Name: Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Knochenmark durch magnetische c-Kit+-Anreicherung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht schnelle, hochreine Zellgewinnung für funktionelle Studien.

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Wir danken Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa und Markus Manz für wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds, Krebsliga Schweiz und Tessiner Fondazione per la ricerca sul Cancro finanziert.

1. Vorbereitung der Zellsuspension aus dem Knochenmark <ol><li> Euthanize die Maus und platzieren Sie das Tier in einer Pfanne Edelstahl und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Rücken. Sammeln Sie Oberschenkel und Schienbein von Hinterbeinen und Wirbelsäule. </li><li> Exakt entfernen Sie alle Rückstände aus der Weichteile der Wirbelsäule mit einer scharfen Spitze Schere und Beine aus Knochen mit einer Gaze. Shop Knochen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 30 ml RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), mit 50 uM β-Mercaptoethanol, 100 pM MEM nicht-essentielle Aminosäuren ergänzt, 1 mM MEM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin. </li><li> Bedecken Sie den Boden einer zuvor sterilisierten Mörser mit Sterilfilter. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer Schicht von Filtern, um eine Reibungsfläche zu montieren. </li><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Falcon-Röhrchen mit einem Falcon-Filter zur Verfügung gestellt. </li><li> Smash die Knochenmit Hilfe eines Stößels, bis eine homogene Zellsuspension. </li><li> Die Suspension in das Rohr. </li><li> Fügen Sie dem Mörtel 5 ml frisches RPMI Vollmedium zu waschen und zu ernten, die übrigen Zellen. </li><li> Wiederholen Sie die letzten beiden Punkte, bis die Knochen homogenisierte klar erscheinen. </li><li> Übertragen und Filtern in ein neues Röhrchen der Zellsuspension, um die verbleibende Gewebe Ablagerungen zu beseitigen. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, nicht auf das Zellpellet zu stören. </li></ol> 2. Phänotypische Analyse <ol><li> Resuspendieren und waschen Sie die Zellen der einzelnen Mäuse in 15 ml PBS und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 5 ml PBS und 2% FBS und Zählen von Zellen. </li><li> Transfer 1 × 10 6 Zellen / Well in einer 96 Vertiefungen mit rundem BodenPlatte. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit konjugiert APC 1:100 </li><li> SCA1 an Biotin konjugiert 1.50 </li><li> CD34 konjugiert mit FITC 01.50 </li><li> FcyR konjugiert mit PE 1:100 </li><li> IL-7R, konjugiert an PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li> Überstand verwerfen und 50 ul von mAk-Mix in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zellen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen durch Umdrehen der Platte. </li><li> Verdünnte Streptavidin in PBS und 2% FBS wie angegeben, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> Streptavidin konjugiertegated zu APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Dann werden 50 ul der Lösung in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Erwerben Proben bei FACS. </li></ol> 3. Magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen <ol><li> Planen einer Pufferlösung mit PBS, pH 7,2, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. </li><li> Das Zellpellet mit Knochen Zucchini aus mindestens 10 Mäusen in 1 ml Pufferlösung, die c-Kit-mAb, konjugiert an APC abgeleitet 1:50 verdünnt. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit 40 ml Pufferlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig ter Überstände durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören. </li><li> Zellpellet resuspendieren und 50 ul Anti-APC MicroBeads für jeden eingeschläfert Maus direkt an den Pellets. </li><li> Gut mischen und inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 40 ml Pufferlösung und Zentrifuge bei 1.500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Vielfachen von 4 ml Pufferlösung alle drei Mäusen eingeschläfert werden. </li><li> Platz MACS LS Spalten in dem Magnetfeld eines geeigneten MACS Separator. Verwenden Sie 1 Spalte alle drei Mäuse eingeschläfert werden. </li><li> Planen Spalten durch Spülen mit 4 ml Pufferlösung. </li><li> Anwenden Zellsuspension auf die Säulen. </li><li> Sammle unmarkierten Zellen, die hindurchgehen und Waschkolonne mit 4 ml Pufferlösung. Führen Waschschritte durch Zugabe von 4 ml Pufferlösung dreimal. Fügen Sie neue Puffer, wenn die Spalte Reservoir geleert wird. </li><li> Entfernen von Spalten aus dem Abscheider und place jeweils eine auf der 15-ml-Falcon-Tubes. </li><li> Pipette 4 ml Puffer-Lösung auf jede Spalte. Unmittelbar spülen die magnetisch markierte Zellen, indem Sie den Kolben in die Spalte. </li><li> Die Röhrchen bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. </li><li> Resuspendieren jedes Pellet mit 1 ml Pufferlösung und Pellets Gruppe in einem einzigen 15 ml Falcon Röhrchen. </li></ol> 4. Sortieren von hämatopoetischen Stammzellen und Lineage festgelegte Vorläuferzellen <ol><li> Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit konjugiert APC 1:100 </li><li> Sca-1 an Biotin konjugiert 1.50 </li><li> CD34 konjugiert mit FITC 01.50 </li><li> FcyR konjugiert mit PE 1:100 </li></ul></li><li> Das Röhrchen aus dem früs Abschnitt bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. </li><li> Fügen Sie die mAbs Mischung zum Pellet. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit PBS 14mL und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Verdünnte Streptavidin, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> Streptavidin konjugiert mit APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Fügen Sie die Lösung in das Röhrchen. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit 14 ml PBS und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 500 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Übertragen und Filtern der Zellsuspension in einem neuen 5 ml Tube, um Eliminate zelluläre Aggregate, die mit der Sortier-Verfahren stören können. </li><li> 5 l der 7-AAD (verwenden Sie es verdünnt 1:100) zur Zellsuspension, um 7-AAD + toten Zellen aus den sortierten Populationen auszuschließen. </li><li> Sortieren Zellen mit einem BD FACSAria nach folgenden Phänotypen: <ul type="disc"><li> LKS-Zellen: LIN - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HSK: LKS CD34 - </li><li> ST-HSK: LKS CD34 + </li><li> GVP: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR hohe CD34 + </li><li> Abgeordneten: lin - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 - </li><li> CMPs: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 + </li></ul></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt ein Beispiel des elektronischen Gating Verfahren zuPunktzahl gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLP) als Lin - / c-Kit lo / Interleukin (IL)-7R + Zellen; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) und Lin - / c-Kit + / SCA -1 lo (c-Kit +)-Zellen, aus dem c-Kit + Tor, sind gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs) als FcyR lo CD34 +-Zellen, Granulozyten / Monozyten-Vorläuferzellen (GVP) als FcyR Hallo CD34 +-Zellen und Megakaryozyten / identifiziert Erythrozyten-Vorläuferzellen (MdEP) als FcyR lo CD34 - Zellen; von der LKS-Tor, LT-und ST-HSC HSC werden als CD34 identifiziert - und CD34 +-Zellen. Das Knochenmark Zellsuspension kann für c-Kit +-Zellen mit magnetischen Beads (Abb. 2) angereichert werden, LT-und ST-HSC HSC kann dann nach CD34 Expression sowie andere Vorläuferzellen nach der oben beschriebenen Phänotyp sortiert werden. HSK können ana sein<html> lysiert im Live-Imaging-konfokale Mikroskopie, wie in Abbildung 4, wo CD34 gezeigt - Zellen mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin 11 sowie nukleare rot (DRAQ5) gefärbt wurden. In HSCs, aber nicht GVP sind Quinacrin-positive Vesikel im Zytoplasma sichtbar 12. Darüber hinaus können sortiert HSK in verschiedene Experimente verwendet werden, wie in 5, die den Anstieg der zytosolischen Ca 2 + in LT-HSC durch Aktivierung von purinergen P2-Rezeptoren bei Belichtung zeigt gezeigt, Adenosin-Triphosphat (ATP) und Ionomycin 12. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vertreter Dot-Plot Analyse von LIN-BM-Zellen. Elektronische Gating Verfahren auf Durchflusszytometer zu ermitteln und ein Tor hämatopoetischen Vorläuferzellen und HSK aus Knochenmark Zellsuspension gefärbt, wie im Protokoll Text beschrieben. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Eine Regelung zur selektiven Anreicherung von c-Kit +-Zellen aus dem Knochenmark. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Abbildung 3 Zellzyklus-Analyse von elektronisch gesteuerten LKS CD34 -. Blutstammzellen bei gesunden Kontrollen und Mäuse, die mit IBD mit Ki-67 Antikörper und DAPI gefärbt. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert mit Lyse / Fix und Perm Puffer durch Färbung mit FITC-konjugierten Ki-67 und DAPI bei 1 ug / ml gefolgt. Radfahren Zellen sind kaum, wenn überhaupt nachweisbar in der LKS-CD34 - HSC Fach von gesunden Kontrollen 12. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Abbildung 4 Live-Imaging-konfokale Mikroskopie von FACS sortierten CD34 - HSC und GVP mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin und nukleare rot (DRAQ5) gefärbt. Die kleinen Quadranten zeigen Quinacrin POSitive Vesikel im Zytoplasma von HSK erkannt, aber nicht GVP. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Abbildung 5. Cytosolischen Ca 2 + Erhöhungen der HSZ sortiert mit Fura-2 beladen und stimuliert mit ATP und Ionomycin. Spuren von einzelnen Zellen gezeigt werden. Alle Zellen waren als Reaktion auf extrazelluläres ATP zeigt prominente Anstieg der cytosolischen Ca 2 + nach Zugabe von ATP.

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Analyse der Hämatopoese in einzelnen Mäusen (Abbildung 1). Diese Analyse in verschiedenen experimentellen Einstellungen, einschließlich Mausmodell von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienz, degenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs, ermöglicht der Bewältigung der Folgen von pathologischen Zuständen, auf die Hämatopoese. Abbildung 3 zeigt die Analyse der Zellzyklus-Aktivität auf elektronisch ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Zellsieb 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Färbelösung </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix-Puffer </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm Puffer III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBiosciENCE </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcyR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS Columns </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phänotypische analyse und isolierung von murinen hämatopoetischen stammzellen und lineage-festgelegte vorläuferzellen

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Das Knochenmark ist der wichtigste Ort, wo HSCs und reifer Blutzellen Abstammung Vorfahren wohnen und differenzieren in einem erwachsenen Organismus. Blutstammzellen bilden eine Minute Zellpopulation von pluripotenten Zellen zu erzeugen vermag alle Blutzelllinien für ein Leben-Zeit ein. Die molekulare Aufklärung von HSK-Homöostase im Knochenmark hat wichtige Auswirkungen in der Hämatopoese, der Onkologie und der regenerativen Medizin. Wir beschreiben die Kennzeichnung Protokoll mit fluoreszierenden Antikörpern und dem elektronischen Gating Verfahren in der Durchflusszytometrie auf hämatopoetischen Vorläuferzellen Teilmengen und HSCs Verteilung in einzelnen Mäusen (Abb. 1) punkten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um ausgiebig zu bereichern hämatopoetischen Vorläuferzellen als auch langfristige (LT) und kurzfristige (ST) Rekonstituieren Blutstammzellen aus dem Knochenmark gepoolten Zellsuspensionen von magnetischen Anreicherung von Zellen, die c-Kit. Die resultierende Zelle Herstellung verwendet werden, um ausgewählte Teilmengen für die in vitro zu sortieren undIn-vivo-funktionelle Untersuchungen (Abb. 2). Beide trabekulären Osteoblasten 2,3 und sinusförmige Endothel 4 bilden funktionale Nischen Unterstützung von Blutstammzellen im Knochenmark. Mehrere Mechanismen in der osteoblastischen Nische, einschließlich einer Teilmenge von N-Cadherin + Osteoblasten 3 und Wechselwirkung des Tie2-Rezeptor-Tyrosinkinase im HSK mit seinem Liganden Angiopoietin-1 5, ausgedrückt stimmen bei der Bestimmung HSK Ruhe. &quot;Ruhezustand&quot; im Knochenmark ist entscheidend für die HSK von der Replikation und eventuelle Erschöpfung bei übermäßiger Aktivität Radfahren 6 zu schützen. Exogene Stimuli, die auf Zellen des angeborenen Immunsystems, wie Toll-like-Rezeptor-Liganden 7 und Interferon-α 6 kann auch induzieren Proliferation und Differenzierung von Blutstammzellen in Linie festgelegte Vorläuferzellen. Kürzlich wurde eine Population von schlafenden Blutstammzellen in der Maus lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - Population wurde bisher 8 beschrieben. Sortieren von Zellen auf CD34-Expression aus der hämatopoetischen Vorläuferzellen angereicherten Zellsuspension, wie hier beschrieben Basis ermöglicht die Isolierung von sowohl ruhende selbst erneuernden LT-HSK und ST-HSK 9. Ein ähnliches Verfahren auf Erschöpfung der Linie positive Zellen und Sortierung von LT-HSC mit CD48-Antikörpern und flk2 Basis wurde bereits 10 beschrieben. Im vorliegenden Bericht stellen wir ein Protokoll für die phänotypische Charakterisierung und Ex-vivo-Zellzyklus-Analyse von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die nützlich für die Überwachung der Hämatopoese in verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen kann. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren FACS-Sortierung für HSK, die verwendet werden, um Faktoren und Mechanismen, die ihre Selbst-Erneuerung, Erweiterung und Differenzierung in der Zellbiologie und Signaltransduktion Assays sowie für die Transplantation definiert werden können.

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Das Knochenmark ist der Hauptort, an dem hämatopoetische Stammzellen (HSC) und reifere Vorläuferzellen der Blutzelllinien in einem adulten Organismus residieren und differenzieren. HSC ...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung hämatopoetischer Vorläuferzellen mittels magnetischer Bead-basierter Trennung und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Zunächst werden das Hinterbein, der Femur, die Tibia und das Rückenmark von einer Maus präpariert und homogenisiert, um eine Knochenmarkzell-Suspension zu erzeugen. Anschließend wird die Zellpopulation angereichert für Zellen, die C kit exprimieren, unter Verwendung magnetischer Mikroperlen-Fluss.Die zytometrische Analyse der angereicherten Population zeigt, dass diese Methode hochreine hämatopoetische Zelllinien, Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen liefert, die anschließend für funktionelle Untersuchungen in vitro und in vivo verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Ausspülen aus Knochen besteht darin, dass sie eine effizientere und schnellere Gewinnung von Knochenmarkzellen ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienzen, degenerativen Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs-Immunmodellen, da sie die phänotypische Charakterisierung und die funktionelle Analyse hämatopoetischer Vorläuferzellen ex vivo erlaubt.Daher kann diese Methode Einblicke in die Überwachung der Hämatopoese unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen bieten. Sie kann außerdem verwendet werden, um die zellbiologische Signalübertragung und die entwicklungsregulierte Genexpression in unterschiedlichen Vorläufer-Teilpopulationen zu untersuchen. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus in eine Edelstahlschale zu legen.Sprühen Sie den Bauch und den Rücken mit 70 % Ethanol ein, um die Knochen zu sammeln, die als Zellquelle verwendet werden. Verwenden Sie eine Schere, um mit Hilfe einer Pinzette an den Hinterbeinen zwei kleine Öffnungen in die Haut zu schneiden, lösen Sie den Femur aus der Gelenkpfanne und drehen Sie dann die Maus auf den Kopf, um die Haut längs zu schneiden. Um die Wirbelsäule freizulegen, entfernen Sie die Wirbelsäule.Dann mit einer Schere mit scharfer Spitze vorsichtig alle Weichgewebsreste von der Wirbelsäule entfernen. Mit Mull das Weichgewebsrest vom Femur und Tibia entfernen.Legen Sie die Knochen anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das 30 Milliliter ergänztes RPMI-Medium enthält. Geben Sie mehrere vierfünftel sterile Filter in einen sterilen Mörser. Überführen Sie die Knochen dann mit einer Pinzette in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer weiteren Filterschicht, um eine Reibfläche zu erzeugen.Als Nächstes einen 40-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischgefäß geben. Anschließend die Knochen mit einem Pistill zerstoßen, bis eine homogene Zellsuspension erhalten ist. Die Suspension dann mit einer Pipette in den Zellfilter überführen.Fügen Sie anschließend fünf Milliliter frisches, supplementiertes RPMI in den Mörser ein, um die verbleibenden Zellen abzuwaschen und durch Pipettieren auf und ab zu gewinnen. Geben Sie dann das RPMI in das Röhrchen mit dem Filter. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis die homogenisierten Knochen klar erscheinen.Wenn die Lösung einmal durch den Filter gegangen ist, überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und filtrieren Sie erneut, um das verbleibende Gewebefragmente zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Phänotypen hämatopoetischer Vorläuferzellen zu charakterisieren. Beginnen Sie damit, das Zellpräparat jeder Maus in 15 Milliliter PBS mit 2 % FBS erneut in Suspension zu bringen. Zentrifugieren Sie dann das Gefäß bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.Stören Sie das Pellet nicht. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS mit 2 % FBS und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Sobald die Zellkonzentration bestimmt wurde, überführen Sie je eine Million der sechs Zellen in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte.Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 500 × g für fünf Minuten. Während des Zentrifugierens bereiten Sie eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern vor, die gegen die hier aufgeführten Oberflächenmarker in PBS mit 2 % FBS gerichtet sind, um die Zellen zu färben. Sobald der Zentrifugierlauf beendet ist, entsorgen Sie das Überstandsvolumen, indem Sie die Platte umdrehen, und geben Sie 50 µL der Antikörpermischung in jedes Loch.Dann mit einem Mehrkanalpipettierer mehrmals auf- und abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellen 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit 150 Mikroliter PBS und 2 % FBS waschen. Anschließend die Platte fünf Minuten bei 500 × g zentrifugieren.Danach die Senna verwerfen, indem die Platte umgedreht wird. Anschließend 50 Mikroliter verdünntes 1:300 AP-three-size-sieben-Streptavidin in PBS mit 2 % FBS in jedes Loch geben und durch Pipettieren in eine Einzelzell-Suspension dissoziieren. Die Zellen 10 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren; nach der Inkubation fortfahren.Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 Mikrolitern PBS und 2 % FBS. Nach dem Zentrifugieren der Platte wird der überstehende Überstand verworfen und die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und 2 % FBS resuspendiert. Analysieren Sie die Proben per Durchflusszytometrie. Als Nächstes erfolgt zur Anreicherung ausgewählter Teilpopulationen hämatopoetischer Zellen eine magnetische Anreicherung des Knochenmarks, um c-Kit-positive Zellen anzureichern. Resuspendieren Sie das Zellpräparat aus Knochenmark, das aus mindestens 10 Mäusen gewonnen wurde, in einem Milliliter Pufferlösung, die monoklonalen C-Kit-Antikörper, konjugiert mit PC, im Verdünnungsverhältnis 1:50 enthält.Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 40 Milliliter Pufferlösung. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.Fügen Sie dann 50 Mikroliter Anti-A-PC-Mikroperlen pro Maus direkt zum Pellet hinzu. Gründlich mischen und 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen wie zuvor waschen und zentrifugieren. Suspendieren Sie das Zellpellet anschließend in vier Milliliter Pufferlösung. Für je drei Mäuse max-LS-Säulen in das Magnetfeld eines geeigneten max-Separators stellen.Bereiten Sie die Säulen vor, indem Sie diese mit vier Litern Pufferlösung spülen. Anschließend wird die Zellsuspension aufgetragen und die nicht markierten Zellen, die durchlaufen, in einem Sammelröhrchen gesammelt. Spülen Sie die Säule dreimal mit je einem Liter Pufferlösung.Wenn der Pufferbehälter der Säule leer ist, neuen Puffer hinzufügen. Sobald die gesamte Lösung durchgelaufen ist, entsorgen Sie den Durchlauf. Entfernen Sie die Säulen vom Trennmagneten und stellen Sie jede Säule auf ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Pipettieren Sie vier Milliliter Pufferlösung auf jede Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben in die Säule hineindrücken.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Resuspendieren Sie jedes Pellet mit einem Milliliter Pufferlösung und sammeln Sie die Pellets in einem einzigen 15-Milliliter-Konischglas.Nachdem die Population der positiven Zellen für Sea-Kit angereichert wurde, färben und sortieren Sie die Zellen mittels FACS. Hämatopoetische Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen aus einer Knochenmarkssuspension, die für sea-kit-positive Zellen angereichert wurde, unter Verwendung magnetischer Kügelchen, und LT-HSCs sowie THSCs wurden entsprechend der Expression von Oberflächenmolekülen sortiert, wie in diesem Video beschrieben. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel des elektronischen Gating-Verfahrens zur Bestimmung gemeinsamer lymphoider Vorläuferzellen als Lin⁻.Sehen Sie niedrige Interleukin-sieben-R-positive Zellen. Lin-negativ, SEE-Kit-positiv, Scar-1-positiv und Lin-negativ, SEE-Kit-positiv, Scar-1-niedrig. Zellen aus dem SEE-Kit-positiven Gatter.Die gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen werden als FC gamma R.low CD34-positive Zellen identifiziert. Ebenso werden aus dem C-kit-positiven Gating die Granulozyten-Monozyten-Vorläufer als FC gamma hoch CD34-positive Zellen und die Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer als FC gamma niedrig CD34-negative Zellen identifiziert. LKS+ (Lin⁻K⁺Sca-1⁺) und L-T-H-S-C sowie S-T-H-S-C werden als CD34-negative bzw. CD34-positive Zellen definiert. So erhält man zwei angereicherte und hochreine Populationen, die physiologisch in geringer Zahl vorkommen, um die Auswirkung von Autoimmunität auf die Hämatopoese von HSCs aus Kontrolltieren und Mäusen mit entzündlicher Darmerkrankung zu untersuchen.Wurden mit KI-67-Antikörper und DPI gefärbt, wie hier zu sehen ist. Proliferierende Zellen sind im LKS-CD34-negativen Kompartiment hämatopoetischer Stammzellen gesunder Kontrollen kaum oder gar nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ist derselbe Zellteil bei entzündlichen Darmerkrankungen signifikant erhöht, und eine beträchtliche Anzahl hämatopoetischer Stammzellen befindet sich in den Phasen S und G2/M des Zellzyklus.Dies legt nahe, dass eine T-Zell-vermittelte chronische Entzündung den Eintritt von HSCs in den Zellzyklus bestimmt. Um das Vorhandensein von in Vesikeln gespeichertem ATP zu überprüfen, wurden CD34-negative Zellen von gesunden Mäusen mit der nukleotidbindenden Verbindung Chinin und Kernrot gefärbt, und die Analyse mittels konfokaler Mikroskopie an lebenden Zellen ergab, dass in HSCs, jedoch nicht in GMPs, chininpositive Vesikel im Zytoplasma sichtbar sind, um zu bestimmen, ob HSCs auf extrazelluläres ATP ansprechen. Die Kalziumantwort sortierter hämatopoetischer Stammzellen, die mit 4 0 2 beladen und mit ATP sowie Ionomycin stimuliert wurden, wurde wie hier gezeigt analysiert. Einzelzell-Kalziumanstiegsverläufe zeigen, dass eine Erhöhung des zytosolischen Kalziums in LT-HSCs durch Aktivierung reiner anergischer P2-Rezeptoren erfolgte.Bei Exposition gegenüber einem TP, da zytoplasmatische Kalziumerhöhungen die Freisetzung vesikulären ATPs induzieren. Dieses Experiment legt nahe, dass ein TP möglicherweise seine eigene Freisetzung aus HSCs regulieren kann, und zeigt, dass dieses Verfahren für funktionelle Studien an HSCs verwendet werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuronale Stammzellen und linienbestimmte Vorläuferzellen für funktionelle Assays isoliert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Rekonstitution nicht myeloablatierter Empfängermäuse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise das Rekonstitutionspotenzial hämatopoetischer Stammzellen, die aus einem C-Zustand oder einer entzündlichen Umgebung gewonnen wurden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Lernen Sie die Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Knochenmark durch magnetische c-Kit+-Anreicherung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht schnelle, hochreine Zellgewinnung für funktionelle Studien.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

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