Probenvorbereitung von Mycobacterium tuberculosis Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Ziel dieses Verfahrens ist es, Mycobacterium tuberculosis, zellfreie Extrakte durch NMR-Metabolomik-Erstkultur zu analysieren und die Zellen in einem geeigneten Wachstumsstadium zu ernten. Anschließend werden die Zellen lysa und erhalten zellfreie Extrakte für die Analyse. Die lyophilisierten Extrakte werden für die NMR-Analyse in Puffer resuspendiert.

Sammeln Sie schließlich NMR-Daten und analysieren Sie Spektren mit Software, um Metaboliten zu identifizieren. Letztendlich wird die NMR-Analyse von Mycobacterium tuberculosis verwendet, um die Konservierung der Metabolitenspiegel nach verschiedenen Behandlungen zu zeigen. Die NMR-Metabolomik kann auf Schlüsselaspekte der Physiologie von Mycobacterium tuberculosis angewendet werden, wie z. B. auf wichtige Stoffwechselwege.

Dieses Verständnis ist entscheidend, um die Wirkmechanismen von Wirkstoffwirkung und -resistenz aufzuklären und neue Ziele für das Wirkstoffdesign zu identifizieren. Im Allgemeinen würden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht in der Lage sind, alle Proben genau gleich zu handhaben, was zu unnötigen Variationen und Ergebnissen aus meinem Labor führen wird. Steven Luka, Doktorand wird die Verfahren zur Handhabung der Proben für die NMR-Verarbeitung demonstrieren Von meinem Labor aus werden der Leiter des Forschungslabors und Robert Fenton, Forschungstechniker drei, nun die Verfahren zur Handhabung von Mycobacterium tuberculosis-Kulturen bei der Durchführung von M-Tuberkulose demonstrieren.

Die Forschung folgte den Praktiken der Biosicherheitsstufe drei, wie sie in den institutionellen Richtlinien definiert sind. Obwohl auf den Etiketten in diesem Video aus Gründen der biologischen Sicherheit das Mikrobakterium tuberculosis angegeben ist, wurde bei dieser Demonstration das nicht-pathogene Mycobacterium magmatic verwendet. Beginnen Sie damit, eine 50%ige Glycerinbrühe von M tuberculosis auf Eis aufzutauen.

Impfen Sie 0,15 Milliliter in 110 Milliliter M-A-D-C-T-W-Bouillon in den 250 Milliliter ER und mein Kolben züchtet die Kulturen bei 37 Grad Celsius und schüttelt bei 100 U/min für etwa sechs Tage. Wenn keine Antibiotika, alternative Zusätze oder andere Behandlungen erforderlich sind. Ernten Sie die Kulturen für Kulturen, die behandelt werden müssen.

Reservieren Sie einen 0,5 Milliliter Eloqua auf Eis für Kultur, Titration und Qualitätskontrolle. Führen Sie dann die gewünschte Behandlung durch und legen Sie die Kulturen nach der Behandlungszeit wieder in den Shaker. Entnehmen Sie einen Milliliter und bestimmen Sie den OD 600.

Reservieren Sie außerdem eine 0,5-Milliliter-Probe für Kultur, Titration und Qualitätskontrolle. Halten Sie die Zellen während des gesamten verbleibenden Protokolls auf Eis. Ernten Sie die Zellen in vier 50-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation nach dem Waschen mit 15 Milliliter eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser.

Reese suspendiert die Pellets in 10-Milliliter-Aliquoten. Ziehen Sie zwei Aliquote und das Pellet durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellenpellet in einem Endvolumen von einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser. Wenn eine klumpenfreie Einzelzellsuspension gewünscht wird, werden die Zellen durch eine 27-Gauge-Nadel geführt.

Fahren Sie dreimal fort, um die Ein-Milliliter-Zellsuspension in einen Zwei-Milliliter-Schraubverschluss zu überführen, der die Lysematrix B enthält. Positionieren Sie den Lysehomogenisator fast prep 24 in der Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Proben in den Probenhalter, mit dem die Retentionsspeichenplatte befestigt ist. Anschließend 60 Sekunden lang mit einer Geschwindigkeit von sechs Metern pro Sekunde verarbeiten.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben, um Zellreste und intakte Zellen zu pelletieren. Führen Sie dann das Supinat durch einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter in ein steriles Röhrchen, um das Fehlen lebensfähiger Zellen zu kontrollieren. Platte 0,1 Milliliter Probe auf MADC. Agar.

Frieren Sie die Proben in einem Ethanol-Trockeneisbad ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie bereit sind, lyophilisiert und in einer NMR-Anlage verarbeitet zu werden. Überprüfen Sie nach zwei Monaten die Platten, um sicherzustellen, dass keine koloniebildenden Einheiten vorhanden sind. Wenn kein CF-Anwender gefunden wird, können die Proben aus dem BSL three-Labor entnommen werden, um sie in einer Standard-NMR-Einrichtung weiter zu analysieren.

Nachdem die Proben auf Trockenheit gebracht wurden, resuspendieren Sie sie in 0,7 Millilitern NMR-Puffer und überführen Sie sie drei Minuten lang mit 13.000 Mal in eine Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge. G, 0,6 Milliliter entfernen und in ein Fünf-Millimeter-NMR-Röhrchen umfüllen. Bei der Medienanalyse erleichtert ein kundenspezifisches Gestell das Laden mehrerer NMR-Röhrchen in Spinnern in der richtigen Tiefe.

Übertragen Sie dann die Proben auf das NMR-Spektrometer, um sie in den A-B-A-C-S einen Wechsler mit 20 Proben einzusetzen. Wechsel zwischen unbehandelten und medikamentös behandelten Kulturen. Die erste Probe muss zu Beginn eines automatisierten Laufs in den Magneten vorgeladen werden.

Um das Gerät zu kalibrieren, optimieren Sie die 90-Grad-Pulslänge mit einer einzigen Probe und stimmen Sie das Gerät auf die verbleibenden Proben ab. Verwenden Sie das Symbol NMR und die Unterlegscheibe. Automatisieren Sie das Locking, Shimming und die NMR-Datenerfassung für jede Probe.

Wählen Sie für ein 1D-Wasserstoff-NMR-Spektrum die Pulssequenz mit Wasserunterdrückung und Anregungsformung aus. Stellen Sie insgesamt 32.000 Datenpunkte, 128 Scans und 16 Dummy-Scans für ein Spektrum von zwei DH One C 13 hs QC ein. Wählen Sie die Impulssequenz aus.

Wählen Sie insgesamt 2048 Datenpunkte mit einer Sweeping-Breite entlang der direkten Dimension H eins und 64 Datenpunkte mit einer Sweeping-Breite entlang der indirekten Dimension C 13 aus. Spezifizieren Sie auch die Spektrumerfassung mit 128 Scans und 16 Dummy-Scans, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Ein Spektrum von m Tuberkulose erzeugte etwa 400 Peaks, darunter 50 bekannte Metaboliten.

Zum Beispiel erzeugte die Datenverarbeitung, wie sie im begleitenden Manuskript beschrieben wird, dieses Spektrum von Metaboliten, die direkt oder indirekt mit dem D-Alanin-Signalweg assoziiert sind. Das Ausmaß der Spitzenintensitäten ist proportional zu den im Zellextrakt vorhandenen Metabolitenkonzentrationen, so dass relative Störungen der Metaboliten und Stoffwechselwege zwischen Proben und Behandlungen quantifiziert werden können. Die LMR-Metabolomik ebnet den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Bakteriologie, um die Physiologie und Pathogenese bei Seh- und Mikrobakterien, anderen pathogenen oder nicht-pathogenen Mikroorganismen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Tuberkulose-Zellextrakte für die NMR-Metabolomik vorbereiten und vor allem die Konsistenz des gesamten Protokolls aufrechterhalten, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.