Name: Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Lernen Sie die Neuroblast-Assay-Methode zur Erzeugung und Anreicherung neuronaler Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Sortierung spezifischer Zellpopulationen.

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1. Basic Set Up Bevor mit Cell Culture <ol><li> NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Zuschläge sind in einem Verhältnis 9:1 gemischt, jeweils um komplette NSC Medium zu machen. </li><li> A 37 ° C warmes Wasserbad verwendet wird zum Aufwärmen des Mediums. </li><li> Geeignete Menge von Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) aufgetaut. </li><li> Geeignete Menge über diesen Wachstumsfaktor Lösungen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktor (EGF bei 10 ug / ml), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF bei 10 ug / ml) und 0,2% Heparin-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgetaut. </li><li> Zellkulturflaschen (T25, T75 oder T175 &amp;) werden für NSC Expansion und Differenzierung notwendig. </li><li> Gewebekultur behandelt 96 und 24 Well-Platten und Deckgläser werden für die Beschichtung von sortierten Zellen benötigt werden. </li></ol> 2. Isolation und Expansion (Die Passage) von NSCs <ol><li> Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen werden isoliert und von der Maus b erweitertRegen wie in separaten Protokollen Nr. 1, 2 3 beschrieben. </li><li> Wenn die Neurosphären (primär oder passagierten Neurosphären) bereit für Subkultur (150-200 &amp;mgr; m im Durchmesser) sind, ist das Medium, Sphären auf eine geeignete Größe sterile Gewebekultur-Röhrchen überführt und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand Medium wird entfernt und die Kugeln in 1 ml der vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert. </li><li> Nach der Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 2-3 min, wird ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu der Zellsuspension zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde vollständig inaktiviert wird die Zellsuspension auf und ab pipettiert 3-5 mal. </li><li> Nach Zentrifugation bei 800 Upm (110 g) für 5 min wird der Überstand entfernt und die Zellen werden in 1 ml vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> 10 &amp;mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul trypa gemischtn blue zur Durchführung einer Zellzahl. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Die Zellen werden dann für die Subkultur 1, 2 oder zur Differenzierung wie unten beschrieben verwendet. </li></ol> 3. Differenzierung neuraler Stamm-und Progenitorzellen, die Neuroblast Assay (NBA) <ol><li> Zellen, die aus dissoziierten Neurospheres werden in einer Konzentration von 2-3 × 10 5 Zellen / ml in der gesamten NSC-Medium mit 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 l / ml von 0,2% und 5% Heparin ausplattiert Hitze inaktiviertes FCS in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche. 5 ml Medium für T25, T75 für 20 ml und 40 ml für T175-Flaschen verwendet. Hinweis: FCS daß die Zellen fest mit dem Substrat zu befestigen und es gibt keine Notwendigkeit für die Beschichtung der Kolben für NBA Kultur. </li><li> KultAbbildung Kolben werden dann in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird als Proliferation Phase werden NSC Nachkommen an dem Substrat und proliferieren als eine Monoschicht von Zellen. </li><li> Wenn die Kultur Konfluenz 90-95%, die mittlere jeder Flasche wird auf der gesamten NSC-Medium mit 5% FCS ohne Wachstumsfaktoren ergänzt eingeschaltet. </li><li> Kulturflaschen werden erneut in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für weitere 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird der Grad der Differenzierung genannt, während der neuronalen Vorläuferzellen erscheinen oben auf einem astrozytären Monoschicht und sich vermehren, um Kolonien von unreifen Nervenzellen machen. Am Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, ist die Kultur bereit für die Isolierung der Neuroblast Zellen mittels Durchflusszytometrie-Technologie. </li></ol> 4. Zellpräparation für die Durchflusszytometrie Trypsinisierung <ol><li> Die Kultur der Differenzierung NSC Nachkommen am Tag 4-5 der Zelldifferenzierung wird einmal mit einer geeigneten Menge an PBS (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) mit FCS aus der Kultur entfernt gewaschen. Hinweis: FCS Blöcke Trypsin-EDTA-Aktivität. </li><li> Dann wird eine ausreichende Menge an vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) in jeden Kolben zugegeben, um die Zellmonoschicht bedecken und inkubiert für 1-2 min in 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Der Kolben wird unter dem Mikroskop, um die Wirkung von Trypsin-EDTA auf die Kultur zu bewerten überprüft. Der Kolben wird dann mit einer Hand gehalten und schlug fest mit der anderen Hand, um die Zellen vom Boden der Flasche zu entfernen. </li><li> Gleiche Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird in den Kolben zu Trypsin-Aktivität zu löschen zugegeben. Die Zellsuspension wird sanft nach oben und nach unten zu Trypsin pipettiert Inaktivierung zu gewährleisten und um eine homogene einzelne Zelle erreichenSuspension. Hinweis: Alternativ-Medium mit 5% FCS verwendet werden, um Trypsinaktivität stillen werden. </li><li> Um nicht getrennten Klumpen zu entfernen, wird die Zellsuspension durch ein 40-Mesh-Größe um-Filter geleitet. </li><li> Die Zellsuspension wird dann bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden in einem geeigneten Volumen an vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> Das Endvolumen der Zellsuspension wird so eingestellt, dass die Zelldichte nicht mehr als 2-3x10 6 -cells/ml. Hoher Zelldichte könnte Strom Blockade in der Durchflusszytometrie Maschine verursachen. </li><li> Wenn Sie möchten, neuronalen Zellen nur auf ihre physikalischen Eigenschaften zu isolieren, jetzt können Sie auf FACS-Sortierung wie in Teil 4 beschrieben fortfahren. </li><li> Vor dem Sortieren wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen aufgenommen. </li></ol> Live-cell Immunomarkierung Um eine höhere Reinheit des neuronalen Zellen, geerntet einzelnen Zelle aus der NBA Kultur kann für PSA-NCAM (ein Marker der frühen unreifen neuronalen Vorläuferzellen) und dann die positiven Zellen aus der neuronalen Population angefärbt werden erreichen können isoliert mit der FACS-Maschine werden. <ol><li> Nach Durchführung einer Zellzählung, wird die einzige Zellsuspension aus der NBA-Kultur in vier Gruppen unterteilt: <ul><li> Zellen allein Gruppe dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 1 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Zellen plus PI, dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 10 x 10 6 Zellen) einzustellen. PI-negativen Zellen aus dieser Gruppe können auch bezogen auf die Zellen physikalischen Eigenschaften sortiert werden. </li><li> Sekundäre allein (Isotyp-Kontrolle), die Gruppe dient auch als Kontrolle, um Parameter und Tore (1-2 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Immunmarkierung Gruppe (8-10 x 10 6 Zellen), die für PSA-NCAM gefärbt ist, um zu erreichenweitere Reinigung der unreifen neuronalen Zellen. Um tote Zellen auf Sortierung auszuschließen, wird PI zu dieser Gruppe hinzugefügt als auch. </li></ul></li><li> Um Immunmarkierung zu starten, werden die Zellen bei 800 Upm (110 g) für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden in 100 ul vollständige NSC resuspendiert. </li><li> Phycoerythrin (PE) konjugiertem Anti-PSA-NCAM Antikörper in einem Verhältnis von 10 ul / 5-10 × 10 6 Zellen der Zellsuspension für PSA-NCAM gefärbt werden zugegeben. In gleicher Weise wird eine PE-konjugiertem Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper der Isotyp-Kontrolle Zellsuspension zugegeben. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Antikörper Datenblatt über die Konzentration der Antikörper verwendet werden. Die Zellsuspension wird dann vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert für 10-15 min im Dunkeln. </li><li> Die Zellsuspensionen (PSA-NCAM und Isotyp Kontrollröhrchen) werden dann bei 800 Upm (110 g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden wieder &amp; Fahrwerknded in 1 ml vollständigem Medium NSC. </li><li> Um überschüssige un-beschränkt Antikörper, die aus den Proben zu entfernen, wird der Schritt April 2-3 mal wiederholt. </li><li> Nach der erneuten Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen an Medium, Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) bei einer Konzentration von 1 l / ml der Zellsuspension (Zellen plus PI, Isotyp-Kontrolle und das hinzugefügt PSA- NCAM-gefärbten Proben), um auszuschließen, wenn tote Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li><li> 15 ml-Falcon-Röhrchen sterilen mit 1 ml vollständigem Medium bereit sind, sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu sammeln. </li></ol> 5. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) von unreifen Neuronen <ol><li> Die FACS-Maschine wird auf der Grundlage seiner Anleitung Handbuch über die Durchflusszytometrie Anlage-Experte Techniker eingestellt. </li><li> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder andere geeignete Lösungen depending auf die Anweisungen des Herstellers, könnte als Hüllfluid bei 28 PSI durch eine 90 um Düse verwendet werden. </li><li> Differenzdruck auf dem System ist so eingestellt, dass die Art Trigger nicht übersteigt 2500 Ereignisse / Sekunde. </li><li> Die Zellsuspension aus den Zellen allein Gruppe wird durch die FACS-Maschine laufen. </li><li> Zunächst werden die Zellen (Ereignisse) auf der Basis ihrer Größe (Forward Scatter (FSC) Licht) versus interne Komplexität (Side Scatter (SSC)-Licht) zu unterschiedlichen Zellpopulationen unterscheiden aufgetragen. Um dies zu tun, sollte die Spannung Parameter für FSC und SSC so eingestellt, dass die Zellen in der Durchflusszytometrie Diagramm kann gesehen werden. </li><li> Um Zellklumpen und Dubletten auszuschließen, werden die Zellen zunächst aufgetragen basierend auf Vorwärtsstreuung Bereich (FSC-A) gegenüber Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und die Single-Zell-Population ist als gated Bevölkerung 1 (P1). Dann werden die P1-Zellen basieren auf Seite Streubereich (SSC-A) versus Seitwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und dieser Zeit werden die einzelnen Zellen sind gat aufgetragened Bevölkerung als 2 (P2). Nachdem festgestellt wurde, diese zwei aufeinanderfolgenden Toren, Klumpen oder Dubletts (FSC hohe Pulsbreite und hohe SSC Impulsbreite) werden ausgeschlossen. </li><li> Um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, werden die einzelnen Zellen (P2), basierend auf PI Reaktivität gegenüber FSC-A und dem einzigen Live-Zell-Population ist gated aufgetragen. </li><li> Einzel lebenden Zellen basieren auf FSC gegen SSC aufgetragen zu unterschiedlichen Zellpopulationen auf Zellgröße und Granularität der Basis interner unterscheiden. In diesem Stadium zwei Zellpopulationen torgesteuert FSC niedrigen SSC niedrig (P3) und FSC hohen SSC hoch (P4) Zellpopulationen. </li><li> So sortieren PSA-NCAM immunreaktiven unreifer neuronaler Zellen aus dem FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte, die erste FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte von Kontrolle (Zellen plus PI und Isotyp-Kontroll-) Gruppen wird auf Basis PE-Immunreaktivität gegen FSC-A aufgetragen und die negative Zellen sind gated (P5), und dann positiven Zellen von PSA-NCAMgebeizt Gruppe sind als gated Bevölkerung 6 (P6). </li><li> Nach der Einstellung alle benötigten Tore, werden die Zellen von Interessen in 15 ml sterile Zellkultur-Röhrchen mit 1 ml Medium NSC sortiert. </li><li> Die sortierten Zellen werden dann bei 1200 rpm (240 g) für 5 Minuten zentrifugiert. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in einem geeigneten Volumen des Mediums (in Abhängigkeit von der Pelletgröße) und einer Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird. </li><li> Die Zellen werden dann in Poly-L-Ornithin beschichteten 96-Well-Platten bei einer Dichte von 20-30 x 10 3 Zellen / Vertiefung in 200-250 ul vollständige NSC-Medium ausplattiert mit 5% FCS und 20 ng / ml menschlichen rekombinanten BMP4 5 . </li></ol> Hinweis: die Beschichtung 96 Vertiefungen, 100 ul von Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung (1,5 ml Poly-O und 8,5 ml steriler PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird bei 37 ° C-Inkubator für mindestens eine inkubiert Stunde. Dann wird das Poly-O entfernt und jede Vertiefung dreimal mit sterilem PBS gewaschen(Lassen Sie die PBS in der gut bleiben für jeweils 10 Minuten Zeit). Verwenden Sie 500 ul von Poly-L-Ornithin Arbeitslösung / gut, wenn 24-Well-Platten verwendet werden. <ol start="14"><li> Die Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Art mit kaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und immungefärbt geeignete neuronale und gliale Zellmarker, um den Phänotyp der sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu bewerten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Im Neuroblast Assay (NBA) Differenzierung Kultur, plattierten Zellen der Gewebekultur Substrat zu befestigen und zu wachsen als einer Monoschicht. Je nach anfänglichen Zelle Beschichtungs-Dichte, wird die Kultur in eine 90-95% konfluenten Kultur nach 3-4 Tagen zu machen. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Monoschicht von hauptsächlich Astrozyten visualisiert unten mit kleinen runden neuronalen Vorläuferzellen auf 4,5 (Abbildung 1). Nach dem Einschalten des Mediums an einen Wachstumsfaktor Medium, startet neuronalen VorläuferzellenTeilung rasch und erzeugen Cluster von unreifen Zellen Neuroblast auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht in 4-5 Tagen (Abbildung 2). Durchflusszytometrie dissoziierter NBA Kultur an Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, zeigt im Wesentlichen zwei Zellpopulationen; FSC niedrigen SSC niedrigen und hohen FSC-SSC hoch auf Zellgröße (FSC) und interne Granularität (SSC) (Abbildung 3). Immuno-Fluoreszenz-Analyse der sortierten Zellen zeigt, dass die neuronalen Zellen vor allem in der FSC-SSC niedrigen niedrigen Populationen (mit mehr als 75% von ihnen zum Ausdruck β-Tubulin-III) befindet, während sortierten Zellen aus dem FSC-SSC hoch hoch Bevölkerung sind meist GFAP immunreaktiv Astrozyten (Abbildung 4). Die weitere Reinigung von unreifen neuronalen Zellen bis zur Homogenität (97%) könnte eine positive Selektion von PSA-NCAM IR-Zellen aus dem FSC niedrigen SSC dünn besiedelte (Abbildung erreicht werden3, 4). Angereichert neuronalen Zellen aus den NSCs von E14 Maus ganglionären Eminenzen isoliert generiert erwerben einen GABAergen Phänotyp und Express DARPP-32, einem Marker der mittleren stachelige Neuronen, auf Differenzierung (Abbildung 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Proliferation der Bühne. Diese Monoschichtkultur besteht aus flachen Zellen Astrozyten (Pfeilspitzen) und darunter rund neuronalen Vorläuferzellen (Pfeile) an der Spitze. Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="2"/> . Abbildung 2 Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Differenzierung der Bühne: A) Phasenkontrast, B) Immunfluoreszenzfärbung. Beachten Sie die Ansammlung von unreifen neuronalen Zellen (Pfeile in A </strong&gt; und β Tubulin-III-Färbung in B) auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht (Pfeilspitzen in A-, GFAP-Färbung in B). Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> . Abbildung 3 Vertreter Sortieren Plots: A). FSC vs SSC Art Plot vor Ausschluss von Dubletten und tote Zellen. B, C). Sortieren Grundstücke für den Ausschluss von Dubletten auf FSC-und SSC-Pulsbreite. D basiert). Ausschluss von toten und geschädigten Zellen auf Propidiumiodid Immunreaktivität basiert. E). FSC vs SSC Plot nach Ausschluss von Dubletten und tote Zellen, welche die beiden wichtigsten Bevölkerungsgruppen wie dem FSC-SSC niedrigen niedrigen und den hohen SSC FSC hohe Populationen bezeichnet. F, G). Sortieren Plots zu PSA-NCAM IR unreife Zellen aus dem FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung zu isolieren. Abbildung 4. Vertreter Aufnahmen von Zellen aus verschiedenen Populationen einen Tag nach Plattieren sortiert. A) FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung (mehr als 75% dieser Zellen sind Neuronen). B) FSC hohe SSC hohen Bevölkerung (die meisten dieser Zellen sind Astrozyten ). C) PSA-NCAM + sortierten Zellen aus FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte (fast alle der sortierten Zellen sind Neuronen). Ursprüngliche Vergrößerung, 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Sortiert unreifen Neuronen differenzieren zu GABAergen Neuronen (A) und Express DARPP-32 (B), einem Marker für mittlere stachelige Neuronen.

<ol><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li>
<li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Möglichkeit, definierte neuronale Zellpopulationen zu isolieren (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) lösen könnten einige der Hindernisse bei der klinischen Anwendung der neuralen Stammzellen (NSCs) verbunden sind. Erstens ermöglicht es uns für die vollständige Charakterisierung der Ausgangspopulation von Spenderzellen. Zweitens erlaubt es uns, einen bestimmten Zelltyp oder eine Kombination von verschiedenen Zelltypen mit einem bestimmten Verhältnis zu verwenden, je nach Art oder das Stadium der Erkrankung...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements </td><td> Medium Ergänzung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * Destilliertes Wasser </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Flasche </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80-Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Antikörper </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-konjugierten Maus-IgG1 </td><td> Isotypkontrollantikörper </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-OrnitHine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> Medium Supplement </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Antikörper </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III-Tubulin </td><td> Antikörper </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Um sicherzustellen, HEM, Mix 1 x 10 L-Paket von MEM und 160 ml 1 M HEPES und bringe das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Stellen Sie den End-pH auf 7,4 und bewahren Sie ihn bei 4 ° C

die neuroblast assay: ein test für die erzeugung und anreicherung von neuronalen vorläuferzellen aus neuralen stammzellen differenzieren progeny mittels durchflusszytometrie

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neurale Stammzellen (NSC) isoliert und in erweitert werden große, mit der Neurosphere Assay und differenzierten zu den drei Zelltypen des zentralen Nervensystems (CNS), nämlich, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen. Diese Eigenschaften machen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von Zellen für in vitro-Studien wie Wirkstoff-Screening, Neurotoxikologie und Elektrophysiologie und auch für die Zell-Ersatz-Therapie bei vielen neurologischen Erkrankungen. In der Praxis jedoch, die Heterogenität der NSC Nachkommen, geringe Produktion von Neuronen und Oligodendrozyten und Astrozyten Vorherrschen nach der Differenzierung beschränken ihre klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode für die Erzeugung und anschließende Reinigung der unreifen Neuronen aus murinen NSC Nachkommen mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS)-Technologie. Mit dieser Methode kann ein hoch angereichertes neuronalen Vorläuferzellen Zellpopulation Witz erreicht werdenHout keine spürbaren Astrozyten und bona fide NSC Kontamination. Das Verfahren umfasst Differenzierung von NSC Nachkommenschaft isoliert und expandiert von E14 Maus ganglionären Eminenzen mit dem Neurosphäre Assay, durch Isolierung und Anreicherung von unreifen neuronalen Zellen auf der Basis ihrer physikalischen (Größe und interne Komplexität) und fluoreszierenden Eigenschaften mittels Durchflusszytometrie Technologie gefolgt. Insgesamt dauert es 5-7 Tage, um Neurosphären und 6-8 Tage zu erzeugen, um NSC Nachkommen zu unterscheiden und zu isolieren hochgereinigten unreifen neuronalen Zellen.

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neurale Stammzellen (NSCs) können mittels des Neurosphären-Assays isoliert und in großem Maßstab expandiert sowie in die drei Hauptzelltypen von ... differenziert werden.

Das Ziel dieses Video-Protokolls ist es, die Generierung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus differenzierenden Nachkommen von Neurostammzellen mittels Durchflusszytometrie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Neurostammzellen mittels Neurosphären-Assay isoliert und expandiert werden. Die resultierenden Zellen werden anschließend über eine zweistufige Methode, den sogenannten Neuroblasten-Assay, differenziert.Letztlich können mithilfe der Durchflusszytometrie unterschiedliche Zellpopulationen anhand ihrer physikalischen und fluoreszierenden Eigenschaften identifiziert und sortiert werden. In diesem Protokoll stellen wir neuartige Methoden sowohl für die Differenzierung von neuronalen Stammzellen, was als Neuroblasten-Assay bezeichnet wird, als auch für die Aufreinigung der resultierenden unreifen neuronalen Nachkommen mittels Durchflusszytometrie vor. Der Neuroblasten-Assay umfasst eine Proliferationsphase, die etwa drei bis vier Tage dauert, und eine Differenzierungsphase, die etwa vier bis fünf Tage in Anspruch nimmt.Während der Differenzierungsphase bildet sich eine einzige Zellschicht, die aus Astrozyten in der Unterlage besteht, bedeckt mit Zellh

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Neurowissenschaften

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

Dieses Video demonstriert den Neurosphären-Migrationsassay für neuronale Vorläuferzellen – ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Migrationsreaktion von neuronalen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre – mittels mikroskopischer Analyse.

NPC Neurosphere Assay: Ein in vitro Assay zur Beurteilung der Migrationsreaktion von neuralen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen und/oder intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Kritische Aspekte der Versuchsplanung, methodische Schritte und grundlegende Prinzipien der Durchflusszytometrie werden erläutert, um Neurobiologen in die Lage zu versetzen, diese leistungsstarke Technologie zu nutzen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Lernen Sie die Neuroblast-Assay-Methode zur Erzeugung und Anreicherung neuronaler Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Sortierung spezifischer Zellpopulationen.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

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