Name: Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die CLEM-Technik zur Visualisierung mikroinjizierter Moleküle in Säugetierzellen. Diese Methode kombiniert Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie für hochaufgelöste Bildgebung subzellulärer Strukturen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Mitglieder der Alto Labor für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch der molekularen und zellulären Imaging Facility am UT Southwestern Medical Center, speziell Dr. Chris Gilpin, Tom Januszewski und Laurie Mueller für technische Kompetenz und Beratung. Wir danken auch Dr. Xionan Dong für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch NIH AI083359 um NMA unterstützt

Ein. Mammalian Cell Culture <ol><li> Normale Rattenniere (NRK), immortalisierten Gebärmutterhalskrebs (HeLa) oder andere geeignete Säugerzelllinien werden bei 37 ° C, 5% CO 2, unter photogeätzten Glas gerasterten Deckgläser befestigten Geschirr Zelle lebt (siehe Tabelle 1 für jede Reagenz oder Vorrichtung in diesem Protokoll verwendet) in DMEM + 10% FBS und 1% Pen / Strep. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine sterile Umgebung beizubehalten, wenn die Arbeit mit kultivierten Säugetierzellen werden. </li><li> Je nach Ihrer Versuchszeit-line (0-5 Stunden vs 1-2 Tage nach der Injektion) die Konfluenz der Zellen sollte ~ 50% eingestellt werden oder ~ 25% betragen. </li></ol> 2. Mikroinjektion <ol><li> Planen gewünschte Protein, DNA, oder kleinen Molekülen in der Wahl der Puffer in Abhängigkeit von ihrer Zugänglichkeit für Zellkultur, zu einem Endvolumen von ~ 50 pl. Inerten fluoreszierenden Farbstoffen wie Texas Red oder Cascade Blueenthalten sind, um die mikroinjizierten Zellen kennzeichnen; Wahl der Injektion Farbstoff und fluoreszierende Sonde sollte nicht überlappenden Anregungs-und Emissionswellenlängen haben. Die Konzentration des Moleküls von Interesse für die Mikroinjektion benötigt sollte empirisch bestimmt werden, und die fluoreszierenden Farbstoffe werden üblicherweise Tracking bei 0,5-1,0 mg / ml verwendet. Typischerweise wird Rhodamin oder ein anderer Fluorophor kovalent an dein Molekül von Interesse unter Verwendung eines kommerziellen Kits befestigt jedoch andere Verfahren zur Detektion verwendet werden, können je nach Empfindlichkeit werden. Für weitere Informationen, siehe Kritische Überlegungen unten. </li><li> Filtern Sie die Injektionsmittel (~ 50 ul) durch einen 0,22 um Zentrifugalfilter. Centrifugal Filter werden über Vakuum und / oder Spritze Filtration, die Totvolumina zugeordnet haben bevorzugt. </li><li> Um die Mikroinjektionsnadel erzeugen, werden Borosilikatglas Pipetten zog mit einem flammenden-Brown Feinpipettenziehvorrichtung folgenden Herstellern Richtlinien. Alternativ MikroinjektionNadeln können von Anbietern wie Eppendorf, die Femtotip Mikroinjektion Nadeln macht erworben werden. </li><li> Sorgfältig pipettieren 4 ul Injektionsmittelkammer in die unbehelligt Ende des Mikroinjektionsnadel mit Eppendorf 20 Femtotips. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen innerhalb des herausgezogen Mikroinjektionsnadel sind. Legen Mikroinjektionsnadel in den Mikromanipulator Arm des Eppendorf FemptoJet InjectMan an einem inversen Mikroskop. Für einen guten Überblick über die Mikroinjektion Verfahren wird der Leser auf einen früheren Journal of Visualized Experiments Artikel 8 gerichtet. </li><li> Zeigen live cell Teller mit Gitternetz Deckglas und kultivierten Zellen in der Schale Inhaber des invertierten Zeiss-Mikroskop. Finden wachsenden Zellen innerhalb eines fotogeätzten Netz und beachten Sie den Gittern alphanumerische Kennung, wird diese in allen nachfolgenden Schritten verwendet werden. Idealerweise lokalisieren Zellen in der Mitte des Deckplättchens als nachfolgende Schritte werden Probentransfer an den Kanten des Deckglases begrenzt. </li><li> Manuell unteren Injektionsarm einrastet über dem Deckglas und Verwenden des Mikromanipulators Joystick und Steuerelemente, niederes Injektionsnadel nach unten, bis die Spitze sanft berührt die Oberfläche der kultivierten Zellen und drücken &#39;Limit, um eine Bewegung der Nadel über diesen Punkt hinaus zu verhindern und so brechen die zerbrechliche gezogen Borosilikatglas. Alle anderen Aspekte der Zell-Mikroinjektion werden nach Eppendorf FemtoJet InjectMan Bedienungsanleitung durchgeführt. Die Mikroinjektionstechnik wurde kürzlich verwendet, um einzelne abgesondert Virulenzproteine ​​von Bakterien 9 verstehen. </li><li> Microinject jeder anderen Zelle innerhalb des gewählten Gitters. Mit Zellen bei ~ 50% Konfluenz gezüchtet, kann man erwarten ~ 80 Zellen pro 600 um 2 Rasters (Beispiel in gezeigt. 3A). Daher wird bei Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie Inspektion, wird es eine n von ~ 30-40 Versuchs-und Kontrollgruppen Zellen sein. </li><li> Zeigen live-cell Teller zurück in Säugetier-Zellkultur-Inkubator für die gewünschteZeit diktiert durch die Versuchsanordnung. Alternativ kann man unmittelbar aus Mikroinjektion Zeitraffer-Mikroskopie-Analyse, um das Aussehen von besonderer subzellulären Strukturen von Interesse vor der Fixierung zu erwarten. </li></ol> 3. Fluorescent Microscopy <ol><li> Falls gewünscht, durchzuführen lebenden Zellen Zeitraffer Fluoreszenzmessungen von mikroinjizierten Zellen, wonach die Stelle der Medien mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Wenn jedoch Messungen lebenden Zellen nicht erforderlich sind, zu verwerfen Zellwachstumsmedium und fixieren die Zellen mit 5 ml 3,7% Formaldehyd in 1xPBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Fixiermittel und ersetzen mit 5 ml 1xPBS, fahren 3,2 fort. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu Glutaraldehyd erst nach Fluoreszenzmikroskopie ist komplett hinzuzufügen. </li><li> Legen Sie die Live-Cell-Teller mit fotogeätzten gridded Deckglas in einem Fluoreszenzmikroskop (konfokale ist nicht für thi erforderlichs Schritt) und sammeln 5-10 Hellfeld und fluoreszierenden Bildern des entsprechenden Gitters, um die Anordnung der Zellen (Abb. 4A) dokumentieren. Identifizieren derjenigen Zellen mikroinjiziert worden sind mit den Anregungs-und Emissionswellenlängen des inerten Farbstoffs Injektion (4B). Es ist wichtig, um Bilder in verschiedenen Vergrößerungen (zB 10x und 65x) zu erhalten, um die Identifikation von mikroinjizierten Zellen in nachfolgenden Schritten mit Elektronenmikroskopie erleichtern. </li><li> Mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop, sammeln ein Z-Stapel mikroinjizierten Zellen innerhalb des Gitters in Schritt 2.5 oben identifiziert. Hoher Vergrößerung (100x) wird benötigt, um Fluoreszenzbilder mit subzellulären Strukturen, die in der Elektronenmikroskopie ermittelt werden korrelieren. </li><li> Die Deckgläser werden vom Boden der Lebendzelldichte Gerichte mit handelsüblichen Entschichtungsflüssigkeit Deckglas entfernt und Zell-Seite nach oben in einem unberührten Zellkulturschale enthaltend 5 ml1xPBS. Das Deckglas wird dann für die Elektronenmikroskopie verarbeitet wie unten. </li></ol> 4. Transmission Electron Microscopy <ol><li> Ersetzen 1xPBS Puffer mit 2 ml 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Längere Inkubationszeit, die zwar nicht notwendig, wird in der Instandhaltung von subzellulären Strukturen zu unterstützen. Hinweis: Formaldehyd allein ist keine ausreichende Fixativ für EM-Analyse. </li><li> Entfernen Fixiermittel und Beize Zellen mit der Zugabe von 2 ml 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylat-Puffer für 30 min mit drei Waschungen mit Cacodylatpuffer und schließlich gefolgt ersetzen aller Puffer mit ddH 2 O. </li><li> Nach Standard-EM-Protokolle, dehydrieren die Probe in einer abgestuften (70% bis 100%) Reihe von Ethanol. Bereiten Epon Harz und Deckglas Zell-Seite nach unten auf die Oberseite eines Epon Harz gefüllten Röhre. Erlauben Polymerisation für 24 Stunden bei 60 ° C. Indem Sie die fotogeätzten gridded Deckglas Zell-Seite zu tunwn auf die Epon Harz, wird sowohl die Zellen von Interesse als auch die Gittermuster der Epon Harzes während der Polymerisation überführt (Beispiel in gezeigt. 3B). </li><li> Entfernen von Deckgläsern Epon Harz durch schnell Eintauchen in flüssigen Stickstoff und / oder kochendem Wasser. Überprüfen Sie die Oberfläche des Harzes unter einem Binokular Dissektion Rahmen, um das Raster von Interesse (Hinweis: Das Gitter patter wird als Spiegelbild zu übertragen) zu lokalisieren. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder Skalpell, trim die Epon Block unten, so daß nur das Raster des Interesses an der Spitze der Epon Harzblock ist. </li><li> Verwendung Ultramikrotom erwerben Schnittserien des beschnittenen Block an der gewünschten Dicke (~ 70 nm Dicke für konventionelle TEM und ~ 250 nm Dicke zum tomographischen TEM). Kontrast in den Abschnitten mit Uranylacetat und Bleicitrat nach Standardprotokollen. </li></ol> 5. Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie <ol><li> Verlagern die Zellen von Interesse indas Elektronenmikroskop unter Verwendung von Bildern in früheren Schritten erhalten. Sobald mikroinjiziert Zellen von Interesse lokalisiert wurden, verwenden Sie die hochauflösenden konfokalen Fluoreszenz-Bildern auf Regionen innerhalb der Zelle, die von Interesse waren identifizieren. Bild diese in hoher Auflösung mittels TEM. Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Zelle Peripherie und der Kernhülle zu bestimmen, welche fluoreszierende z-Stapel-Bild auf die EM schneiden entspricht. </li><li> Mit der Imaging-Programm Ihrer Wahl (zB Image J, Adobe Photoshop, etc.), reduzieren Sie die Deckkraft der Fluoreszenzbild zu 50% und überlagern sie auf die TEM-Aufnahme, mit denen sie korreliert. Ausrichten der Bilder durch Anpassung der Skala (erinnern Sie Proportionen) und die Drehung des konfokalen Bild, um das TEM-Bild entsprechen. Feineinstellungen Kontrast, Schärfe, usw. in dem fluoreszierenden Bild kann in der Ausrichtung zu unterstützen. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Heterochromatin, die Kernhülle und die Zellperipherie eine ausgezeichnete Sehenswürdigkeiten von Beihilfe darstellenin der Ausrichtung der beiden Bilder. </li></ol> 6. Kritische Überlegungen <ol><li> Stark beim Lokalisieren des injizierten kleinen Moleküls zu unterstützen, kann ein Fluoreszenz-Tag wie Rhodamin oder Fluorescein kovalent gebunden werden mit kommerziell erhältlichen Kits. Zusätzliche Informationen werden von ektopisch eine fluoreszierende subzelluläre Lokalisation Markerprotein vor Mikroinjektion gewonnen. Daher ist die Wahl der Fluorophore und inerten Mikroinjektion Markierungsfarbstoff wichtig. </li><li> Wählen Zellen, die für die Mikroinjektion Anhaften der Nähe des Zentrums des Deckplättchens sind und um die Wahl eines Rasters randnah. Daraufhin wird die größte Wahrscheinlichkeit, daß die Zellen von Interesse für die Epon Harz für Elektronenmikroskopie eingesetzt werden übertragen. </li><li> Konfluenz der Zellen iWichtig ist, wie ein voll konfluenten Platte wird Identifizierung von mikroinjizierten Zellen im Elektronenmikroskop sehr erschweren. Vielmehr Saatzellen so dass sie erreichen ~ 50% Konfluenz am Tag kurzer Experiment oder ~ 25% Konfluenz am Tag der längere (1-2 Tage) Experiment. Verwenden Sie die Position und die Form der Zellen sowie die &quot;leeren Raum als Landmarken zur Orientierung der Elektronenmikroskopie Bild. </li><li> Konfokale optische Schnittdicke sollte den Bedürfnissen des Experiments abgestimmt werden und sollten deshalb empirisch ermittelt werden 10. </li><li> Die Fixative Formaldehyd und Glutaraldehyd sollte von höchster Qualität zur Verfügung stehen. Formaldehyd wird fix die Zellen, aber bewahren die Fluoreszenzeigenschaften von beiden Proteinen und kleinen fluoreszierenden Moleküle (wie Rhodamin oder FITC). Es wird jedoch nicht erhalten, um die Strukturen hoher Auflösung EM erlauben. Glutaraldehyd bewahrt Membranen und subzellulären Strukturen zu einem hohen Grad für EM Analysesis, wird aber erheblich behindern Fluoreszenz. Daher ist das Zwei-Schritt-Fixierung kritischen sowohl Fluoreszenz-Mikroskopie und EM. Der Formaldehyd Fixierungsschritt kann, wenn die live-Zell-Messungen entfallen, als endgültige Fixierung durch Behandlung Glutaraldehyd durchgeführt werden kann. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, ein Molekül von Interesse direkt in die eukaryotische Zytoplasma Bereitstellung und Überwachung ihrer Lokalisation und / oder Effekte auf zellulärer und organeller Architektur von Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus und das Verfahren ist in Abbildung 2 gezeigt. Diese Technik beruht auf Mikroinjektion von Zellen auf einem Laser-geätzte Glas gerasterten Deckplättchens (3A), die nach der konfokalen Mikroskopie, in der Lage ist, sowohl die interessierenden Zellen sowie das Gittermuster der Epon Resin Transfer gezüchtet (Abb.3B). Ein typisches Mikroinjektion CLEM Verfahren ergibt Fluoreszenz-Bildern und elektronenmikroskopische Aufnahmen, die beim korreliert, ermöglichen sowohl subzellulären Lokalisation und ultrastrukturelle Analyse. Zellen auf einer gerasterten photogeätzten Glas Deckplättchens gezüchtet werden mit einem Molekül von Interesse, nach der Hellfeld-Bilder erhalten werden (Abb. 4A) mikroinjiziert. Eine inerte Markierungsfarbstoff eingebaut wird, um mikroinjizierten Zellen von nicht-mikroinjizierten Zellen (4B) zu unterscheiden. Konfokalen z-Stapel werden erhalten unter Verwendung eines Fluorophor oder eine andere Kennung an der mikroinjizierten kleines Molekül von Interesse (4C). Die Probe wird mit Glutaraldehyd fixiert und für die Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopische Aufnahmen erhalten werden und auf die Zellen, denen sie entsprechen, (4D) überlagert. Bereiche beherbergen Fluoreszenzsignale werden ausführlicher in höherer Vergrößerung inspiziert (4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Timeline der Mikroinjektion CLEM Verfahren. Je nach der Versuchsanordnung kann Mikroinjektion und Fluoreszenzmessungen am gleichen Tag vorgenommen werden. Herstellung der Probe für die Elektronenmikroskopie ist zeitaufwändigste aufgrund langer Inkubationen Schritte und dauert 2-3 Tage. TEM-Analyse und Korrelation Fluoreszenzsignale mit Elektronenmikroskopie Bilder können an einem Tag durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 Allgemeine Darstellung der Mikroinjektion CLEM Schritt 1:.. Suchen wachsenden Zellen auf Laser-geätzten Glas gridded Deckglas und microinject Molekül von Interesse. Schritt 2:. Erfassung sowohl Hellfeld-Bildern und konfokale Fluoreszenz-z-Stapel mikroinjizierten Zellen Schritt 3: vorbereitenDeckglas für EM-Analyse und betten in Epon Harz. Mit transferiert Raster, Trimmblock, so dass Zellen von Interesse sind an der Spitze. Schritt 4: Schneiden Sie serielle Abschnitte mit Ultramikrotom. Schritt 5: Korrelation fluoreszierende Bilder mit EM Bildern. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> . Abbildung 3 Grid-Muster erleichtert die Identifizierung von Zellen von Interesse Panel A zeigt die Mikroinjektion von Zellen gezüchtet, um ~ 50% Konfluenz;. Beachten Sie das Gitter Kennung aK. Maßstabsbalken 100 um ist. Tafel B zeigt das übertragene Gittermuster aus dem Deckglas auf dem polymerisierten Harz Epon Block, sektioniert wird seriell hinter das Gitter von Interesse in einer Dissektionsmikroskop identifiziert wird. Tafel C zeigt das übertragene Gittermuster in Vorbereitung zur Sektionierung . Beachten Sie, dass die übertragenen Grid patter in umgekehrter auf dem Harz Block; scale Bar ist 1200 um. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> .. Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie Panel A zeigt die Hellfeld-Aufnahme NRK wachsenden Zellen auf einem Laser-geätzten Glas gridded Deckglas; Pfeile zeigen zwei Zellen, visualisiert durch CLEM in Platten CD sind Panel B zeigt die Fluoreszenz. des inerten Markierungsfarbstoff, in diesem Fall Cascade Blue, verwendet wurden, um Zellen zu identifizieren, mikroinjiziert. Tafel C zeigt die Überlagerung von Hellfeld und die Fluoreszenz Signatur eines Rhodamin-markierte kleine Molekül. Die beiden Zellen sind hier dargestellt durch Pfeile in Abb. A &amp; B. Tafel D darstellt CLEM von Hellfeld, fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie ergab;. Pfeilspitze zeigt fluoreszierenden puncta abzubildenden bei höheren Vergrößerung im Panel E Maßstabsbalken sind wie folgtTiefen: Panels A &amp; B, 100 &amp;mgr; m; C &amp; D, 50 um; E, 100 nm.

<ol><li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li>
<li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells%2C+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Anat%22%5BJournal%5D)">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li>
<li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li>
<li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li>
<li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li>
<li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+%28FSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325(2009).</li>
<li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li>
<li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemwogerere%2C+D+%22Confocal+Microscopy+in+Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%22">Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering</a>. , Taylor and Francis. London. (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt werden.

Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die direkte Abgabe des gereinigten Proteinen, Nukleinsäuren, oder kleinen Molekülen an die eukaryotischen Zytoplasma und liefert ultrahochauflösende Analyse durch die Korrelation von fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust und kann in-house mit vielen bestehenden Core Facilities und / oder entsprechend ausgestattete Elektronenmikroskopie Labors durchgeführt werden. Die Technik eignet sich auch, um Live-Zelle, so dass der...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Fotoätzteile Coverslip und Live-cell Platte </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texasrot </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um Zentrifugalfiltration Einheit </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Pipetten </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td><td> Mit dem Programm # 4 nach Durchführung Ramp Test </td></tr><tr><td> FemtoJet Mikroinjektions-System </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip Removal Flüssigkeit </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmission Electron Microscope </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

korrelative licht-und elektronenmikroskopie (clem) als werkzeug zur visualisierung mikroinjiziert moleküle und ihre eukaryotic sub-zellulären targets

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Die eukaryotische Zelle beruht auf komplexen, stark regulierten und funktionell unterschiedlichen membrangebundene Kompartimente eine biochemische Polarität notwendig für korrekte zelluläre Funktion zu bewahren. Verstehen, wie die Enzyme, Proteine ​​und Zytoskelett-Komponenten und regeln pflegen diese biochemischen Segregation ist daher von größter Bedeutung. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Moleküle und / oder stören subzellulären Kompartimenten hat eine Fülle von Wissen nachgegeben und zu unserem Verständnis der zellulären Regulation lokalisieren. Bildgebende Verfahren wie fluoreszierende und konfokale Mikroskopie machen Ermittlung der Position eines fluoreszierend markierten Kleinmolekül relativ einfach, jedoch wird die Auflösung des sehr kleinen Strukturen 1 begrenzt. Auf der anderen Seite hat Elektronenmikroskopie Einzelheiten subzellulären Morphologie bei sehr hoher Auflösung offenbart, sondern seine statische Natur erschwert hochdynamischen Pro messenProzesse mit Präzision 2,3. So ergibt die Kombination von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie der gleichen Probe, genannt Korrelative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, die zwei Vorteile ultraschnellen Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Auflösung der Elektronenmikroskopie 6. Diese leistungsstarke Technik wurde eingeführt, um viele Aspekte der Zellbiologie 5,7 studieren. Seit seiner Gründung hat sich dieses Verfahren unsere Fähigkeit zur subzellulären Architekturen und Morphologien in hoher Auflösung zu unterscheiden erhöht. Hier präsentieren wir eine optimierte Methode zur raschen Durchführung Mikroinjektion von CLEM (Abb. 1) gefolgt. Die Mikroinjektion CLEM Verfahren kann verwendet werden, um bestimmte Mengen von kleinen Molekülen und / oder Proteine ​​direkt in der eukaryotischen Zelle Zytoplasma einzuführen und die Wirkungen von Millimeter zu Multi-Nanometer-Auflösung (Abb. 2). Die Technik basiert auf der Grundlage MikroinjizierenZellen auf Laser Ätzglas gerasterten Deckgläser befestigt an der Unterseite der Lebendzelldichte Geschirr und Bildgebung sowohl konfokale Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie gewachsen. Lokalisierung der Zelle (n) von Interesse vom Gittermuster, die leicht übertragen wird, zusammen mit den Zellen von Interesse zur Epon Harz zur Immobilisierung von Proben verwendet und Schaltstellen vor elektronenmikroskopische Analyse (Abb. 3) erleichtert. Überlagerung von Fluoreszenz-und EM-Bilder ermöglicht dem Benutzer, die subzelluläre Lokalisation sowie jegliche morphologischen und / oder ultrastrukturelle Veränderungen durch die mikroinjizierten Molekül von Interesse (Abb. 4) induziert wird. Diese Technik ist zugänglich Zeitpunkten von ≤ 5 s bis zu einigen Stunden, abhängig von der Natur des mikroinjizierten Probe.

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Die eukaryotische Zelle ist auf komplexe, hochregulierte und funktionell differenzierte membrangebundene Kompartimente angewiesen, welche eine biochemische Polarität aufrechterhalten ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fluoreszenzmarkierte kleine Moleküle oder Proteine in das Zytoplasma einer kultivierten Säugetierzelle einzubringen und die induzierten morphologischen Veränderungen mit einer Auflösung im Bereich von Mikrometer bis hin zu mehreren Nanometern zu beobachten. Dazu werden zunächst Säugetierzellen auf strukturierten Glas-Deckgläsern kultiviert und anschließend mittels Mikroinjektion mit einem fluoreszenzmarkierten kleinen Molekül oder Protein der Wahl injiziert. Danach werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und abgebildet.Anschließend werden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert, geschnitten, gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet. Schließlich werden die Aufnahmen aus der Fluoreszenz-Brightfield-Mikroskopie und der Elektronenmikroskopie kombiniert und ausgerichtet. Letztendlich ermöglicht die Korrelation dieser Bilder die hochauflösende Abbildung von durch das Molekül oder Protein der Untersuchung hervorgerufenen Veränderungen.Hallo, ich bin Dr. Evan Reddick im Labor von Dr. Neil Alto in der Mikrobiologie-Abteilung des University of Texas Southwestern Medical Ce

correlative-light-electron-microscopy-clem-as-tool-to-visualize

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

Wir entwickeln eine neue Technik in der Elektronenmikroskopie, „flash-and-freeze“, die die Visualisierung von Membrandynamik mit ms zeitlicher Auflösung ermöglicht. Diese Technik kombiniert die optogenetische Stimulation von Neuronen, die mit Hochdruck-Einfrieren. Hier haben wir die Verfahren zeigen, und die Protokolle im Detail beschreiben.

Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.

Epon Post Embedding Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Verfahren schnell Bildschirm Wirtspflanze flüchtigen Stoffe durch Messung der elektrophysiologische Reaktion von erwachsenen Nabel orangeworm...

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Erfahren Sie die CLEM-Technik zur Visualisierung mikroinjizierter Moleküle in Säugetierzellen. Diese Methode kombiniert Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie für hochaufgelöste Bildgebung subzellulärer Strukturen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets (Video) | JoVE Journal

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Weitere Videos entdecken