Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression bakterieller RNA in einzelnen bakteriellen Zellen nachzuweisen. Dies wird zunächst erreicht, indem ein mit einer Biotin-TEG-Modifikation am Fünf-Prim-Ende versehener gesperrter Nukleinsäure-(LNA-)Sonde entworfen wird. Werden die bakteriellen Zellen anschließend fixiert, mit Dathyl, Percarbonat oder Dsy behandelt und danach permeabilisiert, so wird die RNA denaturiert und die LNA-Sonde hybridisiert.

Drittens werden die Zellen gewaschen, blockiert und gefärbt. Schließlich wird die zelluläre Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie gemessen. Letztendlich können Änderungen der RNA-Expression über die Zeit und innerhalb von Populationen ausgewertet werden.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen hinsichtlich des relativen Vorkommens und der Häufigkeit von RNA-Spezies innerhalb einer einzelnen Zelle sowie des Ausmaßes, in dem sich diese Expression innerhalb homogener oder heterogener Populationen verändert, beantworten. Obwohl diese Methode derzeit zur Überwachung der Expression bakterieller small RNAs eingesetzt wird, kann sie theoretisch zum Nachweis von RNA in praktisch jeder Zellart verwendet werden. Nach der Konstruktion der LNA-Sondensequenz sollte ein Blast verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Sonde ausschließlich spezifisch für die gewünschte sRNA oder mRNA ist.

Beim Bestellen der Sonde eine Biotin-TEG-Modifikation am Fünf-Prim-Ende des LNA-Oligonukleotids hinzufügen. Die Biotinmarkierung ist für die Nachweisfärbung nach der Hybridisierung mit einem Streptavidin- und Di-Konjugat erforderlich. In der Methode sollten drei negative Kontrollen enthalten sein: eine A, keine LNA-Kontrolle, bei der während der Hybridisierung keine LNA-Sonde zugegeben wird.

Schritt zwei: Eine Kontrolle ohne Farbstoff, bei der die LNA-Sonde mit dem Ziel-sRNA hybridisiert, der Hybridisierungsereignis jedoch aufgrund des Fehlens des fluoreszierenden Farbstoffs nicht nachgewiesen wird. Und drei: Eine Kontrolle für nicht exprimierte sRNA oder mRNA, die eine LNA-Sonde verwendet, die auf eine nicht vorhandene oder nicht exprimierte sRNA abzielt, um unspezifische Hybridisierung zu überwachen. Beginnen Sie damit, 1 × 10⁸ Zellen der gewünschten Bakterien zu gewinnen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Anschließend pelletieren Sie die Bakterienzellen bei 2300 × g für fünf Minuten nach der Zentrifugation.

Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und nicht durch Dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 400 µL PBS, geben Sie 400 µL PFA-Acetat-PBS-Fixierungslösung hinzu und mischen Sie die Zellen gründlich. Inkubieren Sie die Suspension nun 10 Minuten bei 25 °C.

Nach erneutem Abzentrifugieren der Zellen erneut fünf Minuten nach dem Ansatz für eine Minute vortexen. Dieses Mal bei 4.500 ×g für zwei Minuten. Den Pellet zweimal mit 400 µL PBS waschen.

Suspenderen Sie das Pellet schließlich in 400 µL PBS und lagern Sie die fixierten Zellen bei vier Grad für bis zu sieben Tage. Geben Sie zunächst 400 µL einer frisch hergestellten 0,1-%-Lösung zu jeder fixierten bakteriellen Zellprobe und mischen Sie die Zellsuspensionen anschließend durch Pipettieren gut durch.

Inkubieren Sie dieses Gemisch 12 Minuten lang bei 25 Grad Celsius und geben Sie anschließend nach zweimaligem Waschen der Zellen mit jeweils 400 Mikrolitern PBS 800 Mikroliter einer frisch zubereiteten Lysozym-Lösung zu den Zellen. Mischen Sie die Zell-Lysozym-Lösung gründlich durch Vortexen und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 25 Grad Celsius unter gelegentlichem Mischen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen geben Sie 800 Mikroliter einer frisch zubereiteten Proteinase-K-Lösung zum Pellet und mischen die resuspendierten Zellen gründlich durch Pipettieren.

Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius, wobei die Probe zur Hälfte der Inkubationszeit kurz verwirbelt wird, nachdem die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und mit 400 Mikrolitern PBS gewaschen wurden; resuspendieren Sie die Zellen anschließend in weiteren 400 Mikrolitern PBS und geben Sie 100 Mikroliter der Suspension in vier separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, pelletieren Sie danach die Zellen und entfernen Sie die Überstände. Inkubieren Sie nun alle vier Proben jeweils in 100 Mikrolitern Hybridisierungspuffer bei 60 Grad Celsius für 60 Minuten. Fügen Sie nach der Hybridisierung ein Milliliter SSC mit Tween 20 oder SSCT zur Hybridisierungsmischung hinzu, um die Zellen aus der viskosen Hybridisierungslösung zu lösen.

Nach dem Pellettieren fügen Sie den Pellets 200 Mikroliter Formamid-SSCT-Lösung hinzu und mischen gründlich. Anschließend inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 65 Grad Celsius in einem Heizblock. Geben Sie nun ein Milliliter SSCT zu der Mischung und, nachdem die Zellen erneut pelletiert wurden, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern SSCT und inkubieren die Zelllösung 40 Minuten auf dem Heizblock.

Nach dem Pellettieren 200 Mikroliter Blockierpuffer zu den Pellets geben und die Zellen anschließend 30 Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren. Nach erneutem Pellettieren 50 Mikroliter einer entfärbten Avidin-Farbstoff-Lösung zu den Pellets geben und die Zellen gründlich für die Kontrolle ohne Farbstoff mischen. 50 Mikroliter Blockierpuffer hinzufügen.

Alle Proben anschließend weitere 12 Minuten bei 25 Grad Celsius unter ständigem Mischen in einem Thermomixer inkubieren, wobei die Röhrchen mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt werden. Danach die Zellen einmal mit 500 Mikrolitern SSCT-Puffer und einmal mit 400 Mikrolitern PBS plus Tween 20 oder PBST waschen. Nach dem Entfernen der Überstände 100 Mikroliter biotinyliertes Antis, Strippin und PBS für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius mit gelegentlichem Mischen hinzufügen; dieser Antikörper bindet an das im vorherigen Schritt zugegebene Strippin-DI-Konjugat.

Danach die Zellen durch Zentrifugation gewinnen und zweimal mit jeweils 400 µL PBST waschen; anschließend die Zellen erneut mit 50 µL der abgereinigten Avidin-Dye-Lösung versetzen und gründlich mischen. Dieser Schritt erhöht das Signal pro hybridisiertem LNA-Probe im Vergleich zur Kontrolle ohne Farbstoff. Danach erneut nur 50 µL Blockierpuffer hinzufügen und alle Röhrchen 12 Minuten bei 25 °C unter ständigem Mischen im Thermo-Mixer inkubieren.

Nach der Inkubation mit der Farbstofflösung die Zellen erneut mit 500 Mikrolitern SSCT-Puffer und anschließend einmal mit 400 Mikrolitern PBST nach dem zweiten Waschschritt waschen. Den Pellet in 200 Mikrolitern PBST resuspendieren und die Zellen bei vier Grad Celsius lagern, bis sie zur Durchflusszytometrieanalyse bereitstehen. Bei kleineren bakteriellen Zellen die Durchflussgeschwindigkeit am Durchflusszytometer auf langsam einstellen, um die Kerngröße zu verringern. Zusätzlich sollte bei Durchflusszytometern mit Schwellenwertabschaltung für das Vorwärtsstreulicht der Abschwellenwert so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen detektiert werden.

Ein Beispiel für fixierte und effektiv permeabilisierte Zellen ist hier in diesem Durchflusszytometrie-Dotplot unter Verwendung der gerade beschriebenen Bedingungen dargestellt. Bei der Permeabilisierung ist die Zellpopulation klein und homogen, was auf wenige Zellaggregate hinweist. Bei Verwendung höherer Lysozymkonzentrationen neigen die Zellen jedoch stärker zur Aggregation und zeigen erhöhte Werte der Vorwärtsstreuung, die auf größere Partikel hinweisen, wie in diesem Dotplot zu sehen ist.

Hier wird ein Beispiel für Durchflusszytometriedaten aus einem erfolgreichen LNA-Flow-FISH-Experiment gezeigt. Das Histogramm demonstriert den spezifischen Nachweis eines Ziel-sRNA zusammen mit drei Negativkontrollen. Die Negativkontrolle ohne Farbstoff in Purpur erzeugt die geringste Fluoreszenz, gefolgt von den Negativkontrollen ohne LNA und nicht exprimiertem sRNA in Blau bzw. Rot.

Schließlich erzeugt die Probe mit der sRNA-spezifischen LNA-Sonde die stärkste Fluoreszenz in Schwarz. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Außerdem liefert diese Technik mehr Informationen und ist kostengünstiger als die RT-PCR.

Mit dieser Methode können zusätzliche Sonden mit anderen HAPS markiert und während des Hybridisierungsschritts hinzugefügt werden, um eine multiplex RNA-Detektion zu ermöglichen. I.