Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung hämatopoetischer Vorläuferzellen mittels magnetischer Säulenseparation und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Zunächst werden das Hinterbein, der Femur, die Tibia und das Rückenmark von einer Maus präpariert und homogenisiert, um eine Knochenmarkzell-Suspension herzustellen. Anschließend wird die Zellpopulation angereichert für Zellen, die C kit exprimieren, unter Verwendung magnetischer Mikroperlen-Fluss-Technik.

Die zytometrische Analyse der angereicherten Population zeigt, dass diese Methode hochreine hämatopoetische Zelllinien, Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen liefert, die anschließend für funktionelle in-vitro- und in-vivo-Studien verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Ausspülen aus Knochen besteht darin, dass sie eine effizientere und schnellere Gewinnung von Knochenmarkzellen ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienzen, degenerativen Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs-Immunmodellen, da sie die phänotypische Charakterisierung und die funktionelle Analyse hämatopoetischer Vorläuferzellen ex vivo erlaubt.

Daher kann diese Methode Einblicke in die Überwachung der Hämatopoese unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen bieten. Sie kann auch verwendet werden, um die zellbiologischen Signalübertragungen und die entwicklungsregulierte Genexpression in unterschiedlichen Vorläufer-Teilpopulationen zu untersuchen. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus in eine Edelstahlschale zu legen.

Sprühen Sie den Bauch und den Rücken mit 70 % Ethanol ein, um die Knochen zu sammeln, die als Zellquelle verwendet werden. Verwenden Sie eine Schere, um mit Hilfe einer Pinzette an den Hinterbeinen zwei kleine Öffnungen in die Haut zu schneiden, lösen Sie den Femur aus der Gelenkpfanne und drehen Sie dann die Maus auf den Kopf, um die Haut längs zu schneiden. Um die Wirbelsäule freizulegen, entfernen Sie die Wirbelsäule.

Dann mit einer Schere mit scharfer Spitze vorsichtig alle Weichgewebsreste von der Wirbelsäule entfernen. Mit Mull die Weichgewebsreste vom Femur und Tibia entfernen.

Legen Sie die Knochen anschließend in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 30 Milliliter ergänztes RPMI-Medium enthält. Geben Sie mehrere vierfünftel sterile Filter in einen sterilen Mörser. Übertragen Sie die Knochen dann mit einer Pinzette in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer weiteren Filterschicht, um eine Reibfläche zu erzeugen.

Platzieren Sie anschließend einen 40-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischglas. Zerkleinern Sie dann mit einem Pistill die Knochen, bis eine homogene Zellsuspension erhalten ist. Überführen Sie die Suspension mithilfe einer Pipette in den Zellfilter.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter frisches, supplementiertes RPMI zum Mörser hinzu, um die verbleibenden Zellen abzuwaschen und durch Pipettieren auf und ab zu gewinnen. Geben Sie dann das RPMI in das Röhrchen mit dem Filter. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis die homogenisierten Knochen klar erscheinen.

Nachdem die Lösung durch den Filter gegangen ist, überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und filtrieren Sie erneut, um die verbleibenden Gewebetrümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Phänotypen hämatopoetischer Vorläuferzellen zu charakterisieren. Beginnen Sie damit, das Zellpräparat von jeder Maus in 15 Milliliter PBS mit 2 % FBS erneut in Suspension zu bringen. Zentrifugieren Sie danach das Gefäß bei 500 ×g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.

Stören Sie das Pellet nicht. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS mit 2 % FBS, und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Sobald die Zellenkonzentration bestimmt ist, übertragen Sie eine Zehntausendstelportion der sechs Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte.

Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 500 × g für fünf Minuten. Während des Zentrifugierens bereiten Sie eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern vor, die gegen die hier aufgeführten Oberflächenmarker in PBS mit 2 % FBS gerichtet sind, um die Zellen zu färben. Sobald der Zentrifugierdurchgang abgeschlossen ist, entsorgen Sie das Überstand durch Umkehren der Platte und geben 50 µL der Antikörpermischung in jedes Loch.

Dann mit einem Mehrkanalpipettierer mehrmals auf- und abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellen 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit jeweils 150 Mikroliter PBS und 2 % FBS waschen. Anschließend die Platte fünf Minuten bei 500 × g zentrifugieren.

Danach verwerfen Sie das Senna, indem Sie die Platte umdrehen. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter verdünntes eins zu 300 AP drei Größe sieben Streptavidin in PBS mit 2 % FBS zu jedem Brunnen hinzu und dissoziieren Sie in eine Einzelzell-Suspension, indem Sie pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius; danach folgt die Inkubation.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 Mikrolitern PBS und 2 % FBS. Nach dem Zentrifugieren der Platte wird der überstehende Überstand verworfen und die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und 2 % FBS resuspendiert. Analysieren Sie die Proben per Durchflusszytometrie. Als Nächstes erfolgt zur Anreicherung ausgewählter Teilpopulationen hämatopoetischer Zellen eine magnetische Anreicherung des Knochenmarks, um c-Kit-positive Zellen anzureichern. Resuspendieren Sie die Zellprobe des aus mindestens 10 Mäusen gewonnenen Knochenmarks in einem Milliliter Pufferlösung, die monoklonalen C-Kit-Antikörper, konjugiert mit PC, im Verdünnungsverhältnis 1:50 enthält.

Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 40 Milliliter Pufferlösung. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter Anti-A-PC-Mikroperlen pro Maus direkt zum Pellet hinzu. Gründlich mischen und 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen wie zuvor waschen und zentrifugieren. Suspendieren Sie das Zellpellet anschließend in vier Milliliter Pufferlösung. Für je drei Mäuse max-LS-Säulen in das Magnetfeld eines geeigneten max-Separators stellen.

Bereiten Sie die Säulen vor, indem Sie sie mit vier Litern Pufferlösung spülen. Anschließend geben Sie die Zellsuspension auf und sammeln die nicht markierten Zellen, die durchlaufen, in einem Sammelröhrchen. Waschen Sie die Säule dreimal mit je einem Liter Pufferlösung.

Wenn der Puffer im Säulenreservoir verbraucht ist, neuen Puffer hinzufügen. Sobald die gesamte Lösung durchgelaufen ist, entsorgen Sie den Durchlauf. Entfernen Sie die Säulen vom Trennmagneten und stellen Sie jede Säule auf ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Pipettieren Sie vier Milliliter Pufferlösung auf jede Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen unverzüglich aus, indem Sie den Kolben in die Säule hineindrücken.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit 500 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Resuspendieren Sie jedes Pellet mit einem Milliliter Pufferlösung und sammeln Sie die Pellets in einem einzigen 15-Milliliter-Konischglas.

Nachdem die Population der positiven Zellen für Sea-Kit angereichert wurde, färben und sortieren Sie die Zellen mittels FACS. Hämatopoetische Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen aus einer Knochenmarkssuspension, die für Sea-Kit-positive Zellen angereichert wurde, unter Verwendung magnetischer Kügelchen, und LT-HSCs sowie THSCs wurden entsprechend der Expression von Oberflächenmolekülen sortiert, wie in diesem Video beschrieben. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die elektronische Torgate-Prozedur zur Bestimmung gemeinsamer lymphoider Vorläuferzellen als Linin.

Beobachten Sie die geringe Anzahl an Interleukin-7R-positiven Zellen. Lin-negativ, CD34-positiv, SCAR1-positiv und Lin-negativ, c-Kit-positiv, SCAR1. Zellen mit geringer Expression aus dem c-Kit-positiven Gate.

Die gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen werden als FC gamma R.low CD34-positive Zellen identifiziert. Ebenso werden aus dem C-kit-positiven Gait-Granulozyten-Monozyten-Vorläufer die FC gamma-high-CD34-positiven Zellen und die Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer als FC gamma-low-CD34-negative Zellen identifiziert. Aus dem LKS (Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺) werden die L-T-H-S-C und S-T-H-S-C als CD34-negative bzw. CD34-positive Zellen identifiziert. So erhält man zwei angereicherte und hochgereinigte Populationen, die physiologisch in geringer Zahl vorkommen, um die Auswirkungen von Autoimmunität auf die Hämatopoese von HSCs aus Kontrollmäusen und Mäusen mit entzündlicher Darmerkrankung zu untersuchen.

Wurden mit KI-67-Antikörper und DPI angefärbt, wie hier zu sehen ist. Proliferierende Zellen sind im LKS-CD34-negativen Kompartiment hämatopoetischer Stammzellen gesunder Kontrollen kaum oder gar nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ist derselbe Zellteil bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) signifikant erhöht, und eine beträchtliche Anzahl hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) befindet sich in den Phasen S und G2/M des Zellzyklus.

Dies legt nahe, dass eine T-Zell-vermittelte chronische Entzündung den Eintritt von HSCs in den Zellzyklus bestimmt. Um das Vorhandensein von in Vesikeln gespeichertem ATP zu überprüfen, wurden CD34-negative Zellen aus gesunden Mäusen mit der nukleotidbindenden Verbindung Chinin und Kernrot gefärbt, und die Analyse mittels konfokaler Live-Cell-Mikroskopie zeigt, dass in HSCs, jedoch nicht in GMPs, chininpositive Vesikel im Zytoplasma sichtbar sind, um zu bestimmen, ob HSCs auf extrazelluläres ATP ansprechen. Die Kalziumantwort sortierter hämatopoetischer Stammzellen, die mit 4 0 2 beladen und mit ATP sowie Ionomycin stimuliert wurden, wurde wie hier dargestellt analysiert. Einzelzell-Kalziumanstiegsverläufe zeigen, dass eine Erhöhung des zytosolischen Kalziums in LT-HSCs durch die Aktivierung reiner anergischer P2-Rezeptoren erfolgte.

Bei Exposition gegenüber einem TP, da zytoplasmatische Kalziumerhöhungen die Freisetzung vesikulären ATPs induzieren. Dieses Experiment legt nahe, dass ein TP möglicherweise seine eigene Freisetzung aus HSCs regulieren kann, und zeigt, dass dieses Verfahren für funktionelle Studien an HSCs verwendet werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuronale Stammzellen und linienbestimmte Vorläuferzellen für funktionelle Assays isoliert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Rekonstitution nicht myeloablatierter Empfängermäuse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zum Rekonstitutionspotenzial hämatopoetischer Stammzellen, die aus einem C-Zustand oder einer entzündlichen Umgebung gewonnen wurden.