Name: Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die zytotoxische Aktivität von CD8 T-Zellen mit dem impedanzbasierten xCELLigence-System vergleichend zum Chrom-Freisetzungsassay bestimmen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring mit höherer Sensitivität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu Keith L. Knutson von der Susan G. Komen for the Cure Foundation und NIH / NCI 9R01 CA152045 und P50-CA116201 unterstützt.

<ol><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li>
<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li>
<li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li>
<li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li>
<li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+a+HER-2%2Fneu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2%2Fneu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li>
<li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta%2FTNF%28alpha%29-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li>
<li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li>
<li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li>
</ol>

Produktion und freien Zugang von diesem Video-Artikel wird von Roche Diagnostics gesponsert.

CD8-T-Zellen sind wichtig für die adaptive Immunantwort, die Möglichkeit, direkt zu töten infizierte oder maligne Zellen 4. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten, um die Zahl von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen (zB ELIspot, Tetramer, Durchflusszytometrie) messen sind, ist es oft hilfreich zu wissen, ob diese Zellen funktionell zytotoxischen 3 sind. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die CRA, die als Goldstandard Assay 4. Wesentliche Einschränkungen der CRA sind (1) das Erfordernis der Radioaktivität, (2) mangelnde Sensibilität, (3) Mangel an mechanistische Informationen, (4) Voraussetzung für große Mengen von Zellen, und (5) aufwändige Einrichtung. So im letzten Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu minimieren. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esterase activity5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die vorliegende Manuskript darauf hin, dassdie Impedanz-basierten Assays, auf der Roche XCELLIGENCE System durchgeführt wird, kann auch nützlich sein, als Alternative zu der CRA. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen, die nicht beachtet dicht an Oberflächen, scheinen nicht viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen bei der Messung haben. Die Arbeit für die Verwendung der Impedanz-Assay-System benötigt wird erwartet, dass deutlich weniger erster Linie auf den Wegfall der regulatorischen betrifft die Verwendung von Radioaktivität. Die einzige nennenswerte Nachteil der Impedanz-basiertes System ist, dass ein Aufwand von $ 50.000 bis $ 60.000 für den Kauf des XCELLIGENCE Einheit erforderlich ist. Jedoch eliminiert die XCELLIGENCE Einheit die Notwendigkeit einer Strahlung Zähler und ist vielseitiger, nützlich ist für die Beurteilung der zellulären Antwort auf Drogen und Migration zusätzlich zu T-Zell-Zytotoxizität 8. Die Beobachtungen, dassdie Verminderung in Tumorzellen Impedanz ist dosisabhängig schlägt, wie in 2 dargestellt ist, mit einer relativ steilen Steigung nach einem einfachen sekundären quadratischen Funktion, dass der Test in limitierender Verdünnung Assays (LDA), um die Frequenz von zytotoxischen Zellen 9 Abschätzen verwendet werden . Ein Vorteil, der mit der Impedanz-Ansatz ist, dass die Zahl der T-Zellen und Tumorzellen erforderlich kleiner als der CRA ist, so dass LDA potentiell durchführbar. Zum Beispiel in der CRA bei einer 1.40 Verhältnis, 1 x 10 5 Tumorzellen pro Vertiefung ausplattiert, welche benötigt 4 x 10 6 insgesamt T-Zellen pro Vertiefung. In der Impedanz-basierten Test werden nur 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung Tumor benötigt, die verbraucht nur 6 x 10 5 Gesamt-T-Zellen pro well. Somit verwendet die Impedanz-Assay 85% weniger T-Zellen und Tumorzellen. Diese Reduktion legt nahe, dass die Impedanz-basiertes System zur immunologischen Überwachung könnte in klinischen Studien am Menschen angepasst werden, wobei ter Mengen von Blutabnahmen kann begrenzt werden. Auch wenn das CRA zu einem einzigen Zeitpunkt begrenzt wird, sammelt sich die Impedanz-Assay kontinuierliche Echtzeit-Daten, so dass der Benutzer mehrere Lyse Zeitpunkten auf demselben Experiment mit minimaler zusätzlicher Arbeits-und Zellen zu vergleichen. Frequenzberechnungen möglicherweise mit anderen Strategien, die nicht messen Funktion wie Tetramer-Analysen, um das Verhältnis von funktionellen zytotoxische T-Zellen zur gesamten Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen 10 herzustellen kombiniert werden. Eines der attraktiven Merkmale des Impedanz-Ansatzes besteht darin, dass, im Gegensatz zu den meisten anderen Assays Zytotoxizität in Echtzeit überwacht werden, möglicherweise macht es einfacher, zelluläre Interaktionen mit der Verwendung von Inhibitoren oder Antikörpern zu studieren. Ein weiterer Grund ist, dass das Verfahren geeignet sein können Tumorzellen, die Kennzeichnung zu widerstehen. Schließlich, da die nicht abgetöteten Tumorzellen nicht beschriftet und steril bleiben weiter Ernte und Untersuchung der T-Zell-resistente Zellen possible. Zusammenfassend, wenn beide Systeme Tumorabtötung Daten in Reaktion auf spezifische T-Zellen zu schaffen, ist die Impedanz-Assay empfindlicher als der CRA und bietet eine flexible Plattform.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Zur Isolierung von PBMCs aus Blut verwendet </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Zellkulturmedien </td></tr><tr><td>FBS </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Zellkulturmedien </td></tr><tr><td>Menschliches IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>Zur Stimulation des Wachstums von T-Zellen </td></tr><tr><td>Humanes Interferon-gamma </td><td>Zellwissenschaften</td><td>CR2026</td><td>Zur Stimulierung der MHC-Expression in Tumorzellen </td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377-Peptid </td><td>Mayo Clinic Peptidsynthese-Plattform</td><td>Aminosäuresequenz KIFGSLAFL</td><td>Bindet an HLA-A2 </td></tr><tr><td>Influenza-p58-66-Peptid </td><td>Mayo Clinic Peptidsynthese-Plattform</td><td>Aminosäuresequenz GILGFVFTL</td><td>Bindet an HLA-A2 </td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Für die unspezifische T-Zell-Aktivierung und -Expansion </td></tr><tr><td>Chrom-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA-Markierungreagenz </td></tr><tr><td>E-Platte </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche-Gruppe</a></td><td>05469830001</td><td>Für xCelligence Impedanzgerät </td></tr><tr><td>Luma-Platte 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Zur Messung der Radioaktivität im Top Count NXT. </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP Station </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>Impedanz-Einheit </td></tr><tr><td>Oben Anzahl NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Szintillation &amp;amp; Lumineszenz-Zähler </td></tr><tr><td>Fas-Ligand-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Zur Blockade der Fas-Fas-Ligand-Interaktionen</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>Zur Blockade von HLA-Klasse-I</td></tr><tr><td>Maus-IgG2b, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>Isotypkontrolle für HLA-Klasse-I</td></tr><tr><td>SKBR3-Tumorzelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Adenokarzinom</td></tr><tr><td>MCF7-Tumorzelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Adenokarzinom</td></tr><tr><td>HCC1419 Tumorzelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Primäres duktales Karzinom</td></tr><tr><td>BT20-Tumorzelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Karzinom</td></tr></tbody></table>

bestimmung der optimalen zytotoxische aktivität der menschenrechte her2neu spezifischen cd8 t-zellen durch vergleich der cr51 freisetzungsassay dem xcelligence-system

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Zytotoxische CD8 T-Zellen stellen eine Untergruppe von T-Zellen, die zur Induktion der Tod von infizierten oder malignen Wirtszellen 1 sind. Diese Zellen exprimieren einen speziellen Rezeptor, den sogenannten T-Zell-Rezeptor (TCR), der eine spezifische antigene Peptid gebunden an HLA-Klasse-I-Moleküle 2 erkennen kann. Der Eingriff der infizierten Zellen oder Tumorzellen durch ihre HLA Klasse I-Molekül resultiert in der Herstellung von lytischen Moleküle wie Granzymen und Perforin was Ziel Zelltod. Obwohl es nützlich ist, um Frequenzen von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen unter Verwendung von Assays, wie die ELIspot oder Durchflusszytometrie bestimmen, ist es auch nützlich, um die Stärke der CD8 T-Zell-Antworten mit Zytotoxizitätsassays 3 ermitteln. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die Chromfreisetzungsassay (CRA), die als ein Standard-Test 4 ist. Die CRA hat einige Einschränkungen, einschließlich Exposition von Zellen gegenüber Gammastrahlung, lack Reproduzierbarkeit und eine Anforderung für eine große Anzahl von Zellen. Im vergangenen Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu überwinden. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esteraseaktivität 5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die Impedanz-Assay, mit dem Roche XCELLIGENCE-System wurde in der vorliegenden Arbeit auf sein Potential als Alternative zu der CRA untersucht. Impedanz oder Widerstand gegen elektrischen Strom erfolgt, wenn adhärenten Tumorzellen Elektrodenplatten binden. Tumor-Zellen nach Tötung lösen und elektrische Impedanz verringert, was durch die XCELLIGENCE gemessen werden. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen Zell-vermittelte Tötung beurteilen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen nicht fest haften auf den meisten Oberflächen und scheinen nicht zu viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen haben beidie Messung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Impedanz-basierten Assay kann Veränderungen der Konzentrationen von Antigen-spezifischen zytotoxischen CD8-T-Zellen mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber dem Standard CRA erkennen. Basierend auf diesen Ergebnissen kann Impedanz-basierte Ansätze gute Alternativen zu Ratingagenturen oder andere Ansätze, die zytotoxische CD8 T-Zell-Funktionalität messen Ziel sein.

Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Zytotoxische CD8-T-Zellen stellen eine Untergruppe von T-Zellen dar, die in der Lage sind, den Tod von infizierten oder malignen Wirtszellen zu induzieren1. Diese Zellen exprimieren ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zytotoxische T-Zell-Aktivität zu bestimmen, indem ein impedanzbasiertes Verfahren mit dem EXOGEN-System mit dem Chromfreisetzungsassay verglichen wird. Der erste Schritt erfolgt durch die Isolierung peripherer mononuklearer Blutzellen aus Vollblut unter Verwendung von Fial. Anschließend werden die PBMC zusammen mit peptidischen Antigenen, humanem rekombinantem IL-2 und bestrahlten PBMC in die Vertiefungen gegeben, um antigenspezifische CD8+-T-Zellen zu erzeugen.Die antigenspezifischen CD8+-T-Zellen werden anschließend in beiden Assays mit Tumorzellen koinkubiert, um den Tod der Tumorzellen zu verursachen. Die Ergebnisse zeigen den Prozentsatz der Lyse der Tumorzellen, ermittelt mittels der Impedanzmethode und des Chromfreisetzungstests. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem Chromfreisetzungstest besteht darin, dass das impedanzbasierte System Echtzeitdaten erfasst und weniger Zellen benötigt, die keiner Markierung bedürfen. Für dieses Protokoll liefert Blut von gesunden, HLA-A2-positiven Spendern eine Quelle für PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) gemäß der Anleitung des Herstellers.Verwenden Sie F call PA plus, um die P-BMCs aus dem Blut zu isolieren. Anschließend geben Sie etwa 4 Millionen P-BMCs in zwei Milliliter Medium pro Vertiefung in eine sechswellige Platte. Geben Sie jedem Brunnen HLAA-2-Bindungspeptid hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter Kultur zu erreichen.Die Zellen an abwechselnden Tagen, um T-Zellen zu stimulieren und zu expandieren. Frisches Medium zugeben, das mit humanem rekombinantem IL-2 supplementiert ist, um eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Nach einer Woche eine Kultur autologer PBMCs vorbereiten, die Zellen bestrahlen und sie zwei Stunden lang mit dem gleichen HLA pulsieren lassen.Ein zwei Bindungs-Peptid in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter stimuliert die Kultur erneut, indem ein Milliliter der bestrahlten autologen PBM CS zu jedem Ansatz gegeben wird. Fügen Sie weiterhin alle zwei Tage frisches Medium, das mit IL-2 ergänzt ist, hinzu. Nach einer weiteren Woche stimulieren Sie die Kulturen auf dieselbe Weise ein zweites Mal. Nach weiteren sechs Tagen im Kulturansatz sind die Zellen gebrauchsfertig.Bereiten Sie die Impedanz-Messstation für die Anwendung vor, indem Sie sie mindestens eine Stunde lang unter 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius äquilibrieren. Gewinnen Sie humane Tumorzellen mit 75 % Konfluenz mithilfe von 0,25 % Trypsin und Zentrifugation. Zählen Sie die Tumorzellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie sie in RPMI.Tumor-Medium mit einer Konzentration von 7.500 Zellen pro Mikroliter. Im nächsten Schritt richtet die Excel-Agenten-Software die Layout-Seite mit der Wells-Anordnung ein. Richten Sie die Zeitplan-Seite so ein, dass alle fünf Minuten über einen Zeitraum von 40 Stunden Impedanzmessungen durchgeführt werden. Für die ersten 18 Stunden führt das Xceligent-System lediglich Impedanzmessungen der Tumorzellen durch.Dann 100 Mikroliter RPMI-Tumor-Medium pro Vertiefung hinzufügen. Eine Hintergrundmessung an den EPLs vornehmen, indem die Impedanz in Abwesenheit von Zellen gemessen wird. Nachdem die Tumorzellen hinzugefügt wurden, die Platten in die Station laden und mit der Aufnahme von Messwerten beginnen.Die Tumorzellen beginnen unmittelbar mit der Adhäsion an die EPLs. Nach einer Inkubation von etwa 18 Stunden haben sich die Tumorzellen an die EPLs angeheftet und sich auf 15.000 Tumorzellen pro Mulde verdoppelt. Zu diesem Zeitpunkt werden die vorbereiteten T-Zellen durch vorsichtiges Abkratzen und Zentrifugation unter Schütteln gewonnen.Die T-Zellen in RPMI-Medium mit 10 % FBS resuspendieren und mit einem Hämozytometer zählen. Sobald die Zelldichte bekannt ist, eine Verdünnungsreihe der T-Zellen im Verhältnis 1:2 herstellen, sodass beim Hinzufügen von 200 Mikrolitern T-Zellen zu den Tumorzellen die höchste Konzentration 40 T-Zellen pro Tumorzelle beträgt. Die letzte Verdünnung der Reihe sollte 1,25 T-Zellen pro Tumorzelle ergeben.Pausieren Sie die EXOGEN-Station und entfernen Sie das EPL mit einer Pipette. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie dann 200 Mikroliter T-Zellen mit allen Konzentrationen aus der Verdünnungsreihe als Negativkontrolle hinzu. Verwenden Sie reines Medium, stellen Sie das EPL anschließend wieder in die Station zurück und setzen Sie das Programm am Ende des Assays fort.Normalisieren Sie die Ergebnisse. Befolgen Sie stets die strahlenschutzrechtlichen Vorschriften der Institution, wenn Sie mit Chrom 51 und mit Chrom 51 markierten Zielzellen arbeiten, und verwenden Sie Abschirmungen, um die Strahlenexposition zu reduzieren. Beginnen Sie damit, Tumorzellen für zwei Stunden bei einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter mit 10 Mikrolitern pro Milliliter frischem Chrom 51 zu belasten.Als Nächstes waschen Sie die Tumorzellen in 10 Milliliter RPMI-Medium mit 10 % FBS, zentrifugieren die Zellen und resuspendieren sie in dem gleichen Medium auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann 100.000 Tumorzellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Rundbodenplatte, um die spontane Freisetzung zu bestimmen.Fügen Sie nichts zu sechs dieser Vertiefungen hinzu, sondern zu sechs anderen Vertiefungen. Geben Sie 100 Mikroliter Triton X-100 hinzu, um die Zellen zu lysieren und somit die maximale Freisetzung in alle verbleibenden Vertiefungen zu berechnen. Geben Sie T-Zellen in die Platte, indem Sie die zuvor vorbereitete Verdünnungsreihe verwenden.Jetzt die Platten fünf Stunden inkubieren und 50 Mikroliter Proben des Überstandes von jeder Vertiefung entnehmen; laden Sie die Proben nach dem Trocknen der Platten über Nacht bei Raumtemperatur im Abzug auf eine Luma-Platte auf. Messen Sie deren CPM mit einem Gammazähler T-Zelle und SKBR drei. Krebszellen wurden auf X-Intelligenz-Platten kultiviert, und der Zellindex wurde gemessen, der eine Reflexion der Plattenimpedanz darstellt, da T-Zellen keine Anheftung zur Proliferation benötigen.Ihr Einfluss auf die Impedanz war über eine 40-stündige Kultur hinweg vernachlässigbar. Krebszellen, die allein kultiviert wurden, zeigten eine zunehmende Impedanzmessung. Die Zugabe von T-Zellen nach 18 Stunden unterbricht jedoch diesen Trend.Dieses Ereignis erfordert eine Software-Normalisierung nach der Zugabe von T-Zellen und wird im nächsten Experiment weiter untersucht. Wenn SK-BR-3-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von T-Zellen koinkubiert wurden, waren die Abnahmen der Impedanz sehr deutlich dosisabhängig; die Daten wurden im Zehn-Stunden-Zeitraum über drei Versuche hinweg alle fünf Minuten erfasst. Die Zellindizes folgten über den Bereich der T-Zellen hinweg einem Polynom zweiter Ordnung, was darauf hindeutet, dass die Exogen-Station den CD8-T-Zell-vermittelten Zelltod von SK-BR-3-Tumoren in Echtzeit als Abnahme des Zellindex überwacht, um zu bestimmen, ob die Impedanzabnahmen von SK-BR-3 durch die T-Zellen antigenspezifisch sind.SK-KBR-Dreierzellen wurden zusammen mit HLA-A2-positiven, FLU-spezifischen T-Zellen kultiviert, die HER2/neu nicht erkennen. Diese Zellen wiesen eine signifikant geringere lytische Aktivität auf. Um weiter zu untersuchen, ob die HER2/neu-spezifischen T-Zellen auf antigenspezifische Weise töten, wurde ein Antikörper gegen das Fas-Ligand in die Koinkubationen eingefügt. Der Antikörper verringerte die lytische Aktivität der HER2/neu-P360-9-spezifischen T-Zellen nicht.Jedoch bei T-Zellen, die unspezifisch mit Anti-CD3-, CD28-Perlen aktiviert wurden, hemmte der Antikörper die Lyse, um zu bestimmen, ob die Zerstörung auf HLA-Klasse-I-abhängige Weise erfolgte. Entweder ein Anti-HLA-Klasse-I-Antikörper oder ein Isotyp-Kontrollantikörper wurden den Kokulturen hinzugefügt. Die Ergebnisse unterstützten diese Hypothese stark.T-Zellen wurden anschließend im Verhältnis eins zu fünf mit anderen Krebszellen koinkubiert. Die HLA-A2-negative Tumorzelllinie BT-20 diente als negativer Kontrollstamm. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode für mehrere Ziel-adhärente Tumorzellen geeignet ist.Kokulturen der HER2-spezifischen T-Zellen P360.9 wurden zu mit Chrom-51 markierten Zielzellen hinzugefügt, gefolgt von einer CRA-Analyse. Der Intelligenztest scheint empfindlicher, um die Konsistenz zu analysieren. Die intraassay-Variation wurde als prozentualer Variationskoeffizient bei jedem Zellverhältnis zwischen 1:40 und 1:5 berechnet.Dieser Wert lag bei den niedrigsten Zellverhältnissen unter 15 %. Allerdings war der prozentuale CV hoch oder unvorhersehbar. Zusätzlich wurde die Variabilität der SK BR drei-vermittelten T-Zelllyse durch Ko-Kultur mit verschiedenen P 360 9-spezifischen T-Zelllinien untersucht.Die Daten wurden 30 Tage auseinander generiert. Die Assays wurden im Dreifachansatz durchgeführt und zeigten sehr ähnliche Ergebnisse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die zytotoxische T-Zell-Aktivität unter Verwendung antigenspezifischer CD8-T-Zellen und Tumorzellen mithilfe eines impedanzbasierten Ansatzes bestimmen kann.

determining-optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-specific-cd8-t

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Ein hochgenaues In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-System wurde entwickelt, um Krebsmedikamente unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) zu bewerten, ähnlich wie Krebsgewebe, aber für In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-Systeme mit 96-Well- und 384-Well-Platten ungeeignet sind.

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für einen Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizitäts-Assay (ADCC) unter Verwendung eines ADCC-Bioassay-Kits vor. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um den ADCC-Mechanismus aufzuklären und das therapeutische Potenzial von Antikörpern in der Krebsimmuntherapie zu bewerten.

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Wir präsentieren einen validierten Sandwich-ELISA-Assay mit neuartigen monoklonalen Anti-HER2-Antikörpern. Dieser Assay ermöglicht die präzise Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein aus in vitro kultivierten Zellen und anderen Proben, einschließlich Blut und Geweben.

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie, wie Sie die zytotoxische Aktivität von CD8 T-Zellen mit dem impedanzbasierten xCELLigence-System vergleichend zum Chrom-Freisetzungsassay bestimmen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring mit höherer Sensitivität.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Weitere Videos entdecken