Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Pool des Toxins, der in das Cytosol gelangt, nachzuweisen und zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wird das Toxin zunächst bei vier Grad Celsius an die Oberfläche der Wirtszelle gebunden. Das nicht gebundene Toxin wird anschließend entfernt, und die Zellen werden auf 37 Grad Celsius erwärmt, wodurch die Bewegung des Toxins in das Endomembransystem und danach in das Wirtscytosol ermöglicht wird. Dig Tonin wird dann verwendet, um selektiv die Plasmamembran nach der Zellpermeabilisierung zu durchlässig zu machen.

Die Zellextrakte werden mithilfe einer Differenzialzentrifugation in separate Membran- und zytoplasmatische Fraktionen aufgeteilt, wobei als letzter Schritt die Oberflächen-Plasma-Resonanz (Abkürzung SBR) verwendet wird, um den Eintritt des Toxins in das Zytoplasma nachzuweisen und zu quantifizieren, indem die zytoplasmatische Fraktion über einen SPR-Sensor gepumpt wird, der mit einem Antitoxin-Antikörper beschichtet ist. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen im Bereich der Toxinbiologie zu beantworten, beispielsweise die Effizienz und Kinetik des Toxineintritts ins Zytoplasma, die Menge des eingetretenen Toxins sowie mögliche hemmende Wirkungen von Wirkstoffen auf den Transport des Toxins ins Zytoplasma. Vor Beginn dieses Protokolls bereiten Sie die Heli-Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll für die Zellvergiftung vor, nachdem die Hela-Zellen eine Übernachtsinkubation durchlaufen haben.

Ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein Milliliter DMEM, das 100 Nanogramm pro Milliliter Gangliosid GM1 enthält, und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Dies erhöht die Anzahl der Bindungsstellen für Cholera-Toxin. Da das Toxin GM1 als Rezeptor in die Plasmamembran von Zellen einlagert, die einer GM1-Lösung ausgesetzt sind.

Nach einer einstündigen Inkubation das GM-Medium entfernen und die Zellen zweimal mit DMEM waschen. Anschließend ein Milliliter DMEM, das ein Mikrogramm pro Milliliter Cholera-Toxin enthält, hinzufügen und die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Das Toxin enthaltende Medium entfernen und die Zellen erneut zweimal waschen.

Anschließend die Zellen in einem Milliliter DMEM für die gewünschte Zeit bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Ende jeder Chase-Periode die Zellen mit PBS waschen und anschließend jede Vertiefung mit 250 Mikrolitern 0,5 Millimolar EDTA in PBS inkubieren. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis die Zellen aus der 6-Loch-Platte durch kräftiges TRI mit einer P-1000-Pipette entfernen.

Nachdem eine Vertiefung mit Zellen gesammelt wurde, kombinieren Sie sie mit der zweiten und anschließend der dritten Vertiefung derselben Bedingung. Geben Sie anschließend die vereinigte Zellsuspension aus den drei Replikatvertiefungen in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie nun das Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten lang in einer Tischmikrozentrifuge.

Bei 5.000 × g sollten Zellpellets von annähernd gleicher Größe für alle Bedingungen erhalten werden. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 µL einer zuvor hergestellten und gekühlten 0,04 %igen Arbeitslösung von Digitonin. Stellen Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie die Digitonin-permeabilisierten Zellen anschließend in einer Tischmikrozentrifuge 10 Minuten bei 16.000 × g.

Überführen Sie das cytosolische Überstandsfaktionsmaterial in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie die pelletierte Fraktion, die Organellen enthält. SPR-Toxinstandards werden in Konzentrationen von einhundert, zehn, eins und 0,1 Nanogramm pro Milliliter in HCN-Puffer hergestellt. Proben werden durch Verdünnen der cytosolhaltigen Überstandfraktionen in HCN-Puffer auf ein Endvolumen von einem Milliliter hergestellt. Probenvolumina von mindestens einem Milliliter sind erforderlich, um sicherzustellen, dass Luft aus der 500-Mikroliter-Probenloop vor der Injektion verdrängt wird. Die pelletierte, Organellen enthaltende Fraktion wird in einem Milliliter HCN-Puffer mit 1 % Triton X-100 resuspendiert.

Die Zugabe eines Detergens ist notwendig, um den in der Membran eingeschlossenen Toxinpool freizusetzen. Bereiten Sie außerdem parallele Sätze von zytosolischen und Organ-L-Fraktionen für ein Kontrollexperiment vor, um die Zuverlässigkeit des Fraktionierungsverfahrens zu bestätigen. Resuspendieren Sie die zytosolische Fraktion in 20 Mikroliter Vierfach-Probelösungspuffer und die Organ-L-Fraktion in 120 Mikroliter Einfach-Probelösungspuffer. Trennen Sie äquivalente Volumina jeder Fraktion mittels Natrium-ESAL-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und analysieren Sie sie durch Western-Blot, um die Verteilung eines zytosolischen Proteins in der Überstandfraktion und eines löslichen, im ER lokalisierten Proteins in der Pelletfraktion nachzuweisen. Zum Vorbereiten des SPR-Slides platzieren Sie zunächst einen goldbeschichteten Glas-Slide mit einer selbstorganisierten Monoschicht im SPR-Instrument.

Aktivieren Sie die Sensorscheibe, indem Sie 10 Minuten lang eine E-D-C-N-H-S-Lösung mit einer Flussrate von 41 Mikrolitern pro Minute über die Scheibe leiten. Bei allen nachfolgenden Perfusionsvorgängen verwenden wir dieselbe Flussrate. Entfernen Sie den E-D-C-N-H-S-Aktivierungspuffer, indem Sie die Platte fünf Minuten lang mit PBS, der 0,05 %2020 enthält, waschen.

Die Platte enthält nun reaktive MI-Anker, die durch die Entfernung der Schutzgruppen mittels der E-D-C-N-H-S-Lösung freigesetzt wurden. Danach wird ein Anti-CTA-Antikörper in einer Verdünnung von 1 zu 20.000 in 20 Millimolar Natriumacetat 15 Minuten lang über die aktivierte Sensorscheibe perfundiert. Ein initialer Abfall der Brechungsindexeinheit, abgekürzt RIU, ist aufgrund der pH-Änderung zu beobachten.

Daraufhin folgt eine Zunahme des RIU, da der Antikörper durch die amidreaktiven Ankerbindungen gebunden wird. Auf dem Sensorschlitten entfernen Sie den nicht gebundenen Antikörper durch eine fünfminütige PBST-Waschung vom Sensorschlitten. Das durch den gebundenen Antikörper erzeugte RIU-Signal erreicht einen Plateauzustand und stabilisiert sich, wodurch ein neues Basissignal bereitgestellt wird.

Als letzten Schritt bei der Vorbereitung des Objektträgers wird eine molare Ethanolaminlösung fünf Minuten lang über den Sensorobjektträger perfundiert. Dadurch werden verbliebene, nicht gebundene Ankerstrukturen am Sensorobjektträger abgeschlossen und inaktiviert. Das RIU-Signal steigt an, um eine Basislinienmessung zu etablieren; anschließend wird fünf Minuten lang PBST über den mit Antikörper beschichteten Sensor perfundiert.

Danach 300 Sekunden lang eine experimentelle Probe oder Toxin-Standard über den Sensor perfundieren. Den Liganden aus dem Puffer entfernen und weitere 200 Sekunden lang PBST über den Sensor perfundieren. Jegliches Toxin, das weiterhin an den Sensor gebunden ist, wird durch eine 102. Wäsche mit PBST bei pH 5,0 entfernt.

Dadurch kehrt das Signal zu seinem ursprünglichen Basislinienwert zurück, wodurch eine weitere Probe auf demselben Sensor verarbeitet werden kann. Vor dem Laden einer neuen Probe geben Sie eine kleine Menge Luft durch die Probenschleife, um restliche Flüssigkeit der vorherigen Probe zu entfernen. Nach der Erfassung.

Die Daten können mit der Scrubber-Software analysiert werden, und die Igor-Software kann zur Erstellung der Abbildungen verwendet werden. Pertussistoxin ist ein AB-Toxin, das von der Zelloberfläche zum ER wandert, bevor seine A-Kette in das Zytoplasma gelangt.

Der auf SPR basierende Translokationsassay konnte PTs im Cytosol vergifteter CHO-Zellen nachweisen. Vom Cytosol nicht vergifteter Zellen ging kein Signal aus, was die Spezifität der Anti-PTs bestätigte. Ein Antikörper zeigte keine Kreuzreaktion mit einer Komponente des Wirtscytosols.

Die Zytosol-Fraktion von Zellen, die in Gegenwart von Felden. A intoxiziert wurden, zeigte ebenfalls kein positives Signal; BFA verhindert den Transport des Toxins zur ER-Translokationsstelle und somit die Freisetzung der H-Kette in das Zytosol. Choletoxin ist ein weiteres AB-Typ-Toxin, das in das ER transloziert.

CTA1 wurde in der zytoplasmatischen Fraktion aus CT-behandelten Helo-Zellen nachgewiesen. Dies verdeutlicht, dass die Methodik mit verschiedenen Zelltypen funktioniert und auf jedes Toxin angewendet werden kann, für das ein Antikörper gegen die A-Kette verfügbar ist. Kein Signal wurde detektiert, als die zytoplasmatische Fraktion aus CT-behandelten Zellen über einen SPR-Sensor geleitet wurde, der mit einem anti-CTB-Antikörper beschichtet war, was zeigt, dass im Gegensatz zum CTA1-Subunit das zellbindende CTB-PENTAMER nicht in das Zytoplasma gelangt.

Nach der Überströmung über einen SPR-Sensor, der mit einem anti-CTA-Antikörper beschichtet ist. Das Signal aus dem Organellen-Fraktion ist im Vergleich zum schwächeren Signal aus der zytosolischen Fraktion außerhalb der Skala. Dies steht im Einklang mit der bekannten Ineffizienz des CT-Transports zur ER-Translokationsstelle, was wiederum die Menge des Toxins begrenzt, die das Zytosol erreichen kann.

Die zeitabhängige Anreicherung des translozierten zytosolischen Toxins kann ebenfalls überwacht werden. Nach der Exposition der Zellen gegenüber CT bei vier Grad Celsius wurde 15 Minuten nach dem Erwärmen auf 37 Grad Celsius kein Toxin im Zytosol nachgewiesen.

Ein geringer Anteil des zytosolischen Toxins wurde nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius nachgewiesen, und nach den Verfolgungsintervallen von 45 und 60 Minuten wurden progressiv größere Mengen des zytosolischen Toxins detektiert. Dies zeigt eine kontinuierliche Langzeitfreisetzung von zellgebundenem Toxin in das Wirtszytosol. Der Assay kann zudem die Hemmung der Toxintranslokation in das Zytosol nachweisen; Zellen, die mit 10 % DMSO behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu den unbehandelten, toxisch belasteten Kontrollzellen geringe Mengen an zytosolartigem CT auf, was mit der Entfaltung des Toxins einhergeht.

Eine Kette ist eine Voraussetzung für die Translokation in das Cytosol, daher verhinderte die durch DMSO induzierte Stabilisierung von CT A1 entsprechend dessen Bewegung vom ER ins Cytosol. Um die durch DMSO hervorgerufene Blockade der Toxin-Translokation zu quantifizieren, wurde eine Standardkurve, die aus bekannten Toxin-Konzentrationen erstellt wurde, verwendet, um eine cytosolische cta1-Konzentration von 0,3 Nanogramm pro Milliliter für unbehandelte Zellen und 0,1 Nanogramm pro Milliliter für mit DMSO behandelte Zellen zu berechnen. Die Hemmung der Entfaltung von CT A1 durch DMSO führte somit zu einer dreifachen Verringerung der Translokation von CT A1 vom ER ins Cytosol.

Mit dieser Methode können wir andere Techniken wie Intoxikationsassays nutzen, um einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge des im Cytosol vorhandenen Toxins und der Toxinaktivität herzustellen.