Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die zytotoxische T-Zell-Aktivität zu bestimmen, indem ein impedanzbasierter Ansatz mit dem EXOGEN-System mit dem Chrom-Release-Assay verglichen wird. Der erste Schritt wird durch die Trennung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes vom Vollblut mit Hilfe von Fial erreicht. Als nächstes werden die PBMC zusammen mit dem Peptidantigen, dem humanen rekombinanten IL zwei und dem bestrahlten PBMC in die Vertiefungen gegeben, um antigenspezifische CD 8 T-Zellen zu erzeugen.

Die antigenspezifischen CD-8-T-Zellen werden dann in beiden Assays mit Tumorzellen co-kultiviert, um den Tumorzelltod zu verursachen. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine prozentuale Lyse von Tumorzellen sowohl unter Verwendung der Impedanzmethode als auch des Chrom-Release-Assays zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Chrom-Release-Assay besteht darin, dass das impedanzbasierte System Echtzeitdaten sammelt und weniger Zellen benötigt, die keine Markierung benötigen. Für dieses Protokoll stellt Blut von normalen, gesunden HLA A-zwei positiven Spendern eine Quelle für pbmc oder mononukleäre Zellen aus peripherem Blut dar, die dem Protokoll des Herstellers folgen.

Verwenden Sie F call PA plus, um die P-BMCs vom Blut zu trennen. Als nächstes laden die Platten etwa 4 Millionen P-BMCs in zwei Milliliter Medium pro Vertiefung in sechs Vertiefungen. Zu jedem Peptid mit HLAA zwei für eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliterkultur gut zugeben.

Die Zellen an wechselnden Tagen, um die T-Zellen zu stimulieren und zu erweitern. Frisches Medium, ergänzt mit humanem rekombinantem IL 2, für eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter hinzufügen. Nach einer Woche wird eine Kultur aus autologem pbmc hergestellt, die Zellen bestrahlt und zwei Stunden lang mit der gleichen hla gepulst.

Ein zweibindendes Peptid mit 10 Mikrogramm pro Milliliter restimuliert die Kultur, indem es jeweils einen Milliliter des bestrahlten autologen PBM CS hinzufügt. Nun, fahren Sie fort, frische Medien hinzuzufügen, die an abwechselnden Tagen nach einer weiteren Woche mit IL zwei ergänzt werden, und stimulieren Sie die Kulturen auf die gleiche Weise ein zweites Mal. Nach weiteren sechs Tagen in Kultur sind die Zellen einsatzbereit.

Bereiten Sie die Intelligenzimpedanzmessstation für den Einsatz vor, indem Sie sie mindestens eine Stunde lang auf 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid ausgleichen. Ernte von 75 % konfluenten menschlichen Tumorzellen mit 0,25 % Trypsin und Zentrifugation. Zählen Sie die Tumorzellen mit einem Hämozytometer und rekonstituieren Sie sie in RPMI.

Tumormedien in einer Konzentration von 7.500 Zellen pro Mikroliter. Im nächsten Programm richtet die Excel-Agentensoftware die Layoutseite mit dem Well-Layout ein. Richten Sie die Zeitplanseite so ein, dass alle fünf Minuten für einen Zeitraum von 40 Stunden in den ersten 18 Stunden Impedanzmessungen durchgeführt werden, das Xcelligent-System misst nur die Impedanzmessungen der Tumorzellen.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter RPMI-Tumormedium pro Vertiefung hinzu. Führen Sie eine Hintergrundmessung der daraus resultierenden EPLs durch, indem Sie die Impedanz in Abwesenheit von Zellen messen. Nachdem die Tumorzellen hinzugefügt wurden, laden Sie die Platten in die dortige Station und beginnen Sie mit der Messung.

Die Tumorzellen beginnen sofort, sich an die EPLs zu heften. Nach etwa 18 Stunden Inkubation haben sich die Tumorzellen an die EPLs angeheftet und sich auf 15.000 Tumorzellen pro Vertiefung verdoppelt. Zu diesem Zeitpunkt werden die vorbereiteten T-Zellen durch schonendes Schaben und Rühren durch Zentrifuge geerntet.

Die T-Zellen rekonstituieren sie in RPMI-Medien mit 10% FBS und zählen sie mit einem Hämozytometer. Sobald die Zelldichte bekannt ist, bereiten Sie eine zweifache Verdünnungsreihe von T-Zellen vor, so dass, wenn 200 Mikroliter T-Zellen zu den Tumorzellen hinzugefügt werden, die höchste Konzentration 40 T-Zellen pro Tumorzelle beträgt. Die letzte Verdünnung der Serie sollte 1,25 T-Zellen pro Tumorzelle ergeben.

Halten Sie die EXOGEN-Station an und entfernen Sie den EPL mit einer Pipette. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und laden Sie dann 200 Mikroliter T-Zellen mit allen Konzentrationen aus der Verdünnungsreihe als Negativkontrolle. Verwenden Sie reine Medien, geben Sie den EPL an die dortige Station zurück und setzen Sie das Programm am Ende des Assays fort.

Normalisieren Sie die Ergebnisse. Befolgen Sie immer die institutionellen Strahlenschutzverfahren, wenn Sie mit Chrom-51- und Chrom-51-markierten Zielzellen arbeiten, und verwenden Sie die Abschirmung, um die Strahlenbelastung zu reduzieren. Beginnen Sie damit, Tumorzellen zwei Stunden lang bei 1 Million Zellen pro Milliliter mit 10 Mikrolitern pro Milliliter frischem Chrom 51 zu pulsieren.

Als nächstes waschen Sie die Tumorzellen in 10 Millilitern RPMI-Medien mit 10%FBS, zentrifugieren Sie die Zellen und rekonstituieren Sie sie im selben Medium mit 1 Million Zellen pro Milliliter. Dann zu einer 96 Well runden Bodenplatte. Fügen Sie 100.000 Tumorzellen pro Vertiefung hinzu, um die spontane Freisetzung zu berechnen.

Fügen Sie sechs dieser Vertiefungen zu sechs anderen Vertiefungen nichts anderes hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Triton X 100 hinzu, um die Zellen zu lyzieren und so die maximale Freisetzung in alle verbleibenden Vertiefungen zu berechnen. Geben Sie T-Zellen unter Verwendung der zuvor vorbereiteten Verdünnungsreihe in die Platte.

Inkubieren Sie nun die Platten fünf Stunden lang und sammeln Sie 50 Mikroliter Überstand von jedem, laden Sie die Proben gut auf eine Luma-Platte, nachdem Sie die Platten über Nacht in der Haube bei Raumtemperatur getrocknet haben. Messen Sie ihren CPM mit einer Gamma-Zähler-T-Zelle und SKBR drei. Krebszellen wurden auf X-Intelligenzplatten kultiviert und der Zellindex gemessen, der die Plattenimpedanz widerspiegelt, da T-Zellen keine Adhärenz benötigen, um sich zu vermehren.

Ihr Einfluss auf die Impedanz war über eine 40-Stunden-Kultur vernachlässigbar. Allein kultivierte Krebszellen zeigten eine zunehmende Impedanzmessung. Eine Zugabe von T-Zellen nach 18 Stunden unterbricht diesen Trend jedoch.

Dieses Ereignis erfordert eine Software-Normalisierung nach der Zugabe von T-Zellen und wird im nächsten Experiment weiter untersucht. Wenn SK BR drei Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von T-Zellen kokultiviert wurden, hing die Verringerung der Impedanz sehr deutlich von der Dosis der T-Zellen ab. Die Daten wurden alle fünf Minuten in drei Versuchen zur 10-Stunden-Marke erhoben. Die Zellindizes folgten einem Polynom zweiter Ordnung über den Bereich der T-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Exogen-Station den acht T-Zell-vermittelten Tod von SK B 3-Tumoren in Echtzeit als Abfall des Zellindex überwacht, um festzustellen, ob die Verringerung der Impedanz von SK BR drei durch die T-Zellen antigenspezifisch war.

SK KBR drei Zellen wurden mit HLA A co-kultiviert, zwei positive FLU-spezifische T-Zellen, die HER nicht erkennen, zwei neue. Diese Zellen wiesen eine signifikant geringere lytische Aktivität auf, um weiter zu bestimmen, ob ihre beiden neuen spezifischen T-Zellen auf antigenspezifische Weise abtöteten. Antikörper gegen schnelle Liganden wurden in die Co-Kulturen eingebaut. Der Antikörper reduzierte nicht die lytische Aktivität der beiden neuen P 360 9-spezifischen T-Zellen von HER.

Bei T-Zellen, die unspezifisch mit Anti-CD 3, CD 28-Kügelchen aktiviert wurden, hemmte der Antikörper jedoch die Lyse, um festzustellen, ob die Tötung in Abhängigkeit von der HLA-Klasse 1 erfolgte. Den Co-Kulturen wurde entweder ein Anti-HLA-Antikörper der Klasse 1 oder ein Isotyp-Kontrollantikörper zugesetzt. Die Ergebnisse stützten diese Hypothese nachdrücklich.

Als nächstes wurden T-Zellen mit anderen Krebszellen im Verhältnis eins zu fünf kokultiviert. Als Negativkontrolle wurde die HLA A zwei negative Tumorzelllinie BT 20 verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode für mehrere Ziel-adhärente Tumorzellen nützlich ist.

Co-Kulturen der HER zwei neuen P 360 9 spezifischen T-Zellen wurden zu Chrom 51 markierten Zielzellen hinzugefügt, gefolgt von einer CRA-Analyse. Der Intelligenz-Assay scheint empfindlicher zu sein, um die Konsistenz zu analysieren. Die Intra-Assay-Variation wurde als prozentualer Variationskoeffizient bei jedem Zellverhältnis zwischen eins bis 40 und eins zu fünf berechnet.

Dieser lag bei den niedrigsten Zellverhältnissen unter 15 %. Der prozentuale CV war jedoch hoch oder unvorhersehbar. Zusätzlich wurde die Variabilität der SK BR drei T-Zell-Lyse durch Co-Kultur mit verschiedenen P 360 9 spezifischen T-Zelllinien untersucht.

Die Daten wurden im Abstand von 30 Tagen generiert. Die Untersuchungsergebnisse wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Ergebnisse waren sehr ähnlich. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die zytotoxische T-Zellaktivität mit antigenspezifischen Zölia-8-T-Zellen und Tumorzellen unter Verwendung eines impedanzbasierten Ansatzes bestimmen können.