Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, fluoreszenzmarkierte kleine Moleküle oder Proteine in das Zytoplasma einer kultivierten Säugetierzelle einzuführen und die induzierten morphologischen Veränderungen von Mikrometer- bis Multi-Nanometer-Auflösung zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst Säugetierzellen auf gegitterten Glasdeckgläsern kultiviert und ihnen ein fluoreszenzmarkiertes kleines Molekül oder Protein von Interesse mikroinjiziert wird. Anschließend werden die Zellen in Formaldehyd fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und abgebildet.

Dann werden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert, geschnitten, gefärbt und elektronenmikroskopisch abgebildet. Schließlich werden Bilder, die während der Hellfeld-Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie aufgenommen wurden, kombiniert und ausgerichtet. Letztendlich ermöglicht die Korrelation dieser Bilder dem Forscher, Störungen mit hoher Auflösung abzubilden, die durch das interessierende kleine Molekül oder Protein hervorgerufen werden.

Hallo, ich bin Dr. Evan Reddick im Labor von Dr. Neil Alto in der Abteilung für Mikrobiologie am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas. Heute spreche ich mit Ihnen über das M Clem Verfahren oder die Mikroinjektions-Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber eigenständigen Techniken wie Mikroinjektion oder Mikroskopie besteht darin, dass sie hier gemeinsam durchgeführt werden und mit Hilfe eines gerasterten Glasdeckglases verwendet werden.

Es ist dieses gitterförmige Deckblatt, das es den Forschern ermöglicht, während verschiedener Teile des Protokolls zu derselben Zelle zurückzukehren. Darüber hinaus bietet diese Technik dem Forscher die Möglichkeit, subzelluläre Architekturveränderungen von einer Vielzahl von injizierbaren kleinen Molekülen oder Proteinen von Interesse zu beobachten, und zwar mit einer Auflösung von Mikrometern bis zu mehreren Nanometern. Zur Vorbereitung auf die Mikroinjektion werden Zellen wie normale Rattennieren, Nieren oder immortalisierte Gebärmutterhalskrebszellen auf fotogeätzten Glasgitter-Deckgläsern in zwei lebenden Zellschalen inkubiert, die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert.

Abhängig vom zu verwendenden Versuchszeitplan passen Sie die Kofluenz der Zellen an. Eine vollständig konfluente Platte wird die Identifizierung von mikroinjizierten Zellen im Elektronenmikroskop sehr schwierig machen. Daher erreichen Samenzellen wie sie am Tag eines kurzen Experiments etwa 50 % co-Flüssigkeit und etwa 25 % co-Flüssigkeit.

Bereiten Sie am Tag eines längeren Experiments fluoreszenzmarkierte Protein-DNA oder kleine Moleküle im entsprechenden Puffer auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern vor. Je nach gewähltem Fluor-Ofor fügst du einen Tracking-Farbstoff wie Texas Red oder Cascade Blue hinzu. Fügen Sie eine Konzentration von 0,5 bis einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Zentrifugalfilter. Nachdem Sie die Mikroinjektionsnadeln gemäß den Herstellerrichtlinien gezogen haben, pipettieren Sie vorsichtig nach Mikrolitern Lösung in den hinteren Teil einer Nadel. Legen Sie die Nadel in den Mikromanipulatorarm eines kommerziellen Mikroinjektionsgeräts ein, das an einem inversen Mikroskop befestigt ist.

Stellen Sie eine Schale mit kultivierten Zellen in den Schalenhalter des inversen Mikroskops. Suchen Sie nach Zellen, die in einem fotogeätzten Raster wachsen, und notieren Sie sich die alphanumerische Kennung des Rasters. Diese wird in allen nachfolgenden Schritten verwendet.

Es ist wichtig, Zellen für die Mikroinjektion zu wählen, die nahe der Mitte des Deckglases geklebt werden, und solche in der Nähe der Peripherie zu vermeiden. Dies ist wichtig, da es eine effiziente Übertragung Ihrer interessierenden Zellen auf das Eponharz-Mittelstück gewährleistet, das später für die Elektronenmikroskopie verwendet wird. Manuell, senken Sie den Injektionsarm manuell über den Deckglas ab und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel abzusenken, bis die Spitze die Oberfläche der Zellen sanft berührt. Mikroinjizieren Sie jede zweite Zelle innerhalb des gewählten Gitters für Zellen, die mit einer Flanz von etwa 50 % Co gezüchtet werden, erwarten Sie etwa 80 Zellen pro 600 Quadratmikrometer-Raster, was ein N von etwa 30 bis 40 experimentellen und kontrollierten Zellen ergibt.

Stellen Sie die Schale nach der Injektion für die gewünschte Zeit wieder in den Inkubator, um die Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und fixieren Sie die Zellen mit Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Ersetzen Sie das Fixiermittel durch ein XPBS.

Dokumentieren Sie dann die Anordnung der Zellen, indem Sie fünf bis 10 Hellfeldbilder des gewählten Gitters bei niedriger und hoher Vergrößerung aufnehmen. Um die mikroinjizierten Zellen zu identifizieren, nehmen Sie Fluoreszenzbilder bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen des inerten Injektionsauges auf. Nehmen Sie mit einem konfokalen Mikroskop eine Reihe von Bildern von mikroinjizierten Zellen mit hoher Vergrößerung innerhalb desselben zuvor abgebildeten Gitters auf.

Eine hohe Vergrößerung ist erforderlich, um Fluoreszenzbilder mit subzellulären Strukturen zu korrelieren, die mit Hilfe der Elektronenmikroskopie identifiziert werden sollen. Verwenden Sie nach der konfokalen Bildgebung eine Flüssigkeit zum Entfernen des Deckglases, um das Deckglas von der Schale zu trennen, und legen Sie es mit der Zellseite nach oben in eine frische Kulturschale mit einem XPBS. Fahren Sie mit der Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie fort.

Befolgen Sie die Standard-EM-Protokolle. Um den Fleck zu fixieren und die Proben zu dehydrieren, bereiten Sie Eponharz vor und legen Sie den Deckglasschieber mit der Zellseite nach unten auf ein mit Äonharz gefülltes Röhrchen. Lassen Sie das Harz 24 Stunden lang bei 60 Grad Celsius polymerisieren.

Zum Entfernen des Deckglases vom Eponharz. Tauchen Sie es schnell in flüssigen Stickstoff. Der Temperaturschock von 60 Grad Celsius auf minus 196 Grad Celsius.

Löst den Deckglas von der Harztube. Warten Sie fünf bis 10 Minuten und holen Sie dann den Schlauch heraus, der jetzt frei vom Deckglas ist. Untersuchen Sie unter einem Präparierbereich die Oberfläche des Harzes, um das gewünschte Gitter zu lokalisieren.

Schneiden Sie den Epon-Block mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell so ab, dass sich nur das interessierende Gitter an der Spitze des Blocks befindet, mit einem ultramikrotonen geschnittenen seriellen Schnitt des getrimmten Blocks Verwenden Sie Urinalacetat und Bleicitrat, um die Abschnitte unter Verwendung von Standardprotokollen zu kontrastieren. Verschieben Sie die gewünschten Zellen im Elektronenmikroskop anhand der relativen Positionierung der Zellen als Richtlinie. Unter Verwendung der hochauflösenden Fluoreszenzbilder, die zuvor aufgenommen wurden.

Identifizieren Sie interessante Bereiche in der elektronenmikroskopischen Aufnahme, die dem Fluoreszenzsignal entsprechen. Verwenden Sie Orientierungspunkte wie die Position des Heterochromatins und die Kernhülle, um zu bestimmen, welches fluoreszierende Zack-Bild der EM-Schicht entspricht. Wenn Sie derzeit mit einem Bildbearbeitungsprogramm wie Image J oder Adobe Photoshop abgebildet werden, reduzieren Sie die Deckkraft des fluoreszierenden Bildes auf 50 % und überlagern Sie es mit dem entsprechenden TEM-Bild.

Richten Sie die Bilder aus, indem Sie den angezeigten Maßstab anpassen. Hier sind die Ergebnisse der Mikroinjektion und der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie. Dieses Bild zeigt die Hellfeldaufnahme von NRK-Zellen, die auf einem lasergeätzten Glasgitterdeckglas wachsen.

Beachten Sie die Hintergrundbuchstaben b und m, die zur Identifizierung des Rasters mit injizierten Zellen verwendet werden. Pfeile zeigen die beiden Zellen, die mit der Elektronenmikroskopie identifiziert und abgebildet wurden. Hier ist ein Fluoreszenzbild des inerten Tracking-Farbstoffs Cascade Blue zu sehen, der zur Identifizierung von mikroinjizierten Zellen verwendet wird.

Hier ist eine Überlagerung der Hellfeld- und Fluoreszenzsignale von aminmarkierten kleinen Molekülen. Dieses Panel stellt die Korrelation von Hellfeldfluoreszenz und Elektronenmikroskopie einer injizierten Zelle dar. Die Pfeilspitze zeigt fluoreszierende Punkte, die bei höherer Vergrößerung in diesem Bedienfeld abgebildet wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Protein von Interesse mikroinjiziert und seine subzellulären morphologischen Veränderungen verfolgt, die es mit dem Verfahren der Mikroinjektion Clem oder der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie induziert.