums zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische zerebelläre Schnittkulturen aufbaut und wie man Kina-Zellen und Morphologie analysiert.