Name: Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die LNA Flow-FISH-Methode zur hochdurchsatzfähigen Detektion bakterieller RNA in einzelnen Zellen. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von RNA-Expression und deren zeitliche Veränderungen.

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Diese Arbeit wurde vom Office of Naval Research über US Naval Research Laboratory Kern Mitteln gefördert.

1. LNA-Sonden und experimentelles Design <ol><li> Design-LNA-Sonden, die die umgekehrte Ergänzung Ihres transkribiert sRNA / mRNA sind oder sie an kundenspezifische <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Wenn Sie die benutzerdefinierte Design-Option, werden Sie wissen, die Reihenfolge, nicht aber die LNA spiking Muster. Die Zugabe von jeweils LNA Rückstand in eine DNA-oder RNA-Oligonukleotid führt zu einem Anstieg in T m zwischen zwei und 10 ° C für eine LNA-RNA-Hybridisierung Duplex-14. Idealerweise sollte die entworfen LNA-Sonden zwischen 20-25 Nukleotide lang (länger Sonden sind schwieriger zu synthetisieren) sein und eine T m zwischen 85-90 ° C für die RNA-Hybridisierung. </li><li> Nach dem Entwurf der Sequenz verwenden BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> oder vergleichen Sie die Sondensequenz auf Ihre lokale Datenbank, um sicherzustellen, wird die Sonde spezifisch nur auf Ihre sRNA / mRNA des Interesses. </li><li>Bei der Bestellung der LNA-Sonde, fügen Sie ein Biotin-TEG Modifikation der 5 &#39;Ende der LNA-Oligonukleotid. Die Biotinylierung ist notwendig für Post-Hybridisierung Färbung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat. Es ist möglich, diese Modifikation zu den 3 Add &#39;end if notwendig, aber die zusätzlich zu den 5&#39; Ende ist weniger teuer und sollte in höheren Ausbeuten führen. </li><li> Drei negative Kontrollen sollten in das Verfahren einbezogen werden: (i) a &#39;no LNA&#39; control, in dem ein LNA-Sonde nicht während der Hybridisierung wird hinzugefügt, (ii) ein &quot;Nein Farbstoff der Kontrolle, in dem der LNA-Sonde ist es, die hybridisierten Ziel sRNA aber die Hybridisierung Veranstaltung ist nicht durch das Fehlen des fluoreszierenden Fleck, erkannt und (iii) ein &quot;Nicht-Ausdruck sRNA / mRNA-Steuerelement, das ein LNA-Sonde, die eine nicht vorhandene oder nicht ausgedrückt sRNA, um Ziele nutzt Nicht-spezifische Hybridisierung zu überwachen. </li><li> Die spezifischen LNA-Sonde hier ist komplementär zu den sRNA CsrB und hat die Sequenz 5&#39;-Biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(LNA Monomeren inGroßbuchstaben). </li><li> Nach Erhalt der lyophilisierten LNA, mit Nuklease-freiem Wasser auf 50 pg / mL und speichern resuspendieren in 10-20 ul Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> Lösungen <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% Essigsäure in PBS: Mix 1 mL 32% pfa, 400 ul Essigsäure, 400 ul 10X PBS, pH = 7,4 und 2,2 ml Nuklease-freies Wasser. Für gefrorenen Aliquots, in einmaligen Gebrauch bei -20 ° C ohne Essigsäure einfrieren. </li><li> 60% Dextransulfat-Lösung: add 6,0 ​​g Dextransulfat zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 mL. Hitze dieses Gemisch auf 65 ° C in einem Wasserbad, bis die Dextransulfat gelöst ist (konnte 1-2 Stunden dauern). Zusätzliches Wasser Möglicherweise müssen Sie während der Solubilisierung hinzugefügt werden, um eine 10 ml Volumen zu erhalten. Aliquot der 60% Dextransulfat-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ul> 2. Fixierung <ol><li> Ernte 1x10 8 Zellen der Biolumineszenz <em&gt; Vibrio campbellii oder Ihre Bakterien von Interesse und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Diese Menge von Zellen bietet genügend Ausgangsmaterial für vier Flow-FISH-Proben (eine bestimmte LNA-Sonde Probe und drei negative Kontrollen). Zusätzliche 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots sollten dann erhoben, wenn andere sRNA / mRNA-Spezies getestet werden müssen. </li><li> Pellet die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2300 xg für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, und Zellen in 400 ul 1X PBS. </li><li> Zu dieser Mischung werden 400 ul einer 8% paraformaldehye (pfa) und 10% Essigsäure in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1X PBS), gut mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 25 ° C Mischen einmal nach fünf Minuten. Alle Inkubationen, sofern nicht anders angegeben, sind in einem beheizten Rohr Halter durchgeführt. Die pfa Lösung sollte frisch zubereitet werden oder verwendet werden von gefrorenen Aliquots nach der Zugabe von Essigsäure. Paraformaldehyd ist ein Vernetzer Fixativ, dass hELPS zu bewahren Zellmorphologie und behalten intrazellulären RNA. </li><li> Pellet die Zellen aus diesem Gemisch durch Zentrifugation bei 4500 xg für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Alle künftigen Schritte, die Zentrifugation benötigen, sollten die gleichen Einstellungen (7K, 2 min). Es ist wichtig, dass nach Zentrifugation beachten Sie die Überstände durch Pipettieren und Dekantieren nicht entfernt werden sollte. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS resuspendieren und die endgültige Zellpellet in 400 ul 1X PBS. Die Zellen sind nun behoben und kann bei 4 ° C in 400 ul 1X PBS für bis zu sieben Tage gelagert werden. </li></ol> 3. Diethylpyrocarbonat Behandlung <ol><li> Bereiten Sie 400 ul einer 0,1% igen Lösung von Diethyl-(DEPC) in 1X PBS (400 ul dieser Lösung ist für jede zu untersuchende Probe so Skala entsprechend werden benötigt). Die DEPC-Lösung sollte frisch zubereitet von einem DEPC Lager sein. DEPC-Behandlung inaktiviert RNasen durch carbethoxylation und verringert dieHintergrund-Signal. </li><li> Zugabe von 400 ul der 0,1% DEPC-Lösung in jede feste Bakterienzelle Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren dieser Mischung bei 25 ° C für 12 Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 4. Permeabilisierung <ol><li> Add 1,0 mg Lysozym auf 1 ml Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) für eine 1,0 mg / ml Lösung. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden. Add 800 ul der 1 mg / mL Lysozym-Lösung zu den Zellen, mischen durch Pipettieren und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Lysozym wirkt als Permeabilisierung Reagenz durch Hydrolyse der Peptidoglycan in bakteriellen Zellwänden. </li><li> Bereiten Sie eine 3,0 pg / ml-Lösung von Proteinase K in TE-Puffer. Diese Lösung sollte hergestellt aus einer 20 mg / ml Proteinase K Aktie, die bei -20 ° C gelagert wird frischProteinase K ist eine Serin-Protease, die eine Vielzahl von Proteinen verdaut und hilft die Zugänglichkeit der Sonden und Reagenzien an die RNA. </li><li> Add 800 ul des 3,0 ug / ml Proteinase K-Lösung auf das Zellpellet und gründlich durch Pipettieren. Inkubation bei 25 ° C für 15 Minuten mit Vortexen auf halbem Weg durch die Inkubation. </li><li> Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und die Zellen werden einmal mit 400 ul 1X PBS. Nach dem Entfernen der Wäsche Überstand, die Zellen in 400 ul 1X PBS und 100 ul der Resuspension in vier neue 1,5 ml Reaktionsgefäße. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 5. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie 100 ul Hybridisierungspuffer (HB) für jede Probe. Das HB ist von 50% Formamid nach Volumen, 10% Dextransulfat Masse (add 16,7 ul der 60% Dextransulfat-Lösung für alle 100 ul), 1X Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 gestellt,2X Natriumcitrat (SSC), 20 ug gescherte Lachssperma-DNA (SSSD) und 20 ug Hefe-tRNA. </li><li> Jede der Komponenten des HB hat einen anderen Zweck. Formamid senkt die Schmelztemperatur von Nukleinsäureduplexe dabei helfen, mit Denaturierung der RNA und die Minimierung von Zellschäden. Dextransulfat ist als Volumen-ohne Polymer, um die Sonde zu konzentrieren und steigern die Hybridisierung Rate verwendet. Denhardts Lösung, Hefe-tRNA und SSSD als Blocker dienen, um unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> In jedem der Zelle Resuspension-Gehalt von 1,5 mL Reaktionsgefäße, fügen Sie 95 ul HB und 5,0 ul der sRNA / mRNA-spezifische LNA [20 pmol der spezifischen LNA Endkonzentration] oder Wasser (für die keine LNA Negativ-Kontrolle). Zum Beispiel: <ol class="lalpha"><li> Rohr 1 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifische Sonde </li><li> Rohr 2 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifischen Sonde (&quot;kein Farbstoff&quot; Negativ-Kontrolle) </li><li> U-Bahn 3 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA/ MRNA-Sonde (&quot;non-Ausdruck sRNA / mRNA&quot; Negativ-Kontrolle) </li><li> Rohr 4 bis 95 ul HB + 5,0 ul Wasser (&#39;no LNA &quot;Negativ-Kontrolle) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Inkubieren Sie alle vier Proben bei 60 ° C für 60 Minuten. Die Hybridisierung ist abhängig von der LNA-Sonde (n) T m und sollte bei ca. 30 ° C eingestellt werden unterhalb der prognostizierten T m für die RNA-Glühen. Sowohl die erhöhte Hybridisierungstemperatur und Formamid im HB sorgt für die Denaturierung von Sekundärstruktur des sRNA oder mRNA des Interesses. </li></ol> 6. Post-Hybridisierung wäscht <ol><li> Nach der Hybridisierung 1,0 ml 0,1 × SSC mit 0,1% Tween-20 (SSCT), um die Hybridisierung Mischung. Dies ist notwendig, damit die Zellen aus der zähen Hybridisierungslösung entfernt werden. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Geben Sie 200 ul von 50% Formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20, die Zellpellets, gründlich mischen und incubaß für 30 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. </li><li> 1 ml 0,1 × SSCT auf die Mischung, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Add 500 ul 0,1 X SSCT, um die Zellen zu resuspendieren, Inkubation für 40 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 7. Blocking und Färbung <ol><li> Bereiten Sie die Blocking-Puffer (BB) und die Streptavidin-Farbstoff-Färbelösung. Bereiten Sie eine 1X BB-Lösung aus einer 5fach-Aktie (im Handel erhältlich, siehe Reagenzien). Für jede Gruppe von vier Röhren, bereiten 1,2 ml 1X BB. </li><li> Geben Sie 200 ul 1X BB auf die Zellpellets, resuspendieren und Inkubation für 30 Minuten bei 25 ° C. </li><li> Ein Streptavidin-konjugierten Farbstoff wird verwendet, um die biotinylierten LNA-Sonden erkennen. Während blockieren, bereiten eine Lösung von 2 pg / mL DyLight 488 Streptavidin oder die gewünschte Farbstoff-Streptavidin-Konjugat in 1X BB für 30 min (für drei Proben, machen 300 ul). </li><li> Nach incubarbeit mit 1X BB-, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Dann werden 50 ul der Streptavidin-Farbstoff-Lösung, die Zellpellets, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die &quot;keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. Für den Rest des Protokolls zum Schutz der Rohre von Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Nach der ersten Streptavidin-Konjugat-Färbung, wird das Signal durch die Einführung eines biotinylierten Anti-Streptavidin Antikörpers an die Streptavidin-Farbstoff-Konjugat und dann Färbung ein zweites Mal mit dem Streptavidin-Farbstoff erhöht so die Signalausgabe pro hybridisierte LNA-Sonde (Abbildung 2) verstärkt . </li><li> Geben Sie 100 ul von 1 pg / mL biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörper in 1X PBS, resuspend die Zellen, und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und waschen zweimal mit 400 ul 1X PBST. </li><li> Dann werden 50 ul der 2 pg / mL Streptavidin-Farbstoff-Lösung zu den Zellen, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die &quot;keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBST. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 200 ul 1X PBST und lagern bei 4 ° C, bis sie zur Durchflusszytometrie. Für kleinere Bakterienzellen stellen Sie den Durchfluss zu langsam, um den Kern verkleinern. Darüber hinaus ist für Durchflusszytometer mit Vorwärtsstreuung Schwelle Abschaltungen, muss die Grenzfrequenz so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen erkannt werden. </li><li> Für DyLight 488 Erkennung, sollte das Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser-und Standard-Emission ausgestattet werdenFilter für FITC. Mindestens 2x10 4 Ereignisse gesammelt werden sollten. Um die Kompatibilität mit Durchflusszytometer mit verschiedenen Lasern ausgestattet ist, können andere Streptavidin-konjugierte Fluorophore für dieses Protokoll verwendet werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Zellen, die fixiert und permeabilisiert effektiv in der Durchflusszytometrie Dot-Plot in Abbildung 3A gezeigt. Bei Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen zur Permeabilisierung ist die Zellpopulation kleine und homogene zeigt einige Zellaggregate. Bei höheren (5 mg / ml) Konzentrationen von Lysozym verwendet werden, werden die Zellen mit größerer Wahrscheinlichkeit zu aggregieren und zu zeigen erhöhte Vorwärtsstreuung Werte indikativ für größere Partikel (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten aus einer erfolgreichen LNA Flow-FISH Experiment ist in Abbildung 4 dargestellt. Das Histogramm zeigt die spezifische Detektion eines Targets sRNA zusammen mit drei negativen Kontrollen.Die &quot;keinen Farbstoff&quot; Negativ-Kontrolle produziert am wenigsten Fluoreszenz, die von der &#39;no LNA &quot;und&quot; non-Ausdruck sRNA &quot;negativen Kontrollen folgen. Schließlich erzeugt der Probe mit dem sRNA-spezifische LNA-Sonde der größte Fluoreszenz. Sobald die Methode und LNA-Sonden auf diese Weise validiert sind, können zusätzliche Experimente entwickelt, um Veränderungen in der sRNA Signals über die Zeit zu überwachen, in Reaktion auf Mutationen oder vielfältige Kultur Bedingungen, etc. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Abbildung 1. Darstellung des Gesamtkonzepts eines LNA Flow-FISH Experiment zum Nachweis von bakteriellen sRNA. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Abbildung 2. Färbung und Verstärkung des LNA Flow-FISH-Signal. a) Hybridisierung der biotinylierten LNA-Sonde. b) Färbung mit dem fluoreszierenden DyLight 488 Streptavidinkonjugat. c) Die Bindung des biotinylierten anti-streptavidin Antikörpers an die DyLight 488 Streptavidin. Der Antikörper kann Streptavidin durch seine Antigen-Bindungsstelle binden oder durch Streptavidin durch seine Biotin-Reste gebunden zu sein. d) Verstärkung des Signals durch weitere Färbung mit dem Fluoreszenz-DyLight 488 Streptavidinkonjugat. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Abbildung 3. Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen uns gegenüber side scatter Ergebnisse für a) 1 mg / mL Lysozym, 3 pg / mL Proteinase K Permeabilisierung und b) 5 mg / ml Lysozym, 3 pg / ml Proteinase K Permeabilisierung. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Abbildung 4. Histogramm Analyse der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Das Fluoreszenzsignal von jeder Probe erzeugt wird durch die vier Spuren gezeigt: schwarz - sRNA-spezifische LNA-Sonde, rot - &quot;nicht zum Ausdruck sRNA&quot; negative Kontrolle; blau - &#39;no LNA &quot;negative Kontrolle; purple -&#39;Keinen Farbstoff &quot;negative Kontrolle.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der LNA Flow-FISH-Methode vorgestellt wurde hier verwendet, um den Ausdruck einer sRNA aus dem Gram-negative marine Bakterium Vibrio campbellii deren Expression zuvor via Microarray-basierte Expression Profiling und Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion 16 geschlossen wurde bestätigt zu erkennen. Bis heute haben wir diese Methode verwendet, um die Expression einer Vielzahl von RNAs (zB trans-codierte sRNA, sRNA, dass Protein-Aktivität, Riboschalter und mRNA modulieren) zu überwachen. Als solche sind wir zuversichtlich, dass die Methode anpassungsfähig und kann verwendet werden, um sRNA oder mRNA Ziel zu erkennen und können für die Verwendung in allen Bakterienarten oder Zelltyp modifiziert werden können. Wenn Änderung dieses Protokolls ist die für andere Zelltypen, ist die wichtigste Variable zu berücksichtigen Manipulation der Permeabilisierung Schritt. Zum Beispiel bei der Änderung der Permeabilisierung hier beschriebenen Bedingungen, sollten Veränderungen in den Konzentrationen von Lysozym und Proteinase K getestet werden. Wir fanden, dass eine Verdoppelung oderVerdreifachung der Menge an Lysozym und Proteinase K führte zu großen Veränderungen in der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Darüber hinaus bei der Prüfung von zusätzlichen Permeabilisierung Bedingungen sollte der Zellen für die Verklumpung, Zellverlust, und die beste erhältliche Signal an Hintergrundfluoreszenz Verhältnis analysiert werden. Das Ausmaß der Zelle Verklumpung kann durch Mikroskopie und / oder Durchflusszytometrie getestet werden. Mit der Durchflusszytometrie sind Zellklumpen Gegenwart als Schwänze in einer Vorwärts-vs side scatter Dot-Plot und die richtige Methode Permeabilisierung diesem Tailing-Effekt zu minimieren. Diese Methode eignet sich auch für Multiplex sRNA Erkennung ohne größere Änderungen an den beschriebenen Protokolls als Zusatzartikel LNA-Sonden mit anderen Haptene wie Digoxigenin während der Hybridisierung hinzugefügt werden könnten und dann mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper und sekundären Antikörper-Fluorophor-Konjugat nachgewiesen. Derzeit ist die einzige Einschränkung, dass wir mit dieser Methode kennengelernt haben ihre Unfähigkeit, eine ausreichende Signal schwach ex erzeugengedrückt sRNA Arten und Bemühungen sind im Gange, um die Nachweisgrenze zu bestimmen (in absoluten Kopienzahl pro Zelle). Insgesamt bietet die LNA Flow-FISH-Methode die Möglichkeit, bakterielle sRNA oder mRNA-Expression bei den einzelnen Zell-Ebene in einem hohen Durchsatz Weise Erkenntnisse über das Vorhandensein und die relative Häufigkeit eines sRNA Arten und das Ausmaß, die ihren Ausdruck variiert bieten messen in einer Population.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Nicht DEPC behandelt) </td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> RT 15714 </td><td> Ethanol frei </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Keep ausgetrockneten </td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / mL) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Entionisiertes aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Dextransulfat MW&gt; 500.000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Aliquot 60% ige Lösung und frieren </td></tr><tr><td> Denhardt-Lösung 50X-Konzentrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Natriumcitratpuffer 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; Lachssperma DNA (geschert) 10 mg / mL </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Hefe tRNA (10 mg / mL) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5x in-situ-Hybridisierung Blockierungslösung </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 Streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylierten Anti-Streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid durchflusszytometrie-fluoreszenz in situ hybridisierung (lna flow-fish): eine methode für die bakterielle rna-detektion

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine leistungsfähige Technik, die zur Erkennung und Lokalisierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in der zellulären Umgebung ist. Um den Durchsatz zu erhöhen, können FISH mit Durchflusszytometrie (flow-FISH) kombiniert werden, um den Nachweis von gezielten Nukleinsäuresequenzen in Tausenden von einzelnen Zellen zu ermöglichen. Als Ergebnis bietet Flow-FISH einen entscheidenden Vorteil gegenüber Lysat / Ensemble-basierten Nukleinsäure-Nachweisverfahren, weil jede Zelle als eine unabhängige Beobachtung behandelt wird, wodurch eine stärkere statistische und Abweichungsanalysen. Diese Attribute haben die Verwendung von FISH und Flow-FISH-Methoden in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen aufgefordert werden, und den Nutzen dieser Methoden wurde erfolgreich in Telomerlänge Bestimmung 1,2, zelluläre Identifikation und Genexpression 3,4 nachgewiesen, Überwachung Virusvermehrung in infizierten Zellen 5 und bakterielle Gemeinschaft Analyse und Zählung6. Traditionell wurde die Spezifität der FISH-und Flow-FISH-Methoden von DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden vermittelt. Kürzlich hat jedoch der Austausch von DNA-Oligonukleotid-Sonden mit Nukleinsäure-Analoga wie FISH und Flow-FISH-Sonden sowohl die Sensitivität und Spezifität der jeweiligen Technik aufgrund der höheren Schmelztemperaturen (T m) dieser Analoga für natürlichen Nukleinsäuren 7,8 erhöht . Locked Nucleic Acid (LNA)-Sonden sind eine Art von Nukleinsäure-Analogon, das LNA Nukleotide in einem DNA-oder RNA-Sequenz 9,10 aufgestockt. Wenn es mit Flow-FISH gekoppelt haben LNA-Sonden zuvor gezeigt, dass konventionelle DNA-Sonden 7,11 übertreffen und wurden erfolgreich eingesetzt, um eukaryotische mRNA 12 und virale RNA in Säugetierzellen 5 zu erfassen. Hier erweitern wir diese Fähigkeit und beschreiben eine LNA Flow-FISH-Methode, die den spezifischen Nachweis von RNA ermöglicht in Bakterienzelles (Abbildung 1). Insbesondere sind wir in der Detektion von interessierten kleine nicht-kodierende regulatorische RNA (sRNA), die sammelte großes Interesse in den letzten Jahren haben, wie sie gefunden wurden, um als wichtige regulatorische Elemente in vielen kritischen zellulären Prozessen 13 dienen. Allerdings gibt es begrenzte Werkzeuge, um sRNAs und die Herausforderungen zu erkennen sRNA in Bakterienzellen Studie ist zum Teil aufgrund der relativ geringen Größe (typischerweise 50-300 Nukleotide lang) und eine geringe Menge von sRNA Moleküle sowie die generelle Schwierigkeit in der Arbeit mit kleineren biologischen Zellen mit verschiedenen zellulären Membranen. Bei dieser Methode beschreiben wir Fixierung und permeabilzation Bedingungen, die die Struktur der bakteriellen Zellen zu erhalten und ermöglichen das Eindringen von LNA-Sonden sowie Signalverstärkung Schritte, die den spezifischen Nachweis von geringen Mengen vorhandenen Srna (Abbildung 2) zu ermöglichen.

Eine neuartige High-Throughput-Verfahren beschrieben, die ermöglicht den Nachweis und die relative Quantifizierung von kleinen RNA-und mRNA-Expression von einzelnen Bakterienzellen Verwendung gesperrt Nukleinsäure-Sonden und Durchflusszytometrie-Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung.

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet wird, um spezifische Nukleinsäuresequenzen in der zellulären ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression bakterieller RNA in einzelnen bakteriellen Zellen nachzuweisen. Dies wird zunächst erreicht, indem ein mit einer Biotin-TEG-Modifikation am Fünf-Prim-Ende versehener gesperrter Nukleinsäure-(LNA-)Sonde entworfen wird. Werden die bakteriellen Zellen anschließend fixiert, mit Dathyl, Percarbonat oder Dsy behandelt und danach permeabilisiert, so wird die RNA denaturiert und die LNA-Sonde hybridisiert. Drittens werden die Zellen gewaschen, blockiert und gefärbt. Schließlich wird die zelluläre Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie gemessen. Letztendlich können Änderungen der RNA-Expression über die Zeit und innerhalb von Populationen ausgewertet werden.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen hinsichtlich des relativen Vorkommens und der Häufigkeit von RNA-Spezies innerhalb einer einzelnen Zelle sowie des Ausmaßes, in dem sich diese Expression innerhalb homogener oder heterogener Populationen verändert, beantworten. Obwohl diese Methode derzeit zur Überwachung der Expression bakterieller small RNAs eingesetzt wird, kann sie theoretisch zum Nachweis von RNA in praktisch jeder Zellart verwendet werden. Nach der Konstruktion der LNA-Sondensequenz sollte ein Blast verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Sonde ausschließlich spezifisch für die gewünschte sRNA oder mRNA ist.Beim Bestellen der Sonde eine Biotin-TEG-Modifikation am Fünf-Prim-Ende des LNA-Oligonukleotids hinzufügen. Die Biotinmarkierung ist für die Nachweisfärbung nach der Hybridisierung mit einem Streptavidin- und Di-Konjugat erforderlich. In der Methode sollten drei negative Kontrollen enthalten sein: eine A, keine LNA-Kontrolle, bei der während der Hybridisierung keine LNA-Sonde zugegeben wird.Schritt zwei: Eine Kontrolle ohne Farbstoff, bei der die LNA-Sonde mit dem Ziel-sRNA hybridisiert, der Hybridisierungsereignis jedoch aufgrund des Fehlens des fluoreszierenden Farbstoffs nicht nachgewiesen wird. Und drei: Eine Kontrolle für nicht exprimierte sRNA oder mRNA, die eine LNA-Sonde verwendet, die auf eine nicht vorhandene oder nicht exprimierte sRNA abzielt, um unspezifische Hybridisierung zu überwachen. Beginnen Sie damit, 1 × 10⁸ Zellen der gewünschten Bakterien zu gewinnen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Anschließend pelletieren Sie die Bakterienzellen bei 2300 × g für fünf Minuten nach der Zentrifugation.Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und nicht durch Dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 400 µL PBS, geben Sie 400 µL PFA-Acetat-PBS-Fixierungslösung hinzu und mischen Sie die Zellen gründlich. Inkubieren Sie die Suspension nun 10 Minuten bei 25 °C.Nach erneutem Abzentrifugieren der Zellen erneut fünf Minuten nach dem Ansatz für eine Minute vortexen. Dieses Mal bei 4.500 ×g für zwei Minuten. Den Pellet zweimal mit 400 µL PBS waschen.Suspenderen Sie das Pellet schließlich in 400 µL PBS und lagern Sie die fixierten Zellen bei vier Grad für bis zu sieben Tage. Geben Sie zunächst 400 µL einer frisch hergestellten 0,1-%-L&ouml;sung zu jeder fixierten bakteriellen Zellprobe und mischen Sie die Zellsuspensionen anschlie&szlig;end durch Pipettieren gut durch.Inkubieren Sie dieses Gemisch 12 Minuten lang bei 25 Grad Celsius und geben Sie anschließend nach zweimaligem Waschen der Zellen mit jeweils 400 Mikrolitern PBS 800 Mikroliter einer frisch zubereiteten Lysozym-Lösung zu den Zellen. Mischen Sie die Zell-Lysozym-Lösung gründlich durch Vortexen und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 25 Grad Celsius unter gelegentlichem Mischen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen geben Sie 800 Mikroliter einer frisch zubereiteten Proteinase-K-Lösung zum Pellet und mischen die resuspendierten Zellen gründlich durch Pipettieren.Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius, wobei die Probe zur Hälfte der Inkubationszeit kurz verwirbelt wird, nachdem die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und mit 400 Mikrolitern PBS gewaschen wurden; resuspendieren Sie die Zellen anschließend in weiteren 400 Mikrolitern PBS und geben Sie 100 Mikroliter der Suspension in vier separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, pelletieren Sie danach die Zellen und entfernen Sie die Überstände. Inkubieren Sie nun alle vier Proben jeweils in 100 Mikrolitern Hybridisierungspuffer bei 60 Grad Celsius für 60 Minuten. Fügen Sie nach der Hybridisierung ein Milliliter SSC mit Tween 20 oder SSCT zur Hybridisierungsmischung hinzu, um die Zellen aus der viskosen Hybridisierungslösung zu lösen.Nach dem Pellettieren fügen Sie den Pellets 200 Mikroliter Formamid-SSCT-Lösung hinzu und mischen gründlich. Anschließend inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 65 Grad Celsius in einem Heizblock. Geben Sie nun ein Milliliter SSCT zu der Mischung und, nachdem die Zellen erneut pelletiert wurden, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern SSCT und inkubieren die Zelllösung 40 Minuten auf dem Heizblock.Nach dem Pellettieren 200 Mikroliter Blockierpuffer zu den Pellets geben und die Zellen anschließend 30 Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren. Nach erneutem Pellettieren 50 Mikroliter einer entfärbten Avidin-Farbstoff-Lösung zu den Pellets geben und die Zellen gründlich für die Kontrolle ohne Farbstoff mischen. 50 Mikroliter Blockierpuffer hinzufügen.Alle Proben anschließend weitere 12 Minuten bei 25 Grad Celsius unter ständigem Mischen in einem Thermomixer inkubieren, wobei die Röhrchen mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt werden. Danach die Zellen einmal mit 500 Mikrolitern SSCT-Puffer und einmal mit 400 Mikrolitern PBS plus Tween 20 oder PBST waschen. Nach dem Entfernen der Überstände 100 Mikroliter biotinyliertes Antis, Strippin und PBS für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius mit gelegentlichem Mischen hinzufügen; dieser Antikörper bindet an das im vorherigen Schritt zugegebene Strippin-DI-Konjugat.Danach die Zellen durch Zentrifugation gewinnen und zweimal mit jeweils 400 µL PBST waschen; anschließend die Zellen erneut mit 50 µL der abgereinigten Avidin-Dye-Lösung versetzen und gründlich mischen. Dieser Schritt erhöht das Signal pro hybridisiertem LNA-Probe im Vergleich zur Kontrolle ohne Farbstoff. Danach erneut nur 50 µL Blockierpuffer hinzufügen und alle Röhrchen 12 Minuten bei 25 °C unter ständigem Mischen im Thermo-Mixer inkubieren.Nach der Inkubation mit der Farbstofflösung die Zellen erneut mit 500 Mikrolitern SSCT-Puffer und anschließend einmal mit 400 Mikrolitern PBST nach dem zweiten Waschschritt waschen. Den Pellet in 200 Mikrolitern PBST resuspendieren und die Zellen bei vier Grad Celsius lagern, bis sie zur Durchflusszytometrieanalyse bereitstehen. Bei kleineren bakteriellen Zellen die Durchflussgeschwindigkeit am Durchflusszytometer auf langsam einstellen, um die Kerngröße zu verringern. Zusätzlich sollte bei Durchflusszytometern mit Schwellenwertabschaltung für das Vorwärtsstreulicht der Abschwellenwert so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen detektiert werden.Ein Beispiel für fixierte und effektiv permeabilisierte Zellen ist hier in diesem Durchflusszytometrie-Dotplot unter Verwendung der gerade beschriebenen Bedingungen dargestellt. Bei der Permeabilisierung ist die Zellpopulation klein und homogen, was auf wenige Zellaggregate hinweist. Bei Verwendung höherer Lysozymkonzentrationen neigen die Zellen jedoch stärker zur Aggregation und zeigen erhöhte Werte der Vorwärtsstreuung, die auf größere Partikel hinweisen, wie in diesem Dotplot zu sehen ist.Hier wird ein Beispiel für Durchflusszytometriedaten aus einem erfolgreichen LNA-Flow-FISH-Experiment gezeigt. Das Histogramm demonstriert den spezifischen Nachweis eines Ziel-sRNA zusammen mit drei Negativkontrollen. Die Negativkontrolle ohne Farbstoff in Purpur erzeugt die geringste Fluoreszenz, gefolgt von den Negativkontrollen ohne LNA und nicht exprimiertem sRNA in Blau bzw. Rot.Schließlich erzeugt die Probe mit der sRNA-spezifischen LNA-Sonde die stärkste Fluoreszenz in Schwarz. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Außerdem liefert diese Technik mehr Informationen und ist kostengünstiger als die RT-PCR.Mit dieser Methode können zusätzliche Sonden mit anderen HAPS markiert und während des Hybridisierungsschritts hinzugefügt werden, um eine multiplex RNA-Detektion zu ermöglichen. I.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion (Video) | JoVE Journal

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

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