Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die durch Dextronsulfat-Natrium induzierte intestinale Immunantwort zu bewerten, indem die Mengen an Myeloperoxidase-Aktivität und proinflammatorischen Zytokinen, die als Reaktion auf die Entzündung produziert werden, bestimmt werden. Die erste DSS-Kolitis wird bei Mäusen durch die Einführung von DSS-SALZLÖSUNG in das Trinkwasser induziert. Als nächstes wird der Schweregrad der Kolitis durch makroskopisches Scoring beurteilt und der Dickdarm für die weitere Analyse entfernt.

Der präparierte Dickdarm wird dann für die Histologie, die Zytokinquantifizierung und die NPO-Aktivität in drei Teile unterteilt. Abschließend wird das Dickdarmgewebe homogenisiert und der Überstand zur Bestimmung der MPO-Aktivität verwendet. Letztendlich können Änderungen in der MPO-Aktivität durch die mit einem Spektralphotometer gesammelten Absorptionsdaten bestimmt werden.

Diese Methode kann Einblicke in die chronischen Informationen verschiedener Modelle entzündlicher Darmerkrankungen, wie z.B. DSS und TNBS-induzierte Kolitis, geben. Darüber hinaus können Sie diese Methode auch in anderen Organen wie Lunge und Leber anwenden, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen. Ersetzen Sie das Trinkwasser in jedem Mäusekäfig durch DSS-Lösung, um die Entzündung auszulösen.

Geben Sie Kontrollmäusen Autoklavieren Trinkwasser ohne DSS. Am Tag des Experiments sezieren Sie dann den Dickdarm, wie zuvor im JoVE-Artikel von Whitham Williams und Williams gezeigt. Drücken Sie den Kot vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus dem gesamten Dickdarm heraus und sammeln Sie ihn auf einem Wiegepapier, indem Sie das Tuch mit sterilem PBS spülen.

Beurteile den Stuhl, indem du mit einer Pinzette auf den Kot drückst, um seine Konsistenz zu bestimmen und einen Wert für Blut im Kot zu bestimmen. Notieren Sie sich die Farbe des Stuhls und validieren Sie die Bewertung weiter mit einem hämoccultischen Test, bei dem Stuhl auf hämoccultes Papier geschmiert, Entwickler hinzugefügt und dann eine Notierung der Farbe Blau einen positiven Stuhltest auf Blut bedeutet. Verwenden Sie dann diese Tabelle, um einen Wert für jede der Bedingungen zu bestimmen.

Als nächstes schneiden Sie den Dickdarm unter Beibehaltung der proximalen bis distalen Ausrichtung des Dickdarms in drei gleiche Abschnitte. Entnehmen Sie dann Probenfragmente aus dem proximalen und mittleren Dickdarmabschnitt des Dickdarms und geben Sie die Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Eph-Röhrchen. Um die histologische Schädigung des Schweregrads der Kolitis zu beurteilen, verwenden Sie den distalsten Gewebeabschnitt des Dickdarms und schneiden Sie ein kleines Fragment von einem halben bis einem Zentimeter Länge ab.

Legen Sie das Fragment in eine Gewebekassette und tauchen Sie die Kassette in gepufferte 10%ige Formalinlösung. Nach der Herstellung von in Paraffin eingebetteten Querschnitten der Gewebefragmente werden die Schnitte mit Hämatin Eoin gefärbt, um sie von einem verblindeten Beobachter bewerten zu können. Zum Schluss frieren Sie die Proben aus dem proximalen und mittleren Collon-Schnitt in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 70 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Dickdarmproben aus dem Lager bei minus 70 Grad Celsius entnommen haben, legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie dann mit einer gebogenen Pinzette sichtbaren Kot oder Fett und legen Sie sie in einzelne Zwei-Milliliter-Röhrchen, die für die Verwendung in einem Homogenisator geeignet sind. Bestimmen und protokollieren Sie dann das Gewicht jeder Probe.

Als nächstes fügen Sie jedem Probenröhrchen Homogenisatorkügelchen hinzu und geben Sie dann die entsprechende Menge H-Tab-Puffer entsprechend dem soeben ermittelten Gewicht des Gewebes in das Röhrchen, dissoziieren Sie die Fragmente vier Minuten lang mit einem Gewebehomogenisator bei 30 Hertz. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zelllösung sechs Minuten lang bei 13.400 G und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und achten Sie dann darauf, dass die Homogenisierungsperle das resultierende Pellet entsorgt.

Der Überstand kann dann bis zur Verwendung bei minus 70 Grad gelagert werden. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie sieben Mikroliter des zuvor vorbereiteten Gewebehomogenats in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte geben. Fügen Sie dann 50 Mikroliter verdünntes Wasserstoffperoxid zu frisch zubereitetem OD Dion-Jod hinzu.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter des Wasserstoffperoxid-Gemischs in jede der Vertiefungen. Messen Sie nun die Extinktion von 550 Nanometern mit einem Spektralphotometer und messen Sie drei Messungen im 32. Intervall. Berechnen Sie dann unter Verwendung der Absorptionsdaten, des Gewebegewichts und des Puffervolumens die NPO-Aktivität in den Homogenaten, wie in dieser Beispielrechnung gezeigt.

Während der Dauer der DSS-Behandlung kann der Krankheitsaktivitätsindex verwendet werden, um den klinischen Verlauf der Erkrankung zu beurteilen und zu bewerten. Tiere, die mit DSS behandelt wurden, zeigen einen signifikanten Gewichtsverlust im Vergleich zu ihrem Ausgangsgewicht, losen Stuhl und Stuhlblutungen. Je substanzieller als makroskopische Systeme, desto höher ist der Krankheitsaktivitätsindex.

Bei der Tötung und Untersuchung des Dickdarms von Mäusen, die fünf Tage lang 5%iges DSS im Trinkwasser erhielten, wurde der Schweregrad der Kolitis auf der Grundlage der makroskopischen Bewertung der Verkürzung der Dickdarmlänge, der Dickdarmblutungen, der Stuhlblutung, der Lockerung der Stuhlkonsistenz und der Anzeichen rektaler Blutungen für dieses repräsentative Experiment als etwa fünfmal schlimmer bestimmt als bei Kontrollen, die nur mit Wasser behandelt wurden, wie diese Datenquerschnitte der behandelten DSS zeigen Dickdarmgewebeproben, wie bei H und E, haben höhere histologische Werte als wasserbehandelte Kontrollen. Hier konnte die normale Architektur und das Fehlen von zellulärem Infiltrat in dem durch das Sternchen gekennzeichneten Bereich in diesem h und e gefärbten Querschnitt festgestellt werden, der von einem Kontrolltier entnommen wurde, das nur Wasser erhielt. Vergleichen Sie nun diese h- und e-Färbung einer Probe von einem mit A DSS behandelten Tier mit der vorherigen Abbildung.

Der Dickdarm dieses Tieres weist mehr histologische Schäden auf, was sich in einer stärkeren zellulären Infiltration zeigt, wie das Nummernzeichen anzeigt, und in einer stärkeren Depletion der Becherzellen und einer stärkeren Verzerrung. Beschädigung der K-Crypt-Architektur, wie durch das Sternchen gekennzeichnet. Um das Ausmaß des Schweregrads der Erkrankung bei DSS-behandelten Mäusen weiter zu charakterisieren, kann die NPO-Aktivität, ein Surrogatmarker für Entzündungen, aus homogenisierten Dickdarmgewebeproben bestimmt werden.

Erwartungsgemäß weisen DSS-behandelte Dickdarme eine höhere NPO-Aktivität auf als Kontrollen. Darüber hinaus ist der Schweregrad der DSS-induzierten Kolitis mit einem erhöhten Spiegel an proinflammatorischen Zytokinen wie IL eins, beta, IL sechs und TNF alpha verbunden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass die MPO-Aktivität im Laufe der Zeit abnehmen kann.

Daher sollte der MPO-Assay einer der ersten Assays sein, der bei der Bestimmung des Schweregrads einer Darmentzündung durchgeführt wird.