Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fluoreszenzmarkierte kleine Moleküle oder Proteine in das Zytoplasma einer kultivierten Säugetierzelle einzubringen und die induzierten morphologischen Veränderungen mit einer Auflösung im Bereich von Mikrometer bis hin zu mehreren Nanometern zu beobachten. Dazu werden zunächst Säugetierzellen auf strukturierten Glas-Deckgläsern kultiviert und anschließend mittels Mikroinjektion mit einem fluoreszenzmarkierten kleinen Molekül oder Protein der Wahl injiziert. Danach werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und abgebildet.

Anschließend werden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert, geschnitten, gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet. Schließlich werden die Aufnahmen aus der Fluoreszenz-Brightfield-Mikroskopie und der Elektronenmikroskopie kombiniert und ausgerichtet. Letztendlich ermöglicht die Korrelation dieser Bilder die hochauflösende Abbildung von durch das Molekül oder Protein der Untersuchung hervorgerufenen Veränderungen.

Hallo, ich bin Dr. Evan Reddick im Labor von Dr. Neil Alto in der Mikrobiologie-Abteilung des University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas. Heute werde ich mit Ihnen über das M-Clem-Verfahren, also die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie mittels Mikroinjektion, sprechen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber eigenständigen Techniken wie Mikroinjektion oder Mikroskopie liegt darin, dass hier beide Methoden kombiniert angewendet werden und durch die Verwendung eines mit Gittern versehenen Glas-Deckgläschens unterstützt werden.

Gerade dieser mit einem Raster versehene Deckel ermöglicht es den Forschern, während verschiedener Phasen des Protokolls immer wieder zur selben Zelle zurückzukehren. Außerdem bietet diese Technik die Möglichkeit, induzierte subzelluläre strukturelle Veränderungen durch eine Vielzahl injizierbarer kleiner Moleküle oder interessierender Proteine zu beobachten, und zwar mit einer Auflösung vom Mikrometer- bis in den Multinano-Bereich. Zur Vorbereitung der Mikroinjektion kultivieren Sie Zellen wie normale Rattennierenzellen oder immortalisierte Zervixkarzinomzellen auf photolithographisch strukturierten Glas-Deckeln, die auf Live-Cell-Dishs befestigt sind, und inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Je nach verwendetem experimentellen Zeitplan die Konfluenz der Zellen anpassen. Eine vollständig konfluente Platte erschwert die Identifizierung mikroinjizierter Zellen im Elektronenmikroskop erheblich. Daher sollten Zellen so ausgesät werden, dass sie am Tag eines kurzen Experiments etwa 50 % Konfluenz und bei längerer Versuchsdauer etwa 25 % Konfluenz erreichen.

Am Tag eines längeren Experiments fluoreszenzmarkiertes Protein, DNA oder kleine Moleküle in dem geeigneten Puffer auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern ansetzen. Je nach gewähltem Fluorophor einen Laufdye wie Texas Red oder Cascade Blue zugeben. Eine Konzentration von 0,5 bis 1 Milligramm pro Milliliter hinzufügen.

Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikrometer-Zentrifugalfilter. Nachdem Sie die Mikroinjektionsnadeln gemäß den Herstelleranweisungen gezogen haben, pipettieren Sie vorsichtig Mikroliter der Lösung in das hintere Ende einer Nadel. Setzen Sie die Nadel in den Mikromanipulatorarm eines kommerziellen Mikroinjektionsgeräts ein, das an ein invertiertes Mikroskop angeschlossen ist.

Platzieren Sie eine Schale mit kultivierten Zellen in den Schalenhalter des umgekehrten Mikroskops. Suchen Sie Zellen, die innerhalb eines fotolithografisch strukturierten Rasters wachsen, und notieren Sie die alphanumerische Kennung des Rasters. Diese wird in allen folgenden Schritten verwendet.

Es ist wichtig, Zellen für die Mikroinjektion auszuwählen, die nahe am Zentrum der Deckglasoberfläche haften, und Zellen am Rand zu vermeiden. Dies ist entscheidend, um einen effizienten Transfer der gewünschten Zellen in das später für die Elektronenmikroskopie verwendete Epon-Harz-Zentrumstück sicherzustellen. Senken Sie den Injektionsarm manuell über das Deckglas und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel so weit abzusenken, bis die Spitze sanft die Zelloberfläche berührt. Injizieren Sie im gewählten Raster jeweils jede zweite Zelle; bei einer Konfluenz von etwa 50 % können Sie etwa 80 Zellen pro 600 Quadratmikrometer-Raster erwarten, was eine Stichprobengröße von etwa 30 bis 40 experimentellen und kontrollierten Zellen ergibt.

Nach der Injektion die Schale für einen gewünschten Zeitraum in den Inkubator zurückstellen, um die Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Das Wachstumsmedium verwerfen und die Zellen bei Raumtemperatur 10 Minuten lang mit Formaldehyd in PBS fixieren. Das Fixativ durch ein XPBS ersetzen.

Dokumentieren Sie anschließend die Anordnung der Zellen, indem Sie fünf bis zehn Hellfeldaufnahmen des ausgewählten Gitters in niedriger und hoher Vergrößerung anfertigen. Um die mikroinjizierten Zellen zu identifizieren, nehmen Sie Fluoreszenzbilder bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen des inerten Injektionsfarbstoffs auf. Sammeln Sie mithilfe eines konfokalen Mikroskops einen Zack von Bildern der mikroinjizierten Zellen in hoher Vergrößerung innerhalb desselben zuvor abgebildeten Gitters.

Es ist eine hohe Vergrößerung erforderlich, um fluoreszierende Bilder mit subzellulären Strukturen korrelieren zu können, die anschließend mittels Elektronenmikroskopie identifiziert werden. Nach der konfokalen Bildgebung verwenden Sie eine Abdeckungsscheiben-Entfernungslösung, um die Abdeckungsscheibe von der Petrischale zu lösen, und legen Sie sie mit der Zellseite nach oben in eine frische Kulturschale, die ein XPBS enthält. Fahren Sie anschließend mit der Aufarbeitung für die Elektronenmikroskopie fort.

Seien Sie nach Durchführung der Standard-EM-Protokolle. Um die Proben zu fixieren, anzufärben und zu dehydrieren, bereiten Sie Epon-Harz vor und legen Sie die Deckglaszelle mit der Zellseite nach unten auf eine mit Epon-Harz gefüllte Kapillare. Lassen Sie das Harz 24 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren.

Um das Deckglas vom Epon-Harz zu entfernen, tauchen Sie es kurz in flüssigen Stickstoff ein. Der Temperaturschock von 60 Grad Celsius auf minus 196 Grad Celsius.

Löst die Deckglasplatte vom Harzröhrchen. Warten Sie fünf bis zehn Minuten, dann nehmen Sie das Röhrchen entgegen, das nun frei von der Deckglasplatte ist. Untersuchen Sie unter einem Stereomikroskop die Oberfläche des Harzes, um das gewünschte Raster zu finden.

Trimmen Sie den Epon-Block mit einem sterilen Rasiermesser oder Skalpell so, dass nur das gewünschte Raster an der Spitze des Blocks verbleibt, und schneiden Sie mit einem Ultramikrotom serielle Schnitte des getrimmten Blocks. Kontrastieren Sie die Schnitte mit Uranylessigat und Bleizitrat gemäß Standardprotokollen. Suchen Sie die gewünschten Zellen im Elektronenmikroskop unter Verwendung der relativen Positionierung der Zellen als Orientierungshilfe, wobei Sie die zuvor aufgenommenen hochauflösenden Fluoreszenzbilder nutzen.

Identifizieren Sie die Bereiche von Interesse im Elektronenmikrograf, die dem fluoreszenten Signal entsprechen. Verwenden Sie Orientierungspunkte wie die Position von Heterochromatin und der nuklearen Hülle, um zu bestimmen, welches fluoreszierende Zack-Bild der EM-Schnitt entspricht. Verringern Sie mit einem Bildverarbeitungsprogramm wie Image J oder Adobe Photoshop die Deckkraft des Fluoreszenzbilds auf 50 % und überlagern Sie es mit dem entsprechenden TEM-Bild.

Richten Sie die Bilder durch Anpassung der angezeigten Skala aus. Hier sind die Ergebnisse der Mikroinjektion und der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie. Diese Aufnahme zeigt den Hellfeldmikrographen von NRK-Zellen, die auf einer mit Laser geätzten, gitterförmig strukturierten Glas-Deckfolie wachsen.

Beachten Sie die Hintergrundbuchstaben b und m, die zur Identifizierung des Rasters mit injizierten Zellen verwendet werden. Pfeile zeigen die beiden identifizierten und mit Elektronenmikroskopie abgebildeten Zellen an. Gezeigt ist hier eine Fluoreszenzabbildung des inerten Markierungsfarbstoffs Cascade Blue, der zur Identifizierung der mikroinjizierten Zellen verwendet wurde.

Hier ist eine Überlagerung der Hellfeld- und Fluoreszenzsignale eines Amin-markierten kleinen Moleküls. Dieses Panel zeigt die Korrelation von Hellfeld-, Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie einer injizierten Zelle. Der Pfeil zeigt auf fluoreszierende Pünktchen, die in diesem Panel mit höherer Vergrößerung abgebildet wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Protein der Wahl mikroinjiziert und die damit verbundenen subzellulären morphologischen Veränderungen mithilfe der Mikroinjektionstechnik Clem oder der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie verfolgt.