Name: Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Lernen Sie die Neuroblast-Assay-Methode zur Erzeugung und Anreicherung neuronaler Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Sortierung spezifischer Zellpopulationen.

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1. Basic Set Up Bevor mit Cell Culture <ol><li> NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Zuschläge sind in einem Verhältnis 9:1 gemischt, jeweils um komplette NSC Medium zu machen. </li><li> A 37 ° C warmes Wasserbad verwendet wird zum Aufwärmen des Mediums. </li><li> Geeignete Menge von Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) aufgetaut. </li><li> Geeignete Menge über diesen Wachstumsfaktor Lösungen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktor (EGF bei 10 ug / ml), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF bei 10 ug / ml) und 0,2% Heparin-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgetaut. </li><li> Zellkulturflaschen (T25, T75 oder T175 &amp;) werden für NSC Expansion und Differenzierung notwendig. </li><li> Gewebekultur behandelt 96 und 24 Well-Platten und Deckgläser werden für die Beschichtung von sortierten Zellen benötigt werden. </li></ol> 2. Isolation und Expansion (Die Passage) von NSCs <ol><li> Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen werden isoliert und von der Maus b erweitertRegen wie in separaten Protokollen Nr. 1, 2 3 beschrieben. </li><li> Wenn die Neurosphären (primär oder passagierten Neurosphären) bereit für Subkultur (150-200 &amp;mgr; m im Durchmesser) sind, ist das Medium, Sphären auf eine geeignete Größe sterile Gewebekultur-Röhrchen überführt und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand Medium wird entfernt und die Kugeln in 1 ml der vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert. </li><li> Nach der Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 2-3 min, wird ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu der Zellsuspension zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde vollständig inaktiviert wird die Zellsuspension auf und ab pipettiert 3-5 mal. </li><li> Nach Zentrifugation bei 800 Upm (110 g) für 5 min wird der Überstand entfernt und die Zellen werden in 1 ml vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> 10 &amp;mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul trypa gemischtn blue zur Durchführung einer Zellzahl. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Die Zellen werden dann für die Subkultur 1, 2 oder zur Differenzierung wie unten beschrieben verwendet. </li></ol> 3. Differenzierung neuraler Stamm-und Progenitorzellen, die Neuroblast Assay (NBA) <ol><li> Zellen, die aus dissoziierten Neurospheres werden in einer Konzentration von 2-3 × 10 5 Zellen / ml in der gesamten NSC-Medium mit 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 l / ml von 0,2% und 5% Heparin ausplattiert Hitze inaktiviertes FCS in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche. 5 ml Medium für T25, T75 für 20 ml und 40 ml für T175-Flaschen verwendet. Hinweis: FCS daß die Zellen fest mit dem Substrat zu befestigen und es gibt keine Notwendigkeit für die Beschichtung der Kolben für NBA Kultur. </li><li> KultAbbildung Kolben werden dann in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird als Proliferation Phase werden NSC Nachkommen an dem Substrat und proliferieren als eine Monoschicht von Zellen. </li><li> Wenn die Kultur Konfluenz 90-95%, die mittlere jeder Flasche wird auf der gesamten NSC-Medium mit 5% FCS ohne Wachstumsfaktoren ergänzt eingeschaltet. </li><li> Kulturflaschen werden erneut in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für weitere 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird der Grad der Differenzierung genannt, während der neuronalen Vorläuferzellen erscheinen oben auf einem astrozytären Monoschicht und sich vermehren, um Kolonien von unreifen Nervenzellen machen. Am Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, ist die Kultur bereit für die Isolierung der Neuroblast Zellen mittels Durchflusszytometrie-Technologie. </li></ol> 4. Zellpräparation für die Durchflusszytometrie Trypsinisierung <ol><li> Die Kultur der Differenzierung NSC Nachkommen am Tag 4-5 der Zelldifferenzierung wird einmal mit einer geeigneten Menge an PBS (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) mit FCS aus der Kultur entfernt gewaschen. Hinweis: FCS Blöcke Trypsin-EDTA-Aktivität. </li><li> Dann wird eine ausreichende Menge an vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) in jeden Kolben zugegeben, um die Zellmonoschicht bedecken und inkubiert für 1-2 min in 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Der Kolben wird unter dem Mikroskop, um die Wirkung von Trypsin-EDTA auf die Kultur zu bewerten überprüft. Der Kolben wird dann mit einer Hand gehalten und schlug fest mit der anderen Hand, um die Zellen vom Boden der Flasche zu entfernen. </li><li> Gleiche Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird in den Kolben zu Trypsin-Aktivität zu löschen zugegeben. Die Zellsuspension wird sanft nach oben und nach unten zu Trypsin pipettiert Inaktivierung zu gewährleisten und um eine homogene einzelne Zelle erreichenSuspension. Hinweis: Alternativ-Medium mit 5% FCS verwendet werden, um Trypsinaktivität stillen werden. </li><li> Um nicht getrennten Klumpen zu entfernen, wird die Zellsuspension durch ein 40-Mesh-Größe um-Filter geleitet. </li><li> Die Zellsuspension wird dann bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden in einem geeigneten Volumen an vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> Das Endvolumen der Zellsuspension wird so eingestellt, dass die Zelldichte nicht mehr als 2-3x10 6 -cells/ml. Hoher Zelldichte könnte Strom Blockade in der Durchflusszytometrie Maschine verursachen. </li><li> Wenn Sie möchten, neuronalen Zellen nur auf ihre physikalischen Eigenschaften zu isolieren, jetzt können Sie auf FACS-Sortierung wie in Teil 4 beschrieben fortfahren. </li><li> Vor dem Sortieren wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen aufgenommen. </li></ol> Live-cell Immunomarkierung Um eine höhere Reinheit des neuronalen Zellen, geerntet einzelnen Zelle aus der NBA Kultur kann für PSA-NCAM (ein Marker der frühen unreifen neuronalen Vorläuferzellen) und dann die positiven Zellen aus der neuronalen Population angefärbt werden erreichen können isoliert mit der FACS-Maschine werden. <ol><li> Nach Durchführung einer Zellzählung, wird die einzige Zellsuspension aus der NBA-Kultur in vier Gruppen unterteilt: <ul><li> Zellen allein Gruppe dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 1 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Zellen plus PI, dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 10 x 10 6 Zellen) einzustellen. PI-negativen Zellen aus dieser Gruppe können auch bezogen auf die Zellen physikalischen Eigenschaften sortiert werden. </li><li> Sekundäre allein (Isotyp-Kontrolle), die Gruppe dient auch als Kontrolle, um Parameter und Tore (1-2 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Immunmarkierung Gruppe (8-10 x 10 6 Zellen), die für PSA-NCAM gefärbt ist, um zu erreichenweitere Reinigung der unreifen neuronalen Zellen. Um tote Zellen auf Sortierung auszuschließen, wird PI zu dieser Gruppe hinzugefügt als auch. </li></ul></li><li> Um Immunmarkierung zu starten, werden die Zellen bei 800 Upm (110 g) für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden in 100 ul vollständige NSC resuspendiert. </li><li> Phycoerythrin (PE) konjugiertem Anti-PSA-NCAM Antikörper in einem Verhältnis von 10 ul / 5-10 × 10 6 Zellen der Zellsuspension für PSA-NCAM gefärbt werden zugegeben. In gleicher Weise wird eine PE-konjugiertem Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper der Isotyp-Kontrolle Zellsuspension zugegeben. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Antikörper Datenblatt über die Konzentration der Antikörper verwendet werden. Die Zellsuspension wird dann vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert für 10-15 min im Dunkeln. </li><li> Die Zellsuspensionen (PSA-NCAM und Isotyp Kontrollröhrchen) werden dann bei 800 Upm (110 g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden wieder &amp; Fahrwerknded in 1 ml vollständigem Medium NSC. </li><li> Um überschüssige un-beschränkt Antikörper, die aus den Proben zu entfernen, wird der Schritt April 2-3 mal wiederholt. </li><li> Nach der erneuten Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen an Medium, Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) bei einer Konzentration von 1 l / ml der Zellsuspension (Zellen plus PI, Isotyp-Kontrolle und das hinzugefügt PSA- NCAM-gefärbten Proben), um auszuschließen, wenn tote Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li><li> 15 ml-Falcon-Röhrchen sterilen mit 1 ml vollständigem Medium bereit sind, sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu sammeln. </li></ol> 5. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) von unreifen Neuronen <ol><li> Die FACS-Maschine wird auf der Grundlage seiner Anleitung Handbuch über die Durchflusszytometrie Anlage-Experte Techniker eingestellt. </li><li> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder andere geeignete Lösungen depending auf die Anweisungen des Herstellers, könnte als Hüllfluid bei 28 PSI durch eine 90 um Düse verwendet werden. </li><li> Differenzdruck auf dem System ist so eingestellt, dass die Art Trigger nicht übersteigt 2500 Ereignisse / Sekunde. </li><li> Die Zellsuspension aus den Zellen allein Gruppe wird durch die FACS-Maschine laufen. </li><li> Zunächst werden die Zellen (Ereignisse) auf der Basis ihrer Größe (Forward Scatter (FSC) Licht) versus interne Komplexität (Side Scatter (SSC)-Licht) zu unterschiedlichen Zellpopulationen unterscheiden aufgetragen. Um dies zu tun, sollte die Spannung Parameter für FSC und SSC so eingestellt, dass die Zellen in der Durchflusszytometrie Diagramm kann gesehen werden. </li><li> Um Zellklumpen und Dubletten auszuschließen, werden die Zellen zunächst aufgetragen basierend auf Vorwärtsstreuung Bereich (FSC-A) gegenüber Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und die Single-Zell-Population ist als gated Bevölkerung 1 (P1). Dann werden die P1-Zellen basieren auf Seite Streubereich (SSC-A) versus Seitwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und dieser Zeit werden die einzelnen Zellen sind gat aufgetragened Bevölkerung als 2 (P2). Nachdem festgestellt wurde, diese zwei aufeinanderfolgenden Toren, Klumpen oder Dubletts (FSC hohe Pulsbreite und hohe SSC Impulsbreite) werden ausgeschlossen. </li><li> Um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, werden die einzelnen Zellen (P2), basierend auf PI Reaktivität gegenüber FSC-A und dem einzigen Live-Zell-Population ist gated aufgetragen. </li><li> Einzel lebenden Zellen basieren auf FSC gegen SSC aufgetragen zu unterschiedlichen Zellpopulationen auf Zellgröße und Granularität der Basis interner unterscheiden. In diesem Stadium zwei Zellpopulationen torgesteuert FSC niedrigen SSC niedrig (P3) und FSC hohen SSC hoch (P4) Zellpopulationen. </li><li> So sortieren PSA-NCAM immunreaktiven unreifer neuronaler Zellen aus dem FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte, die erste FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte von Kontrolle (Zellen plus PI und Isotyp-Kontroll-) Gruppen wird auf Basis PE-Immunreaktivität gegen FSC-A aufgetragen und die negative Zellen sind gated (P5), und dann positiven Zellen von PSA-NCAMgebeizt Gruppe sind als gated Bevölkerung 6 (P6). </li><li> Nach der Einstellung alle benötigten Tore, werden die Zellen von Interessen in 15 ml sterile Zellkultur-Röhrchen mit 1 ml Medium NSC sortiert. </li><li> Die sortierten Zellen werden dann bei 1200 rpm (240 g) für 5 Minuten zentrifugiert. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in einem geeigneten Volumen des Mediums (in Abhängigkeit von der Pelletgröße) und einer Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird. </li><li> Die Zellen werden dann in Poly-L-Ornithin beschichteten 96-Well-Platten bei einer Dichte von 20-30 x 10 3 Zellen / Vertiefung in 200-250 ul vollständige NSC-Medium ausplattiert mit 5% FCS und 20 ng / ml menschlichen rekombinanten BMP4 5 . </li></ol> Hinweis: die Beschichtung 96 Vertiefungen, 100 ul von Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung (1,5 ml Poly-O und 8,5 ml steriler PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird bei 37 ° C-Inkubator für mindestens eine inkubiert Stunde. Dann wird das Poly-O entfernt und jede Vertiefung dreimal mit sterilem PBS gewaschen(Lassen Sie die PBS in der gut bleiben für jeweils 10 Minuten Zeit). Verwenden Sie 500 ul von Poly-L-Ornithin Arbeitslösung / gut, wenn 24-Well-Platten verwendet werden. <ol start="14"><li> Die Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Art mit kaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und immungefärbt geeignete neuronale und gliale Zellmarker, um den Phänotyp der sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu bewerten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Im Neuroblast Assay (NBA) Differenzierung Kultur, plattierten Zellen der Gewebekultur Substrat zu befestigen und zu wachsen als einer Monoschicht. Je nach anfänglichen Zelle Beschichtungs-Dichte, wird die Kultur in eine 90-95% konfluenten Kultur nach 3-4 Tagen zu machen. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Monoschicht von hauptsächlich Astrozyten visualisiert unten mit kleinen runden neuronalen Vorläuferzellen auf 4,5 (Abbildung 1). Nach dem Einschalten des Mediums an einen Wachstumsfaktor Medium, startet neuronalen VorläuferzellenTeilung rasch und erzeugen Cluster von unreifen Zellen Neuroblast auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht in 4-5 Tagen (Abbildung 2). Durchflusszytometrie dissoziierter NBA Kultur an Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, zeigt im Wesentlichen zwei Zellpopulationen; FSC niedrigen SSC niedrigen und hohen FSC-SSC hoch auf Zellgröße (FSC) und interne Granularität (SSC) (Abbildung 3). Immuno-Fluoreszenz-Analyse der sortierten Zellen zeigt, dass die neuronalen Zellen vor allem in der FSC-SSC niedrigen niedrigen Populationen (mit mehr als 75% von ihnen zum Ausdruck β-Tubulin-III) befindet, während sortierten Zellen aus dem FSC-SSC hoch hoch Bevölkerung sind meist GFAP immunreaktiv Astrozyten (Abbildung 4). Die weitere Reinigung von unreifen neuronalen Zellen bis zur Homogenität (97%) könnte eine positive Selektion von PSA-NCAM IR-Zellen aus dem FSC niedrigen SSC dünn besiedelte (Abbildung erreicht werden3, 4). Angereichert neuronalen Zellen aus den NSCs von E14 Maus ganglionären Eminenzen isoliert generiert erwerben einen GABAergen Phänotyp und Express DARPP-32, einem Marker der mittleren stachelige Neuronen, auf Differenzierung (Abbildung 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Proliferation der Bühne. Diese Monoschichtkultur besteht aus flachen Zellen Astrozyten (Pfeilspitzen) und darunter rund neuronalen Vorläuferzellen (Pfeile) an der Spitze. Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="2"/> . Abbildung 2 Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Differenzierung der Bühne: A) Phasenkontrast, B) Immunfluoreszenzfärbung. Beachten Sie die Ansammlung von unreifen neuronalen Zellen (Pfeile in A </strong&gt; und β Tubulin-III-Färbung in B) auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht (Pfeilspitzen in A-, GFAP-Färbung in B). Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> . Abbildung 3 Vertreter Sortieren Plots: A). FSC vs SSC Art Plot vor Ausschluss von Dubletten und tote Zellen. B, C). Sortieren Grundstücke für den Ausschluss von Dubletten auf FSC-und SSC-Pulsbreite. D basiert). Ausschluss von toten und geschädigten Zellen auf Propidiumiodid Immunreaktivität basiert. E). FSC vs SSC Plot nach Ausschluss von Dubletten und tote Zellen, welche die beiden wichtigsten Bevölkerungsgruppen wie dem FSC-SSC niedrigen niedrigen und den hohen SSC FSC hohe Populationen bezeichnet. F, G). Sortieren Plots zu PSA-NCAM IR unreife Zellen aus dem FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung zu isolieren. Abbildung 4. Vertreter Aufnahmen von Zellen aus verschiedenen Populationen einen Tag nach Plattieren sortiert. A) FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung (mehr als 75% dieser Zellen sind Neuronen). B) FSC hohe SSC hohen Bevölkerung (die meisten dieser Zellen sind Astrozyten ). C) PSA-NCAM + sortierten Zellen aus FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte (fast alle der sortierten Zellen sind Neuronen). Ursprüngliche Vergrößerung, 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Sortiert unreifen Neuronen differenzieren zu GABAergen Neuronen (A) und Express DARPP-32 (B), einem Marker für mittlere stachelige Neuronen.

<ol><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li>
<li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Möglichkeit, definierte neuronale Zellpopulationen zu isolieren (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) lösen könnten einige der Hindernisse bei der klinischen Anwendung der neuralen Stammzellen (NSCs) verbunden sind. Erstens ermöglicht es uns für die vollständige Charakterisierung der Ausgangspopulation von Spenderzellen. Zweitens erlaubt es uns, einen bestimmten Zelltyp oder eine Kombination von verschiedenen Zelltypen mit einem bestimmten Verhältnis zu verwenden, je nach Art oder das Stadium der Erkrankung...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements </td><td> Medium Ergänzung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * Destilliertes Wasser </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Flasche </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80-Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Antikörper </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-konjugierten Maus-IgG1 </td><td> Isotypkontrollantikörper </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-OrnitHine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> Medium Supplement </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Antikörper </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III-Tubulin </td><td> Antikörper </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Um sicherzustellen, HEM, Mix 1 x 10 L-Paket von MEM und 160 ml 1 M HEPES und bringe das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Stellen Sie den End-pH auf 7,4 und bewahren Sie ihn bei 4 ° C

die neuroblast assay: ein test für die erzeugung und anreicherung von neuronalen vorläuferzellen aus neuralen stammzellen differenzieren progeny mittels durchflusszytometrie

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neurale Stammzellen (NSC) isoliert und in erweitert werden große, mit der Neurosphere Assay und differenzierten zu den drei Zelltypen des zentralen Nervensystems (CNS), nämlich, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen. Diese Eigenschaften machen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von Zellen für in vitro-Studien wie Wirkstoff-Screening, Neurotoxikologie und Elektrophysiologie und auch für die Zell-Ersatz-Therapie bei vielen neurologischen Erkrankungen. In der Praxis jedoch, die Heterogenität der NSC Nachkommen, geringe Produktion von Neuronen und Oligodendrozyten und Astrozyten Vorherrschen nach der Differenzierung beschränken ihre klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode für die Erzeugung und anschließende Reinigung der unreifen Neuronen aus murinen NSC Nachkommen mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS)-Technologie. Mit dieser Methode kann ein hoch angereichertes neuronalen Vorläuferzellen Zellpopulation Witz erreicht werdenHout keine spürbaren Astrozyten und bona fide NSC Kontamination. Das Verfahren umfasst Differenzierung von NSC Nachkommenschaft isoliert und expandiert von E14 Maus ganglionären Eminenzen mit dem Neurosphäre Assay, durch Isolierung und Anreicherung von unreifen neuronalen Zellen auf der Basis ihrer physikalischen (Größe und interne Komplexität) und fluoreszierenden Eigenschaften mittels Durchflusszytometrie Technologie gefolgt. Insgesamt dauert es 5-7 Tage, um Neurosphären und 6-8 Tage zu erzeugen, um NSC Nachkommen zu unterscheiden und zu isolieren hochgereinigten unreifen neuronalen Zellen.

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neurale Stammzellen (NSCs) können mittels des Neurosphären-Assays isoliert und in großem Maßstab expandiert sowie in die drei Hauptzelltypen von ... differenziert werden.

Das Ziel dieses Video-Protokolls ist es, die Generierung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus differenzierenden Nachkommen von Neurostammzellen mittels Durchflusszytometrie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Neurostammzellen mittels Neurosphären-Assay isoliert und expandiert werden. Die resultierenden Zellen werden anschließend über eine zweistufige Methode, den sogenannten Neuroblasten-Assay, differenziert.Letztlich können mithilfe der Durchflusszytometrie unterschiedliche Zellpopulationen anhand ihrer physikalischen und fluoreszierenden Eigenschaften identifiziert und sortiert werden. In diesem Protokoll stellen wir neuartige Methoden sowohl für die Differenzierung von neuronalen Stammzellen, was als Neuroblasten-Assay bezeichnet wird, als auch für die Aufreinigung der resultierenden unreifen neuronalen Nachkommen mittels Durchflusszytometrie vor. Der Neuroblasten-Assay umfasst eine Proliferationsphase, die etwa drei bis vier Tage dauert, und eine Differenzierungsphase, die etwa vier bis fünf Tage in Anspruch nimmt.Während der Differenzierungsphase bildet sich eine einzige Zellschicht, die aus Astrozyten in der Unterlage besteht, bedeckt mit Zellhaufen unreifer Neuronen. Wenn die differenzierenden Nachkommen von neuronalen Stammzellen in Einzelzellen dissoziiert und anschließend durch das Durchflusszytometrie-Gerät geleitet werden, zeigt sich ein deutlicher Unterschied zwischen den neuronalen Vorläuferzellen und den übrigen Zellen hinsichtlich ihrer Größe und inneren Komplexität. Durch die Auswahl der kleinen Zellpopulation, die geringe Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften aufweist, können hochangereicherte neuronale Zellen isoliert werden, um eine noch homogenere neuronale Zellpopulation zu erhalten.Die dissoziierte neurovaskuläre Assaykultur kann auf PSA und Cam untersucht werden, und die positiven Zellen können aus der kleinen Zellpopulation selektiert und sortiert werden. Beginnen wir. Neurale Stammzellen werden aus embryonalen Mäusen isoliert und expandiert.Ganglionärer Wulst am 14. Tag unter Verwendung des Neurosphären-Assays, wie in einem separaten Video-Protokoll dargestellt, das unter der auf dem Bildschirm angezeigten Adresse zu finden ist. Sicherstellen, dass die Sphären einen Durchmesser von 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben. Die Sphären sammeln und in ein steriles Röhrchen geeigneter Größe überführen.Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 800 U/min oder 110 G für fünf Minuten. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Sphären in einem Milliliter vorgewärmter Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad.Geben Sie ein gleichen Volumen Trypsininhibitor zu den Zellen hinzu und mischen Sie gründlich, um die Trypsinaktivität zu stoppen und eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Überführen Sie die Zellen in ein kleineres Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut bei 110 G für fünf Minuten. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei Milliliter.Vollständiges Medium für neurale Stammzellen. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie diese gut mit 90 Mikrolitern Trypanblau und führen Sie eine Zellzählung durch. Um das Wachstums-Kulturmedium herzustellen, geben Sie Fötales Kälberserum hinzu, um eine Endkonzentration von 5 % im vollständigen Medium für neurale Stammzellen zu erreichen.Gebe anschließend die Zellen dem Kulturmedium hinzu, um eine Dichte von zwei bis 300.000 Zellen pro ml zu erreichen. Füge nun EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml und bFGF in einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro ml hinzu. Mische die Zellsuspension gründlich, um sie homogen zu machen, und pipettiere 20 ml pro T-80-Flasche aus.Stellen Sie die Kolben drei bis vier Tage lang in den Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2. Die Nachkommen der neuralen Stammzellen werden sich an das Substrat anheften und sich innerhalb von drei bis vier Tagen nach der anfänglichen Aussaat als monolayerartige Kultur vermehren. Die Kultur wird dann 90 bis 95 % konfluent sein und ist nun bereit, das Medium durch ein wachstumsfaktorfreies Medium für die Differenzierung zu ersetzen. Bereiten Sie nun frisches neuronales Stammzellmedium vor, das mit 5 % FCS, jedoch ohne Wachstumsfaktoren, ergänzt ist.Entfernen Sie das Medium aus jedem Kolben und ersetzen Sie es durch wachstumsfaktorfreies Medium. Inkubieren Sie die Kolben für vier bis fünf zusätzliche Tage. In dieser Zeit teilen sich die neuronalen Vorläuferzellen aktiv und bilden Kolonien unreifer neuronaler Zellen, die sich auf einer astrozytären Monoschicht abheben.Um die Zellen für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, entfernen Sie zunächst am fünften Tag des Differenzierungsstadiums das Medium aus dem Kolben. Anschließend geben Sie vier Milliliter PBS hinzu, wirbeln vorsichtig etwa 30 Sekunden lang und entfernen das PBS. Danach geben Sie eine ausreichende Menge vorgewärmtes Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellmonolage im Kolben zu bedecken.Stellen Sie den Kolben für eine bis zwei Minuten in einen 37-Grad-Inkubator und schlagen Sie den Kolben anschließend zwei- bis dreimal an, um sicherzustellen, dass sich die Zellen ablösen. Nun wird eine gleiche Menge an Trypsin-Inhibitoren dem Kolben zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Die Zellsuspension wird vorsichtig mehrmals auf- und abpipettiert, um eine vollständige Inaktivierung des Trypsins sicherzustellen und eine homogene Einzelzell-Suspension zu erhalten.Überführen Sie den Inhalt des Kolbens in ein passend dimensioniertes Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 110 ×g. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Neuro-Stammzellmedium und führen Sie eine Zellzählung durch, wie zuvor bei den Einzelzellen aus dem Neuroblasten-Assay beschrieben. Die Kulturen werden in vier Gruppen unterteilt: Zellen allein, Zellen plus PI, Isotypkontrolle und PSA in CAM.Medium zu den Zellen allein und den Zellen plus PI-Röhrchen hinzufügen, sodass jeweils ein Gesamtvolumen von einem Mil erreicht wird. Sicherstellen, dass ihre Dichten zwei bis 3 Millionen Zellen pro ml nicht überschreiten, um eine Verstopfung im Strahl des Zytometrie-Flusszyklons, der Isotyp-Kontrolle und der PSA- und Cam-Röhrchen zu vermeiden. Das Überstand von beiden Röhrchen entfernen und die Zellen in 100 Mikroliter vollständigem Neuro-Stammzell-Medium resuspendieren.Gemäß den Anweisungen des Herstellers die geeignete Menge PE-konjugiertes Isotyp-Kontrollantikörper sowie PE-konjugierte anti-PSA- und cam-Antikörper in die jeweiligen Röhrchen geben. Die Proben vorsichtig mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Die Proben zentrifugieren und das Überstand von beiden Röhrchen entfernen, anschließend die Zellen in einem Milliliter vollständigem Neuro-Stammzellmedium resuspendieren.Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei bis drei Mal, um überschüssige, nicht gebundene Antikörper nach der letzten Wäsche zu entfernen. Resuspendieren Sie jede Probe in einem Milliliter vollständigem Medium. Geben Sie Propidiumiodid in einer Konzentration von einem Mikroliter pro Milliliter zu jeder Probe hinzu.Abgesehen von der Zellen-allein-Gruppe bereiten Sie drei 15-ml-Röhrchen mit je einem ml vollständigem Neuro-Stammzellmedium vor, um die verschiedenen Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu sammeln, bevor die Fluoreszenz-Aktivierte Zellsortierung beginnt. Die Maschine muss vorab von einem erfahrenen technischen Betreuer der Einrichtung hinsichtlich Laserjustierung, Spannungsparametern und einwandfreier Funktion eingestellt werden. Sobald diese Einstellungen vorgenommen wurden, leiten Sie die Zellsuspension aus der Zellen-allein-Gruppe durch die Sortiermaschine.Zunächst werden die erfassten Ereignisse basierend auf ihren Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften abgebildet, um verschiedene Zellpopulationen zu unterscheiden. Dazu sollte die Spannung so eingestellt werden, dass die Ereignisse im Durchflusszytometrie-Diagramm sichtbar sind. Führen Sie nun die Zellen plus PI-Probe aus, um Zellklumpen und Doppelzellen auszuschließen.Die Ereignisse werden basierend auf dem Vorwärtsstreuungsflächeninhalt gegenüber der Vorwärtsstreu-Impulsbreite aufgetragen, und die Einzelzellpopulation wird als Population eins ausgewählt. Feinjustieren Sie das Tor, um Ereignisse mit hoher Vorwärtsstreu-Impulsbreite auszuschließen. Anschließend weitere Agglomerate und Doppelzellen ausschließen.Die Zellen der Population eins werden basierend auf der Seitenstreufläche im Vergleich zur Pulsbreite der Seitenstreuung dargestellt, und diesmal werden die einzelnen Zellen als Population zwei ausgewählt. Ereignisse mit hoher Pulsbreite der Seitenstreuung werden ausgeschlossen, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen. Die einzelnen Zellen der Population zwei werden basierend auf der PI-Reaktivität im Vergleich zur Vorwärtsstreufläche dargestellt, und die Population der einzelnen lebenden Zellen wird ausgewählt.Nun werden einzelne lebende Zellen basierend auf dem Vorwärtsstreuungs-Area im Vergleich zum Seitwärtsstreuungs-Area dargestellt. In diesem Stadium werden Populationen kleiner und großer Zellen ausgewählt. Die kleine Population weist geringe Vorwärtsstreuung und geringe Seitwärtsstreuung auf und wird hier als Population drei bezeichnet.Die große Population weist hohe Werte im Forward Scatter und hohe Werte im Side Scatter auf und wird hier als Population vier bezeichnet, um zunächst PSA- und CAM-positive Zellen auszuwählen. Die Populationen mit niedrigem Forward Scatter und niedrigem Side Scatter von Zellen mit PI sowie Isotyp-Kontrollgruppen werden basierend auf der PE-Immunreaktivität im Vergleich zur Forward-Scatter-Fläche dargestellt, und die negativen Zellen werden als Population fünf abgegrenzt. Anschließend wird die Probe mit PSA- und CAM-Färbung durch das Gerät gegeben, und die positiven Ereignisse werden als Population sechs abgegrenzt.Die sterilen Gewebekulturröhrchen mit 15 Mil, die jeweils ein Mil neuronales Stammzellmedium enthalten, werden in das Gerät eingelegt, um sortierte Zellpopulationen zu sammeln. Anschließend werden die gewünschten, gezielten Zellpopulationen ausgewählt und sortiert, nachdem die Zellen sortiert wurden. Kehren Sie zurück zur Gewebekulturhaube und spülen Sie die Röhrchen aus, um eventuell an den Wänden haftende sortierte Zellen freizugeben.Danach die Röhrchen fünf Minuten lang mit 1200 U/min oder 240 G zentrifugieren, das Überstand entfernen und die Zellen in einer geeigneten Menge vollständigem Neuro-Stammzell-Medium resuspendieren. Anschließend eine Zellzählung wie zuvor gezeigt durchführen, um die Zellen zu sezernieren. Zunächst eine ausreichende Menge vollständiges Neuro-Stammzell-Medium vorbereiten, ergänzt mit 5 % FCS und 20 Nanogramm pro ml.Menschliches rekombinantes BMP vier. Mischen Sie das Medium gründlich und verteilen Sie es auf frisch beschriftete Röhrchen, die den verschiedenen sortierten Zellpopulationen entsprechen. Geben Sie die sortierten Zellen den entsprechenden Röhrchen hinzu, um eine Dichte von etwa 100.000 bis 150.000 Zellen pro ml zu erreichen.Entfernen Sie nun das Medium von der mit Polio beschichteten 96-Well-Platte, mischen Sie die Zellsuspensionen und geben Sie 200 bis 250 Mikroliter pro Well hinzu. Beschriften Sie die Platte und stellen Sie sie bei 37 Grad und 5 % CO2 in den Inkubator. Dies ist ein Beispiel einer Neuroblasten-Assay-Kultur aus E14-Maus-Neuro-Stammzellen. Am vierten Tag der Proliferationsphase zeigen Pfeilspitzen die flachen astrozytären Zellen darunter und Pfeile die runden neuronalen Vorläuferzellen darüber.Dies ist ein Beispiel für eine Neuroblasten-Assay-Kultur fünf Tage nach dem Wechsel in das Wachstumsfaktor-3-Medium. Wie Sie sehen können, wachsen dort Zellhaufen neuronalen Vorläuferzellen auf einem astrozytären Monolayer. Hier sehen Sie ein Beispiel einer immunfluoreszenten Färbung derselben Kultur.Beachten Sie den Haufen von mit Beta-drei-Tubulin gefärbten unreifen neuronalen Zellen, die auf GFAP-exprimierenden Astrozyten liegen. Dies ist ein Beispiel für Zellen, die aus der Population mit niedriger Vorwärtsstreuung und niedriger Seitwärtsstreuung sortiert wurden, von denen die Mehrheit den neuronalen Vorläufermarker Beta-drei-Tubulin exprimiert. Dies sind Zellen, die aus der Population mit hoher Vorwärtsstreuung und hoher Seitwärtsstreuung sortiert wurden, von denen die Mehrheit glialen fibrillären sauren Protein-exprimierende Astrozyten sind.Dies sind die PSA- und CAM-positiven sortierten Zellen aus der Population mit niedriger Vorwärtsstreuung und niedriger Seitwärtsstreuung, und fast alle sind beta-3-Tubulin-exprimierende Neuronen; sortierte neuronale Vorläuferzellen können in Kultur überleben und sich zu GABAergen, D32-exprimierenden mittleren Spiny-Neuronen ausreifen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man unreife Neuronen aus differenzierenden neuronalen Stammzell-Nachkommen erzeugt und reinigt, um eine hochwertige Kultur für Neuronausfall-Assays zu erhalten. Wir empfehlen, die Sphären nicht zu groß werden zu lassen. Große Sphären gehen mit vermehrtem Zelltod und geringerer neurogener Fähigkeit einher.Die Sphären nicht länger als zwei bis drei Minuten mit Trypsin behandeln, da Trypsin sonst die Zellen schädigt und ihre neurogene Potenz verringert. Zudem darf die durchlöcherte mehrschichtige Schicht nicht überkonfluent werden. Dies könnte den normalen Differenzierungsprozess stören. Daher sollte das Medium stets gewechselt werden, wenn die Kultur eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht. Bei Verwendung der Durchflusszytometrie wird dringend empfohlen, Antibiotika im Kulturmedium zu verwenden, um Kontaminationen zu verhindern.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

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