Name: In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Lernen Sie die Messung der Kontraktilität von trachealem glattem Muskel bei Mäusen mittels in-vitro-Tensometrie isolierter Trachealringe. Diese Methode ermöglicht direkte Untersuchungen physiologischer und pharmakologischer Mechanismen der Atemwegsverengung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Zentrum für Innovation in der Prävention und Behandlung von Atemwegserkrankungen, NINDS Grant (NS052574), und von der Sandler-Programm für Asthma-Forschung finanziert.

1. Ausrüstung Die Hauptkomponenten einer Kontraktion Messvorrichtung sind schematisch in 2A gezeigt). <ol><li> Ein Bad Gewebe. Das Gewebe Bad unterhält ein sauerstoffreiches physiologischen Lösung bei warmen Temperaturen. Bei Mäusen Trachea Ringe, verwenden wir ein 10 ml Gewebe Bad, das einen Wassermantel enthält zum Zirkulieren eines Erwärmung Lösung, eine Glasfritte Einlaß zu sprudeln Sauerstoff (95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch) und Einlass und Auslassöffnungen zum Ändern Lösungen. Ein Reservoir PSS-Lösung mit konstanter Durchblasen von 95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch bei 37 ° C Wasserbad (nicht gezeigt). Gespeicherten Zur Lösung Austausch, wird PSS-Lösung von dem Reservoir zu dem Gewebe Wanneneinlauf (Ausrichtung) bei etwa 100 ml pro Minute gepumpt wird, um relativ schnelle Lösung Austausch zu ermöglichen. Die Lösung-Auslass ist durch einen Überlauf (obere Öffnung), die mit konstantem Volumen (~ 10 ml) ermöglicht im Gewebe Schlägerh während der Lösung Austausch. Wir verwenden eine Haake Umwälzthermostat zu warmes Wasser durch das Gewebe zu pumpen Bad Jacke (bis 37 ° C zu halten). Tissue Bäder können aus einer Reihe von Lieferanten bezogen werden und kommen in einer Vielzahl von Größen und Stile, um die experimentellen Bedürfnisse der Ermittler passen. </li><li> Ein Kraftaufnehmer. Um isometrische Spannung zu messen, wird die Luftröhre Rohr über L-förmigen Enden von zwei Edelstahl-Stangen (Abbildung 2A) eingefädelt. Es sollte darauf geachtet, eine Edelstahl-Typ, die kompatibel mit biologischem Material ist zu verwenden. Die obere Stange wird über einen Clip mit einem isometrischen Kraftaufnehmer verbunden. Die untere Stange hält die Trachea an einer festen Position, und auf einem Mikrometer zur Einstellung der passive Spannung und / oder Muskellänge montiert. Die Kontraktion der Trachea eine Spannung auf den Kraftaufnehmer, was zu einer Spannung an die Vorverstärker umgewandelt wird. Die untere Stange kann auch so konfiguriert, dass zwei rechteckige Platten Platin (4 mm voneinander entfernt) t erweitert werden<html> Hut flankieren die Luftröhre (Abbildung 2B). Die Platin-Platten sind an einem Grass S88 Stimulator, die Abgabe eines elektrischen Feldes über die Trachea ermöglicht verdrahtet. Offene Drähte und löten sind mit Sylgard (Sylgard 184 Silikon-Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI) beschichtet, um die Auslaugung von Metallen in der Badlösung zu verhindern. </li><li> A / D-Wandler, Computer und Software zur Erfassung. Signale von den Vorverstärker auf einer MacLab 8 A / D-System aufgezeichnet. Dies ist eine ältere Version der aktuellen ADInstrument Powerlab Hardware. Wir verwenden das Programm Diagramm (ADInstruments), die kontinuierliche Aufzeichnung der Spannung ermöglicht während des gesamten Experiments. Tension Generation der Luftröhre Muskel ist ziemlich langsam, und deshalb finden wir, dass die Akquisition von 100 Punkten pro Sekunde ist ausreichend. Die Spannung Messung wird unter Verwendung bekannter Gewichte (bis zu 5 Gramm) vor jedem Experiment. Ähnliche Systeme sind von anderen Verkäufern (zB Biopac, GW Instruments). </li></ol>Titel &quot;&gt; 2. Trachea Isolation <ol><li> Vor dem Gewebe isoliert Der Kraftaufnehmer ist mit bekannten Gewichten kalibriert, und das Gewebe Bad ist mit normalen PSS gefüllt (siehe Tabelle I). Der Lufteinlass ist eingestellt, um einen Lichtstrom von O 2 / CO 2 zu erhalten. </li><li> Luftröhre aus 2 Monate oder älter Mäuse sind optimal. Jüngere Tiere können verwendet werden, aber Luftröhren von diesen erhalten mehr Geschick erfordern, um auf den Kraftaufnehmer Drähte wegen ihrer geringen Größe zu montieren. Vor der Präparation werden die Mäuse mit Isofluran tief sediert. Das richtige Maß an Sedierung ist erreicht, wenn eine Zehe-Pinch mit einer Pinzette ist nicht in der Lage, eine Reaktion auszulösen. Mäuse werden sofort durch Genickbruch getötet Ein wichtiger Hinweis:. Wir haben beobachtet, dass Avertin (Tribromethanol), ein Beruhigungsmittel häufig bei Mäusen eingesetzt, starke Beruhigungsmittel Auswirkungen auf die glatte Muskulatur der Atemwege hat und sollte daher nicht für die Luftröhre Kontraktion Studien verwendet werden. </li><li> Die Haut (und Pelz) von Thorax an Hals entfernt. Ribs sind von der Basis des Brustbeins, seitlich (auf beiden Seiten) an die Spitze des Herzens zu schneiden. Das Brustbein und die Rippen sind dann nach vorne auf den Hals, um das Herz / Lunge, Thymus, Luftröhre (ventral) und Speiseröhre (- und dorsal Luftröhre an) zeigen gezogen. </li><li> Die Luftröhre wird durch Schneiden unter dem bronchiale Bifurkation und vor dem Pharynx herausgeschnitten. Die Luftröhre wird in einem eiskalten Sauerstoff (95/5) PSS-Lösung (Zusammensetzung in Tabelle I angegeben) platziert. </li><li> Die Luftröhre wird seziert sauberen des umgebenden Gewebes. Während der Reinigung kann die Luftröhre in den Rachen oder unterhalb der Bifurkation statt. Allerdings sollte mit Vorsicht vorgegangen werden nicht zur direkten Anwendung der Zange an der Luftröhre selbst werden. Einer feinen Schere verwendet werden, um abgeschnitten umgebenden Gewebe werden, aber der Schnitt immer vor parallel zu der Trachea werden, um Schäden zu vermeiden. Dieser Teil des Verfahrens wird erleichtert, wenn die Luftröhre Zubereitung unter der Bifurkation und oberhalb des Pharynx auf eine Sylgard-beschichteten Schale gemerkt (Sylgard 184 SiliconelastomerElastomer-, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Nach dem Entfernen umliegenden Gewebes, wird die Luftröhre unterhalb des Rachens und der Bronchien Bifurkation oben geschnitten und vorsichtig auf den Kraftaufnehmer Drähte montiert. </li><li> Die Trachea wird über zwei L-förmigen Metallstäben (2A) geschraubt. Ein Stift ist mit einem Kraft-Weg-Wandler für die kontinuierliche Aufzeichnung der isometrischen Spannung verbunden. Ein weiterer Stift ist zu einem Mikrometer verbunden. Das Gewebe Bad wird dann angehoben, so dass die Luftröhre in PSS eingetaucht ist. Montage der Luftröhre sollte so schnell wie möglich erfolgen, um die Zeit, die Luftröhre von außen PSS gehalten zu minimieren. Mit etwas Übung können Montage der Luftröhre innerhalb einer Minute durchgeführt werden, aber wir generell mal länger als 3 Minuten, um zu vermeiden Verlust der Lebensfähigkeit zu vermeiden. </li><li> Das Mikrometer eingestellt langsam auf eine passive Spannung von ~ 10 mN (~ 1 g-force) zu erhalten. Die optimale Ruhespannung wurde empirisch bestimmt und wir haben diese passive Spannung von ~ 5 gefunden - 10 mN Ergebnisse in einer äquivalenten, maximale Reaktion auf hohe Kalium-Stimulation. Dies steht im Einklang mit einer Reihe von anderen Studien, die eine passive Spannung in diesem Bereich 16,17,18 nutzen. In den ersten 5-10 Minuten, neigt Trachea passive Spannung leicht zurückgehen (Spannungsrelaxation Phänomen) und das Mikrometer verwendet wird, um die passive Spannung auf ~ 10 mN während der Äquilibrierung einzustellen. Die Luftröhre ist berechtigt, für mindestens 1 Stunde vor der experimentellen Herausforderungen Gleichgewicht zu bringen. </li></ol> 3. Hohe Kalium-Stimulation Nach der Äquilibrierung wird die Trachea zweimal mit einer hohen Kalium-PSS-Lösung (67 mM KCl, Tabelle I) herausgefordert. Die Kontraktion erfordert im Allgemeinen ~ 5-10 Minuten zu erreichen stationären Zustand, in dem Bad wird das Gewebe mehrfach mit normalen PSS gespült, um vollständig zu entspannen die Luftröhre. Das Kalium Kontraktion ein zweites Mal wiederholt, und ein drittes Mal (falls nötig) bis reproduzierbare Kontraktionen erhalten. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Kontraktion durch elektrische Stimulation evozierte Die Luftröhre wird von zwei rechteckigen Platin Platten (Elektroden), die elektrische Feld-Stimulation (EFS) ermöglicht die Herstellung flankiert. Die kontraktile Antwort auf EFS ist eine Funktion der Frequenz und Spannung. Es wird auch durch physikalische Parameter, wie die Fläche der Elektroden und der Abstand zwischen ihnen betroffen sind. Die Leistungscharakteristik des Stimulators auch Auswirkungen auf Antworten, so dass bei höheren Spannungen und Stromausgänge der Stimulator kann ihr Maximum erreicht. Die Eigenschaften eines EFS-System sollte durch die Untersuchung der Muskel kontraktile Antworten bei unterschiedlichen Laufzeiten Reiz, Frequenzen, Spannungen und Pulsdauern bestimmt werden. Für unseren experimentellen Aufbau haben wir gefunden, dass sich die Elektroden von ~ 4 mm abgetrennt und Stimulationsamplitude von 44 V (0,5 ms Impulse) und 30 Hz optimal reproduzierbare annähernd maximalen kontraktilen Antworten zu erreichen. 5. Die Kontraktion Evoked durch cholinerge Stimulation Das Ansprechverhalten der Trachea auf exogen aufgebrachten Verbindungen erfolgt entweder durch Zugabe einer Einzeldosis des Arzneimittels von Interesse bewertet oder durch mehrfache Zugaben des Arzneimittels in einer kumulativen Dosis Mode. Für die Luftröhre, unserem Labor routinemäßig Carbachol verwendet werden, um cholinerge Rezeptoren aktivieren, denn anders als Acetylcholin, Carbachol ist nicht abgebaut durch Acetylcholinesterase. Eine vernünftige Dosis-Wirkungs-Bereich reicht von 10 -8 bis 10 -5 M Carbachol. Montage des Log [Carbachol]-kontraktilen Antwort-Kurve mit einer Hill-Typ-Gleichung erlaubt eine Abschätzung der EC 50 (halbmaximale effektive Konzentration), die ein Maß für die Empfindlichkeit des trachealen Kontraktion der cholinerge Agonist 19 ist. Es ist bemerkenswert, dass eine bestimmte Dosis von Carbachol wird eine etwas stärkere Reaktion als eine einzelne Dosis als im Rahmen einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve geben. 6. Repräsentative Ergebnisse </p&gt; Ein Beispiel für eine Kontraktionsreaktion zu hohen Kalium in 3A gezeigt. Die Kontraktion erreicht ein Maximum innerhalb von ca. 10 Minuten, kann aber einen kleinen Rückgang danach zeigen. Während der frühen Auswaschung der hohe Kalium, kann der Muskel zeigen ein vorübergehender Anstieg der Kontraktion, die durch eine Absenkung der Temperatur als die kleinen Volumen von unbeheizten PSS-Lösung in den Zeilen-Lösung perfundiert vorübergehend die Vorbereitung ist. Dies kann durch eine minimale Totvolumen in der Röhre, die das erwärmte PSS Reservoir und Gewebebad minimiert werden, und auch durch Austausch Lösung relativ schnell (in der Regel pumpen wir Lösungen bei 100 ml / min). Jedes Präparat wird einige Unterschiede in der kontraktile Reaktion auf Unterschiede in der Muskelmasse oder der Beschädigung während der Präparation entstanden sind. 3B zeigt zwei Luftröhren von verschiedenen Muskelmasse mit hohen Kalium-und Carbachol in Frage gestellt. Obwohl die cholinerge evozierten Kontraktionen unterscheiden, diey sind ähnlich wie nach der Normalisierung der Reaktion mit hohem Kalium-Lösung (3C). 4 zeigt ein Beispiel eines Carbachol (cholinergen) hervorgerufene Kontraktion mit Einzeldosen (A) und eine kumulative Erhöhung (B). Die Lösungen werden direkt Carbachol dem Bad zugegeben und die Blasen Gas hilft bei der ein rasches Mischen. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe einer Einzeldosis (dh 1 uM, 4A) hat einen etwas größeren Reaktion als die entsprechende Konzentration während einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve (1 uM, 4B). 4C zeigt ein Diagramm der Kontraktionskraft in Abhängigkeit von Carbachol-Konzentrationen unter Verwendung von Daten aus 4B. Auswirkungen von Carbachol bei 10 -5 M Konzentration zu sättigen. Obwohl cholinergen Agonisten initiiert Kontraktion durch Calcium-Freisetzung Mechanismen, ist ein wesentlicher Bestandteil der Kontraktion auch durch Depolarisation vermittelt undAktivierung der spannungsabhängige Calciumkanäle Kanäle 20. 5A zeigt ein Beispiel für die EFS-evozierten Kontraktionen. Luftröhren stimuliert werden unter Verwendung von 0,5 Millisekunde Dauer, 40-Volt-Impulse bis Kontraktionen ein Plateau (siehe Kasten A1) zu erreichen. Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz bewirkt eine erhöhte kontraktile Reaktion (Frequenz-Antwort-Kurve ist in Abbildung 5B dargestellt). Elektrofeldstimulation wurde gezeigt, dass Kontraktionen überwiegend durch Aktivierung hervorzurufen präsynaptischen Nerven. Dies wird durch die Wirkung von Botulinumtoxin, einem Blocker der Freisetzung von Neurotransmittern, die die Mehrheit der EFS-evozierten Kontraktionen der Luftröhre blockiert 21 belegt. Darüber hinaus Tetrodotoxin, ein Mittel, das Blöcke Na +-Kanäle hemmt auch Nervenaktivität und beseitigt die Reaktion der Luftröhre zu EFS. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der ter den wichtigsten Signalwegen in einer isolierten Luftröhre Vorbereitung. Dargestellt ist ein cholinerger Axonendigung innervieren eines trachealen glatte Muskelzelle ist. Die wichtige Signalwege sind M3 und M2-Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor-Aktivierung (mAChR), die Calcium-Freisetzung durch IP3-Rezeptoren (M3) und die Reduktion des cAMP (M2) zu bewirken. M2-Rezeptoren (und einige Beiträge von M3-Rezeptoren) auch dazu führen, cholinerge evozierten Depolarisation, die L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Kanäle und Calcium-Einstrom aktiviert. Gemeinsame kontraktilen Agenten und ihre Effektoren sind 1. hohe Kalium (depolarisieren glatter Muskelzellen und cholinerge Axone), 2. elektrisches Feld Stimulation (EFS, depolarisiert cholinerge Axone) und 3. exogene Anwendung von Anticholinergika wie Acetylcholin oder Carbachol (aktiviert muskarinischen Rezeptoren direkt). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der verwendeten Geräte zu messen tracheale Kontraktionen. A. Der Kraftaufnehmer, Mikro-und Gewebe-Bad auf Stützstangen über Schraubklemmen befestigt. Die Trachealring über den oberen und unteren Stangen geschraubt. In dem Diagramm wird das Gewebe Bad unter Herstellung positioniert ist (dh bei der Montage der Trachea auf den Kraftaufnehmer). Während der Kontraktion Studien, wird das Gewebe Bad vertikal, um die Herstellung zu baden bewegt. B. Für Elektrofeldstimulation die untere Stange ist modifiziert, um zwei Platinplatten, die seitlich in die Luftröhre Haltedraht angebracht sind. Die Platin-Platten sind durch elektrische Drähte mit einem Stimulator verbunden sind. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiele für hohe Kalium (67 mM) kontraktile Reaktion der Luftröhre. (A) zeigt doppelte, reproduzierbare Reaktionen auf eine hohe Kalium. (B) Beispiele für kontraktile Reaktion auf Carbachol von zwei verschiedenen Luftröhre. (C) Antworten auf die Luftröhre in B sind ähnlich, wenn normalisierend des hohen Kalium-Reaktion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für Carbachol-induzierte Kontraktionen. (A) Carbachol-induzierte Kontraktionen mit Einzeldosen gefolgt von Auswaschung. (B) Beispiel kumulative Dosis-Wirkungs-Kurve für Trachea in A. (C) Peak Kontraktionen von B als eine Funktion der Carbachol-Konzentration aufgetragen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiele von Kontraktionen durch elektrische Feld Stimulation hervorgerufen. (A) Elektrisches Feld Stimulation der Luftröhre Kontraktion mit 0,5 ms Puls, 40 Volt, und verschiedene Frequenzen Stimulation, wie angegeben. Inset ist zeitexpandierten Kontraktion bei 30 Hz. (B) Peak Kontraktionen von A sind plotted als eine Funktion der Stimulationsfrequenz. Normale PSS <table border="1"><tbody><tr><td> Salz </td><td> Conc. (MM) </td><td> Menge (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml 10 mM </td></tr></tbody></table> Hohe K + PSS (NaCl KCl und Anpassungen) <table border="1"><tbody><tr><td> Salz </td><td> Conc. (MM) </td><td> Menge (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabelle 1 Rezept für PSS-Lösungen. Hinweis: Die Lösungen werden wöchentlich frisch hergestellt, mit Reinstwasser Qualität Wasser, und werden im Kühlschrank nicht länger als 5 Tage, um Vermeidung einer Kontamination des Wachstums gespeichert.

<ol><li>Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+mouse+models+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Allergy+Asthma+Rep%22%5BJournal%5D)">Building better mouse models of asthma.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).</li>
<li>Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+in+allergic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Transgenic models in allergic responses.</a> Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).</li>
<li>Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+subtypes+and+smooth+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function.</a> Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).</li>
<li>Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+role+of+M2+and+M3+muscarinic+receptors+in+gastrointestinal%2C+airway+and+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle.</a> Life Sci. 74, 355-366 (2003).</li>
<li>Hall, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+messengers%2C+ion+channels+and+pharmacology+of+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle.</a> Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+analysis+of+the+contractile+role+of+M2+and+M3+muscarinic+receptors+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Receptors+Channels%22%5BJournal%5D)">Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle.</a> Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).</li>
<li>Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+cholinergic+inhibition+of+cyclic+AMP+accumulation+in+airway+smooth+muscle.+Role+of+a+pertussis+toxin-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein.</a> Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).</li>
<li>Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+muscarinic+M2+receptors+in+cultured+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).</li>
<li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements%2C+distribution%2C+and+functions+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).</li>
<li>Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+coupling+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle.</a> J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).</li>
<li>Fryer, A. D., Jacoby, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptors+and+control+of+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).</li>
<li>Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+muscarinic+receptor+activity+of+airway+smooth+muscle+isolated+from+a+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).</li>
<li>Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isometric+method+to+study+respiratory+smooth+muscle+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice.</a> J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).</li>
<li>Vass, G., Horvath, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+and+adenosine+receptors+in+the+pathomechanism+and+treatment+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases.</a> Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).</li>
<li>Borchers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methacholine-induced+airway+hyperresponsiveness+is+dependent+on+Galphaq+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).</li>
<li>Sausbier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+rather+than+enhanced+cholinergic+airway+constriction+in+mice+with+ablation+of+the+large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Faseb. J. 21, 812-822 (2007).</li>
<li>Scheerens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+topical+exposure+to+toluene+diisocyanate+in+mice+leads+to+antibody+production+and+in+vivo+airway+hyperresponsiveness+three+hours+after+intranasal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).</li>
<li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKenakin%2C+TP+%22A+pharmacology+primer+%3A+theory%2C+applications%2C+and+methods%22">A pharmacology primer : theory, applications, and methods</a>. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Channel+%7Bbeta%7D1+Subunits+Regulate+Airway+Contraction+Secondary+to+M2+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Mediated+Depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization.</a> J. Physiol. , 1803-1817 (2011).</li>
<li>Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+epithelium+and+acetylcholine+in+mediating+the+contraction+to+5-hydroxytryptamine+in+the+mouse+isolated+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea.</a> Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).</li>
<li>Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+enhances+cholinergic+innervation+and+contractile+response+to+electric+field+stimulation+in+a+murine+in+vitro+model+of+chronic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma.</a> Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).</li>
<li>Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-cholinergic+nerve+interaction+in+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways.</a> J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).</li>
<li>Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+SERCA3+gene+alters+epithelium-dependent+relaxation+in+mouse+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).</li>
<li>Krane, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5-deficient+mouse+lungs+are+hyperresponsive+to+cholinergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li>
<li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP%2C+and+PGE2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li>
<li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+%28ET%28B%29%29+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li>
<li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%283%29-receptor+knockout+mice%3A+muscarinic+receptor+function+in+atria%2C+stomach+fundus%2C+urinary+bladder%2C+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li>
<li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li>
<li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li>
<li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22classical%22+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine physiologische Vorbereitung der Atemwege Muskelfunktion zu beurteilen. Wir arbeiten in der Regel 3-4 Organbad Präparate gleichzeitig aber sind vorgefertigte Systeme aus einer Reihe von Anbietern, die simultane Messung von bis zu 8 Zubereitungen (ADInstruments, World Precision Instruments, und Harvard Apparatus) erlauben verfügbar. Wir haben eine Reihe von Kraftaufnehmern und Gewebe Organbäder mit gleichwertigen Ergebnissen genutzt. Allerdings finden wir, dass elektrische Feld ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Analog-Digital-Wandler </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbachol (Carbamoylcholin Chloride) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M in Wasser (Aliquote können bei -20 ° C gelagert werden) </td></tr><tr><td> Charting Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Umwälzthermostat </td><td> Haake </td><td> Schwingmühle MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Isometrische Kraftaufnehmer </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Grass Technologies </td><td> S88 Dual-Ausgang SquPulse sind Stimulator </td><td></td></tr><tr><td> Gewebebad </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-messungen des tracheal zusammenziehen mit mäusen

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgene und Knockout-Mäusen wurden leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege 1,2. In-vitro-tensometry von isolierten trachealen Vorbereitungen hat sich als nützlich Assay von glatten Muskelzellen der Atemwege (ASM) kontraktilen Antwort in gentechnisch veränderten Mäusen zu sein. Diese In-vitro tracheale Vorbereitungen sind relativ einfach, bieten eine robuste Antwort, und bewahren Sie sowohl funktionale cholinerge Nervenenden und Muskeln Antworten, auch nach langen Inkubationen. Tracheale tensometry sowie als funktionelle Assays, um eine Vielzahl von Second-Messenger-Signalwege, die Kontraktion der glatten Muskulatur betreffen studieren. Kontraktion in der Luftröhre ist in erster Linie durch parasympathische, cholinerge Nerven, dass Acetylcholin freisetzen auf ASM (1) vermittelt. Die wichtigsten ASM Acetylcholin-Rezeptoren sind muskarinischen M2 und M3, G i / o und Gq gekoppelten Rezeptoren, die jeweils sind <sup&gt; 3,4,5. M3-Rezeptoren hervorrufen Kontraktion durch Kopplung an Gq an Phospholipase C, Anstieg IP3 Produktions-und IP3-vermittelte Calcium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 3,6,7 aktivieren. M2 / G i / o-Signalisierung wird angenommen, dass Kontraktionen durch Hemmung der Adenylatcyclase, was zu einer Abnahme der cAMP-Spiegel 5,8,9,10 erweitern. Diese Wege bilden die so genannten &quot;Pharmako-Kopplung Kontraktion&quot; der glatten Muskulatur der Atemwege 11. Darüber hinaus beinhaltet cholinergen Signalisierung durch M2-Rezeptoren (und moduliert durch M3-Signalisierung) Wege, die die ASM, die wiederum aktivieren L-Typ, spannungsabhängige Kalziumkanäle (Abbildung 1) und Calcium-Einstrom (so genannte &quot;Erregung und Kontraktion&quot; depolarisieren ) 4,7. Detailliertere Bewertungen auf Signalwege steuern Verengung der Atemwege können 4,12 gefunden werden. Die obigen Wege scheinen zwischen Maus und anderen Spezies konserviert werden. Allerdings unterscheiden sich Maus Luftröhre aus anderen Spezies in einige Signalwege. Am bekanntesten ist ihr Mangel an kontraktilen Antwort auf Histamin und Adenosin 13,14, beide bekannte ASM-Modulatoren in Menschen und anderen Spezies 5,15. Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung von murinen Trachealringe und die in vitro-Messung ihrer kontraktilen ausgegeben. Enthalten sind Beschreibungen der Geräte-Konfiguration, Luftröhre Ring Isolation und kontraktilen Messungen. Es werden Beispiele für evozieren Kontraktionen indirekt mit hohem Kalium-Stimulation von Nerven und direkt durch Depolarisation von ASM Muskel zu spannungsabhängigen Calcium-Einstrom aktivieren gegeben (1. Hohe K +, Abbildung 1). Darüber hinaus werden Methoden zur Stimulation von Nerven allein mit elektrischen Feldes Stimulation (2. EFS, Abbildung 1), oder für eine direkte Stimulation der Muskulatur ASM mit exogenen Neurotransmitter, die auf die Badewanne (3. Exogene ACH, Abbildung 1) vorgestellt. Dieses flexibilität und Leichtigkeit der Herstellung macht das isolierte Trachea Ring-Modell eine robuste und funktionelle Assays für eine Vielzahl von Signalwegen in den Atemwegen Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt.

Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur<em&gt; In-vitro-</em&gt; Luftröhre Verengung Studien zur Bewertung der Funktion der glatten Muskulatur in murinen Atemwegen.

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Transgene und Knockout-Mäuse haben sich als leistungsfähige Instrumente zur Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege erwiesen1,2. Die In-vitro-Tensometrie von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kontraktilität der glatten Muskulatur der Trachea von Mäusen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gewebebäder vorbereitet und der isometrische Kraftaufnehmer kalibriert werden. Anschließend wird die Maus-Trachea isoliert und an den Stäben des Kraftaufnehmers befestigt.Dann wird die Trachea stimuliert und die resultierende Spannung gemessen und analysiert. Letztendlich können die Ergebnisse die Kontraktilität des Trachealmuskels durch isometrische Kraftmessungen aufzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie in-vivo-Messungen des Atemwegswiderstands, liegt darin, dass in-vitro-Spannungsmessungen einen direkteren Test der glatten Muskelkontraktilität ermöglichen.Der Nachteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine Organbad-Präparation handelt, weshalb zirkulierende Faktoren, die die glatte Muskelkontraktilität in vivo beeinflussen könnten, in der in-vitro-Präparation fehlen können. Obwohl diese Methode Einblicke in die glatte Muskulatur der Mausluftröhre ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Gewebe der glatten Muskulatur anwendbar, beispielsweise große Gefäße oder die glatte Muskulatur von Darm und Blase, sofern ringförmige Muskelpräparationen groß genug sind, um sie an den Druckmessdrahträgern zu befestigen.Zwei Bestandteile der Kontraktionsmessvorrichtung erfordern hier eine Beschreibung: das Gewebeküvette und der Kraftaufnehmer. Die Gewebeküvette hält eine mit Sauerstoff angereicherte physiologische Lösung bei warmer Temperatur für Mäuse-Trachearinge bereit. Es wird eine 10-Milliliter-Gewebeküvette verwendet, die mit einer Wasserjacke zur Wärmeregulierung, einem Glasinlet zum Durchblubbern von Sauerstoff sowie Ein- und Auslassöffnungen zum Austausch der gelagerten Lösungen ausgestattet ist.Es gibt ein Reservoir mit PSS-Lösung, das mit Sauerstoff durchblubbert und durch ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für Lösungsaustausche gehalten wird. Die PSS-Lösung wird aus dem Reservoir mit etwa 100 Milliliter pro Minute in den Gewebebadzulauf gepumpt. Gleichzeitig bewegt eine beheizte Umlaufpumpe Wasser mit 37 Grad Celsius durch die Mantelung des Gewebebades.Das zweite Gerät von Interesse ist der Kraftaufnehmer. Dieser dient zur Messung der isometrischen Spannung in der Luftröhre. Das Luftröhrenstück wird über die L-förmigen Enden zweier Stäbe gestreift, die aus biokompatiblem Material wie beispielsweise Edelstahl hergestellt sind.Der obere Stab ist über eine Klammer mit einem isometrischen Kraftaufnehmer verbunden. Der untere Stab hält die Trachea in einer festen Position und ist auf einem Mikrometer montiert, um die passive Spannung und/oder die Muskelänge einzustellen. Die Kontraktion der Trachea erzeugt eine Spannung am Kraftaufnehmer, die am Vorverstärker in ein Spannungssignal für die elektrische Stimulation umgewandelt wird.Der untere Stab ist mit zwei rechteckigen Platinplatten ausgestattet, die vier Millimeter voneinander entfernt angeordnet sind, um die Luftröhre zu flankieren. Die Platinplatten sind mit einem herkömmlichen Stimulator wie einem Grass S 88 verbunden.Bei dieser Vorbereitung müssen die offenen Drähte verlötet und mit einer Isolierschicht überzogen werden, um ein Auslaugen von Metallen in die Badlösung zu verhindern. Zusätzliche Geräte umfassen einen Analog-Digital-Wandler-Computer und Aufnahmesoftware. Signale von den Vorverstärkern werden an einem Mac Lab acht AD-System aufgezeichnet.Bevor mit der Gewebegewinnung begonnen wird, muss das Gewebekammerbad mit normaler PSS gefüllt und der Luftsauerstoffzulauf so eingestellt werden, dass ein leichter Sauerstoffstrom entsteht. Außerdem müssen die Kraftaufnehmer durch Anbringen bekannter Gewichte an den Drähten des Kraftaufnehmers kalibriert und die Erfassungssoftware entsprechend kalibriert werden.Töten Sie Mäuse, die mindestens zwei Monate alt sind, da die kleineren Luftröhren jüngerer Mäuse schwieriger zu dissezieren und zu präparieren sind. Wir haben beobachtet, dass ein häufig bei Mäusen verwendeter Sedativum eine starke entspannende Wirkung auf glatte Muskulatur der oberen Atemwege hat und daher nicht für Kontraktionsstudien an der Luftröhre verwendet werden sollte. Nach der Isolierung der Luftröhre legen Sie das isolierte Organ in eine mit kalter, mit Sauerstoff angereicherter PSS-Lösung gefüllte Petrischale.Nadeln Sie die Luftröhre unter dem Verzweigungspunkt und oberhalb des Pharynx in die Schale ein, während Sie unter einem Dissektionsmikroskop arbeiten. Entfernen Sie das umgebende Gewebe mit einer Pinzette. Halten Sie die Luftröhre am Pharynx oder unterhalb der Verzweigung fest, aber setzen Sie die Pinzette niemals direkt an der Luftröhre selbst an.Ebenso sollte beim Entfernen von Gewebe nur parallel zur Luftröhre geschnitten werden, nachdem das umgebende Gewebe entfernt wurde. Die Luftröhre senkrecht unterhalb des Pharynx und oberhalb der bronchialen Gabelung durchtrennen. Nun kann die Luftröhre an dem Gerät befestigt werden.Die Montage der Trachea sollte so schnell wie möglich erfolgen, um die Zeit, in der die Trachea außerhalb der PSS gehalten wird, zu minimieren. Fädeln Sie die Trachea vorsichtig, aber zügig über die beiden L-förmigen Metallzinken. Heben Sie dann schnell das Gewebebad an, um die Trachea in warme PSS einzutauchen. Sobald die Trachea wieder in PSS ist, stellen Sie langsam den Mikrometertrieb ein, um eine passive Spannung von etwa fünf bis 10 Millinewton oder einhalb bis ein Gramm Kraft zu erreichen.Dies ist die optimale Ruhespannung über die nächsten fünf bis zehn Minuten. Die Spannung wird abnehmen, daher weiterhin Anpassungen vornehmen, um die gewünschte Spannung aufrechtzuerhalten, bis sie sich stabilisiert hat. Sobald sie stabil ist, mindestens eine Stunde warten, damit die Trachea sich einkoppeln kann, bevor experimentell Kontraktionen ausgelöst werden.Nach der Equilibrierung können Kontraktionen durch Kalium, elektrische Feldstimulation oder Substanzen von Interesse ausgelöst werden. Zur Kaliumstimulation reizen Sie die Trachea mit einer PSS-Lösung mit hohem Kaliumgehalt. Im Allgemeinen erreichen die Kontraktionen nach fünf bis zehn Minuten einen stabilen Zustand; zu diesem Zeitpunkt spülen Sie das Bad mehrmals mit normaler PSS, um die Trachea vollständig zu relaxieren.Danach weiterhin zwischen dem PSS-Hochkaliumlösung gewechselt, bis reproduzierbare Kontraktionen erzielt werden; üblicherweise sind nicht mehr als drei Bäder erforderlich. Die elektrische Feldstimulation wird über Platinplatten durchgeführt, die die Trachea flankieren.Die kontraktile Reaktion wird von der Fläche der Elektroden und dem Abstand zwischen ihnen beeinflusst. Aufgrund der Leistungsmerkmale des Stimulators erreichen die Stromausgänge bei höheren Spannungen ein Maximum. Eine nahezu maximale Reaktion kann mit 0,5 Millisekunden langen Impulsen oder 44 Volt, die in Abständen von 30 Hertz appliziert werden, erzielt werden.Dies variiert jedoch zwischen den Systemen und sollte empirisch bestimmt werden. Das System erlaubt zudem die Messung der Reaktion der Trachea auf ein exogen über diese zugeführtes Medikament. Die Badlösung, Einzeldosen eines Medikaments oder mehrfache Zugaben eines Medikaments in kumulativer Dosis können bewertet werden.Beispielsweise kann Carbachol zur Aktivierung cholinergener Rezeptoren verwendet werden. Im Gegensatz zu Acetylcholin wird es nicht durch Acetylcholinesterase abgebaut und erzeugt eine stabilere Wirkung. Die Anpassung der Ergebnisse an eine logarithmische Dosis-Wirkungs-Kurve mithilfe einer Hill-Gleichung ermöglicht die Abschätzung der halbmaximalen wirksamen Konzentration oder C 50.Eine Tracheazubereitung wurde mit einem Bad mit hohem Kaliumgehalt stimuliert. Die Kontraktion erreichte innerhalb von etwa 10 Minuten ein Maximum. Während der frühen Auswaschung des hohen Kaliums zeigte der Muskel eine vorübergehende Zunahme der Kontraktion aufgrund eines Temperaturabfalls.Da das kleine Volumen der nicht erhitzten PSS-Lösung. In den Lösungsleitungen wurde vorübergehend das Präparat perfundiert. Anschließend wurden zwei Tracheen mit unterschiedlicher Muskelmasse mit hohem Kalium und Carbachol herausgefordert.Obwohl ihre cholinerg ausgelösten Kontraktionen unterschiedlich waren, ähnelten sie sich nach Normalisierung an die Reaktion mit hochkaliumhaltiger Lösung. Anschließend wurde Carbachol verwendet, um Kontraktionen entweder mit Einzeldosen oder kumulativ steigenden Dosen auszulösen. OL-Lösungen wurden direkt in das Bad gegeben.Es ist darauf hinzuweisen, dass die Zugabe einer Einzeldosis eine leicht stärkere Wirkung zeigte als die entsprechende Konzentration während einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve. Die Auftragung der kontraktilen Kraft in Abhängigkeit von Carbachol-Konzentrationen zeigte, dass die Wirkung von Carbachol bei 10⁻⁵ Molar gesättigt ist. Die Tracheen wurden EFS unterzogen, wobei 0,5 Millisekunden lange, 40 Volt starke Impulse verwendet wurden, bis die Kontraktionen ein Plateau erreichten. Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz führte zu einer verstärkten kontraktilen Antwort.Das könnte darauf zurückzuführen sein, dass elektrische Feldstimulation (EFS) Kontraktionen hauptsächlich durch Aktivierung präsynaptischer Nerven hervorruft. Beispielsweise blockiert Botulinumtoxin den Großteil der durch EFS hervorgerufenen Kontraktionen der Trachea. Außerdem hemmt Tetrodotoxin die Nervenaktivität und beseitigt die Reaktion der Trachea auf EFS.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa einerinhalb Stunden durchgeführt werden. Die Tracheen sind jedoch in Organbädern über viele Stunden hinweg in Langzeitexperimenten lebensfähig. Unnötig.

in-vitro-measurements-of-tracheal-constriction-using-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wiederholte Messungen von Nagetier Atemfunktion und Probenahme von Atemwegs Entzündungszellen sind wünschenswert, aber in der Regel nicht möglich. Hier beschreiben wir eine wiederholbare Methode für oral Intubation Mäuse, wiederholte Messungen der Atemwege Hyperreaktivität und die Entnahme von Atemwegs-inflammatorischen Zellen ermöglicht.

Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Quer Aorta Verengung (TAC) in der Maus ist eine häufig verwendete experimentelle Modell zugrunde liegenden Mechanismen der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz Entwicklung zu studieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur Einengung der Aorta zu einem reproduzierbaren Grad der Herzhypertrophie in Mäusen zu erzeugen.

Quer Aorten-Verengung in Mäuse

Wir haben eine einfache, zuverlässige und relativ kostengünstiges Verfahren zur Intubation bei Mäusen durch direkte Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum entwickelt. Diese Technik ist atraumatisch und für wiederholte Messungen bei chronischen Experimente eingesetzt werden. Wir finden es besser als zuvor berichtet, Tracheostoma oder chirurgischen Techniken.

Intubation bei Mäusen<em&gt; Über</em&gt; Direkte Laryngoskopie Mit einem Otoskop

Dieses Papier beschreibt eine striaghforward und effiziente Methode zur Intubation Mäusen Lungenfunktion Messungen oder pulmonale Instillation, dass die Mäuse sich zu erholen und zu späteren Zeitpunkten untersucht werden können. Das Verfahren beinhaltet eine kostengünstige LWL-Lichtquelle, die direkt beleuchtet die Luftröhre.

Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen...

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

Das Ziel dieses Protokolls ist es, automatisierte Methoden zur Quantifizierung chronischer Lungenpathologien in einem Mausmodell der COPD bereitzustellen. Das Protokoll umfasst die Exposition von Mäusen gegenüber Zigarettenrauch (CS), die Messung der Lungenfunktion, das Aufblasen der Lunge und die Verwendung morphometrischer Methoden zur Messung von Emphysem und Umbau kleiner Atemwege bei Mäusen.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Dieser Artikel stellt eine schnelle und einfache Methode zur Bleomycin direkt in die Luftröhre Maus über Intubation verabreicht wird. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass sie in hohem Maße reproduzierbar, leicht zu beherrschen ist, und nicht spezialisierte Ausrüstung oder langwierige Wiederherstellungszeiten erfordern.

Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll der transversalen Aortenstenose Verengung (TAC) über eine laterale Thorakotomie. Diese Technik ist ein minimal-invasive, geschlossenen Brust chirurgischer Eingriff mit dem Ziel, drucküberlastung und Herzinsuffizienz bei Mäusen unter Verwendung der Standardeinstellungen TAC-Labor zu simulieren.

Eine geschlossen Kasten Modell quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen zu induzieren

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.

Wiederholte orotracheale Intubation bei Mäusen

Verschiedene Tiermodelle der angeborenen zwerchmatischen Hernie und fetalen Trachealverschluss stellen Vor- und Nachteile in Bezug auf ethische Fragen, Kosten, chirurgische Schwierigkeiten, Größe, Überlebensraten und Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge dar. Dieses Modell bietet ein neues Werkzeug, um die Auswirkungen von Trachealokklusion und erhöhtem Luminaldruck auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen

In dieser Arbeit schlagen wir ein Protokoll für die intratracheale Lipopolysaccharid-Abgabe (LPS) mittels nicht-invasiver oropharyngealer endotrachealer Intubation vor. Diese Methode minimiert das Trauma des chirurgischen Eingriffs für das Tier und gibt LPS genau in die Luftröhre und dann in die Lunge ab.

Nichtinvasive intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation bei Mäusen

Lernen Sie die Messung der Kontraktilität von trachealem glattem Muskel bei Mäusen mittels in-vitro-Tensometrie isolierter Trachealringe. Diese Methode ermöglicht direkte Untersuchungen physiologischer und pharmakologischer Mechanismen der Atemwegsverengung.

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Weitere Videos entdecken