Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Fettgehalt lebender Mäuse nichtinvasiv abzubilden, zu quantifizieren und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Röntgen-CT-Aufnahme der Maus angefertigt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fettvolumina innerhalb der Maus basierend auf der Röntgendichte zu segmentieren und zu quantifizieren.

Der dritte Schritt besteht darin, die CT-Daten dreidimensional darzustellen, wobei die Fettvolumina rot hervorgehoben sind. Letztendlich ermöglichen die Ergebnisse die Quantifizierung und Visualisierung des Fettgehalts während longitudinaler in-vivo-Studien unter Verwendung eines albia-Röntgen-CT in Kombination mit den Softwarepaketen PMOD und Vol View. Einer der wesentlichen Vorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der ex-vivo-Analyse ist, dass sie eine nichtinvasive und longitudinale Beurteilung des Fettgehalts in kleinen Tiermodellen der Krankheit erlaubt.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Segmentierungs- und Visualisierungsprotokoll mehrere aufeinanderfolgende Schritte umfasst. Außerdem müssen während der Aufnahme die optimalen Röntgenparameter verwendet werden. Um den besten Kontrast aus dem Fettgewebe zu erhalten, betäuben Sie zunächst die untersuchten fettleibigen Mäuse mittels einer Induktionskammer und überführen Sie diese anschließend auf eine Nasenkanüle.

Während der Bildgebung die Anästhesie aufrechterhalten und die Mäuse in ein standardmäßiges Rattenbett mit seitlich am Rumpf angelegten Gliedmaßen positionieren. Dies gewährleistet eine einheitliche CT-Aufnahme. Das CT-System so einstellen, dass ein 115 Millimeter langes Bett mit 600 Projektionen gescannt wird.

Stellen Sie die Röntgenquelle auf 200 Mikroampere und 45 Kilovolt Spitzenwert ein und verwenden Sie einen 0,5 Millimeter dicken Aluminiumfilter, um den Strahl zu härten. Die äquivalente tiefe Strahlendosis, die die Maus bei dieser Einstellung erhält, beträgt ungefähr 220 Millisievert, während die äquivalente flache Dosis 357,4 Millisievert am Computer beträgt. Wählen Sie den FBP-Algorithmus mit Standardparametern für die Bildrekonstruktion.

Letztlich setzt sich das endgültige Bild aus 125 µm isotropen, fuchslöcherartigen Strukturen zusammen und kann für die Bildanalyse des gesamten Tierkörpers verwendet werden. Die Bildanalyse erfolgt mit der PMOD-Analyse-Software, wobei PMOD zunächst die Bilder entsprechend der Gewebedichte segmentiert und anschließend das Fettvolumen bestimmt. Nach dem Laden des Bildes sollte dessen Größe verringert werden, um den Rechenaufwand zu minimieren.

Navigieren Sie zum Hauptansicht-Tab, wählen Sie Werkzeuge und anschließend Reduzieren aus. Stellen Sie die Reduktionswerte auf zwei für X, zwei für Y und zwei für Z ein, aktivieren Sie Ersetzen und führen Sie den Vorgang aus. Ein Meldungsfenster erscheint, wenn der Vorgang abgeschlossen ist.

Um Bettnetz- und Nasenkonus-Elemente aus den Bildern zu entfernen, maskieren Sie diese vor der VOI-Analyse. Navigieren Sie zu Ebenenlayouts, Rotationen, 3D-Markierungen spiegeln und wählen Sie Ebenen und Layouts aus. Wählen Sie „Ebene Z anzeigen“. Scrollen Sie dann in der Z-Ebene zum Nasenkonus.

Wählen Sie als Nächstes die Haupt-VOI-Registerkarte aus und wählen Sie „Punkte zeichnen“. Zeichnen Sie ein ROI um die Nase herum, wobei das Bett und der Nasenkegel ausgeschlossen werden, und wählen Sie „tatsächliches ROI auf jedes andere kopieren“. Schneiden Sie mit dem Nasenkegel-Element.

Das ROI nach Bedarf mit dem Puffer auf die Nase übertragen. Den Befehl zur Bearbeitung der Eckpunkte verwenden, um die ROI anzupassen. Wenn die Nasenkonusse nicht mehr sichtbar sind, das ROI löschen und ein VOI erzeugen, das den Körperumfang des Tieres umfasst.

Navigieren Sie zu VOI-Werkzeugen, anschließend zu Maskierung und Algebra. Geben Sie minus 1000 in das vorgesehene Dialogfeld ein. Wählen Sie dann die Schaltfläche aus, die „Voxel außerhalb der ausgewählten VOIs maskieren“ beschriftet ist.

Wenn die Meldung „irreversible Datenoperation – möchten Sie fortfahren?“ angezeigt wird, wählen Sie „Ja“. Navigieren Sie nun zu Ebenen, Layouts, Drehungen, 3D-Markierungen spiegeln und schließlich zu Ebenen und Layouts. Wählen Sie „Alle Ebenen anzeigen“.

Überprüfen Sie die Integrität des VOI. Wenn der VOI gut aussieht, speichern Sie ihn als Analyse-Datei und ändern Sie das Dateinamen-Präfix. Fahren Sie fort mit der Segmentierung des Bildes für das Gesamtvolumen des Tieres.

Beginnen Sie mit der Auswahl von Werkzeugen und externen Elementen. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Segmentierung. Geben Sie einen Bereich von minus 300 bis plus 3.500 ein und führen Sie die Segmentierung durch.

Danach VOI-Statistiken auswählen, die Statistiken liefern, die das Gesamtvolumen repräsentieren. Notieren Sie sich dieses Volumen. Segmentieren Sie nun das Bild für das Fettvolumen, indem Sie zunächst zum nicht segmentierten, massierten Bild zurückkehren.

Zweitens laden Sie die gespeicherte Massendatendatei und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „analysieren“ im Lade-Fenster. Wählen Sie anschließend „Werkzeuge“ und „extern“. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Segmentierung.

Geben Sie einen Bereich von minus 200 bis minus 50 ein und führen Sie die Segmentierung durch. Nach der Genehmigung der Ergebnisse wählen Sie VOI.Statistics. Beachten Sie, dass die angegebenen Statistiken das Fettvolumen darstellen.

Speichern Sie die Ergebnisse im analysierten Format und vergeben Sie einen eindeutigen Dateinamenpräfix. Falls jedoch Haut- oder periphere Dichte verbleiben, verwenden Sie das Erosions- und Dilatationsprotokoll, um diese Bereiche für die VOI-Analyse zu eliminieren. Vor dem Speichern navigieren Sie zu „Werkzeuge extern“ und aktivieren das morphologische Kontrollkästchen in dem neuen Fenster.

Wählen Sie Erosion, gefolgt von. Kehren Sie dann zur morphologischen Auswahlbox zurück, wählen Sie Dilatation aus und bestätigen Sie mit OK. Überprüfen Sie, ob das Problem mit der Haut- oder peripheren Dichte behoben wurde, und speichern Sie die Ergebnisse. Nutzen Sie das Softwarepaket Volvo View Version 3.2, um gerenderte 3D-Visualisierungen der segmentierten Bilder zu erstellen.

Beginnen Sie mit dem Öffnen des CT-Datensatzes, der im Analyze-Format gespeichert ist. Verwenden Sie die Standardeinstellungen im Popup-Fenster, öffnen Sie dann das Plugins-Menü und wählen Sie unter „Utility“ die Option „Merge Volumes“. Deaktivieren Sie die Option „Rescale Components“.

Klicken Sie auf „Zweite Eingabe zuweisen“. Wählen Sie die segmentierten Fett-Daten als zweite Eingabe aus und verwenden Sie die Standardeinstellungen im Popup-Fenster. Anschließend wenden Sie das Plugin an, um eine vergrößerte Ansicht der Versuchsmaus zu erhalten.

Doppelklicken Sie auf das Volumenansichtsfenster. Gehen Sie zur Registerkarte Farbe/Sichtbarkeit zurück. Die Dropdown-Box Komponente bezieht sich auf den Datensatz, der derzeit bearbeitet wird.

Am unteren Rand des Tabs befinden sich zwei Schieberegler. Sie legen die relative Helligkeit jedes Komponentendatensatzes innerhalb der Überlagerung anhand von Werten zwischen null und eins fest. Um die Farbe beispielsweise in Graustufen umzuwandeln, wechseln Sie zum Abschnitt zur Farbskalenzuordnung.

Doppelklicken Sie auf einen der Schieberegler und ziehen Sie ihn aus dem Kasten. Fügen Sie einen zweiten Schieberegler hinzu, indem Sie innerhalb des Schiebereglersbereichs klicken. Stellen Sie beim linken Farbschieberegler Schwarz und beim rechten Farbschieberegler Weiß ein.

Nächster Schritt: Gehen Sie zum Skalar-Opazitäts-Zuordnungsfeld und erstellen Sie einen neuen Punkt, indem Sie innerhalb des Felds klicken. Dadurch ergibt sich insgesamt eine Anzahl von drei Punkten im Fenster für den mittleren Punkt. Ändern Sie den Skalarwert auf etwa minus 3000 und den Opazitätswert auf null.

Rechts im Fenster befindet sich der dritte Punkt; ändern Sie seinen Skalarwert auf etwa 32.000 und seine Deckkraft auf 0,25. Der erste Punkt kann sich beliebig weit links befinden, solange der Deckkraftwert auf null gesetzt ist. Wechseln Sie bei festgelegtem Skalarwert zur Komponente zwei, die das Erscheinungsbild des Fettgewebes bearbeitet, und stellen Sie jeden Farbregler durch Doppelklicken auf Rot ein, indem Sie den Farbtonregler H bis zum Ende verschieben.

Dadurch wird das Fett rot eingefärbt. Um einen Dreifeld-Rotationsfilm zu erstellen, der die CT-Darstellung des Fettes und die Überlagerung zeigt, führen Sie zunächst folgende Schritte aus: Klicken und ziehen Sie die Maus des Subjekts in eine aufrechte Position, sodass der Rücken nach oben zeigt. Zweitens setzen Sie unter „Komponentengewichte“ den Wert der Komponente zwei auf null, sodass nur der CT-Scan angezeigt wird. Drittens klicken Sie auf „Überprüfen“, anschließend auf „Kamera“ und wählen Sie eine Anzahl von Bildern für den Rotationsfilm. Viertens ändern Sie den X-Rotationswert auf 360 Grad.

Als Fünftes im Popup-Dialogfeld „Erstellen“ auswählen. Einen neuen Ordner mit dem Namen CT erstellen und die Datei im TIF-Format speichern, wodurch eine Reihe von Rotationsbildern ausgegeben wird. Wiederholen Sie diese Schritte auch für das Fettbild sowie für das überlagerte Fett-CT-Bild und speichern Sie deren Rotationsbilder in separaten Ordnern. Um einen Rotationsfilm aus den Ausgabebildern zu erzeugen, öffnen Sie ImageJ und importieren Sie die Bildsequenzen.

Wählen Sie das erste Bild im CT-Ordner aus, die übrigen werden automatisch ausgewählt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Fett- und Overlay-Sequenzen mit einem der Stapel. Noch geöffnet.

Öffnen Sie den ROI-Manager. Dieser befindet sich unter den Analysewerkzeugen; anschließend zeichnen Sie im ROI-Manager einen Bereich um die Versuchsmaus, der überflüssige Hintergrundpixel ausschließt. Klicken Sie danach im ROI-Manager auf „Hinzufügen“.

Danach auf jede Bildsequenz denselben ROI anwenden. Wenn sich der ROI auf allen Stapeln befindet, rechtsklicken. Innerhalb des ROI duplizieren auswählen und bestätigen. Den duplizierten Stapel überprüfen.

Dadurch wird der interessierende Bereich (ROI) vom Rest des Bildes getrennt. Schließen Sie nun die größeren Bildstapel und wiederholen Sie diesen Vorgang für alle drei Bildsequenzen. Um die Stapel zu kombinieren, verwenden Sie den Befehl „combine“, der sich unter „stacks“ und dann unter „tools“ befindet.

Wählen Sie den CT-Stack für Stack eins und den Fett-Stack für Stack zwei aus. Wiederholen Sie dann den Vorgang, indem Sie die neu kombinierten Stacks für Stack eins und den Overlay-Stack für Stack zwei auswählen.

Damit ist die Erstellung eines dreiteiligen Bild-Rotationsstapels abgeschlossen. Zeigen Sie den Stapel vor, indem Sie unten links im Bildfenster „Play“ auswählen. Speichern Sie ihn anschließend als AVI-Video.

Fettleibige B6V-LE-OB-J-Mäuse wurden verwendet, um die Durchführbarkeit des Alber-CT-Systems zu veranschaulichen. Zum Vergleich hinsichtlich der mittels CT bestimmten Fettgehalte wurden sie mit C57BL/6-Wildtypen konfrontiert. Links ist das gesamte CT-Volumen einer fettleibigen Maus dargestellt.

In der Mitte ist das Fettvolumen in Rot dargestellt, rechts befindet sich die Überlagerung. Eine ähnliche Analyse von Wildtyp-Tieren zeigt den erheblichen Unterschied im Fettgehalt im Vergleich zur fettleibigen Maus. Für jedes Tier wurden das Gesamtvolumen, das Fettvolumen und die Volumenverhältnisse berechnet.

Das durchschnittliche Verhältnis von Fett- zu Gesamtvolumen betrug für die Wildtyp-Gruppe und die adipöse Gruppe jeweils 0,09 bzw. 0,42. Diese Werte unterschieden sich signifikant mit einem P-Wert von 0,001. Nachdem man dieses Video angesehen hat, sollte man ein solides Verständnis dafür haben, wie man die Fettvolumina innerhalb eines CT-Datensatzes einer lebenden Maus segmentiert, sobald man dies beherrscht.

Diese Technik sollte weniger als 30 Minuten in Anspruch nehmen. Vielen Dank fürs Zuschauen, und wir sehen uns beim nächsten Mal wieder.