Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung hämatopoetischer Vorläuferzellen mittels magnetischer Bead-basierter Trennung und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Zunächst werden das Hinterbein, der Femur, die Tibia und das Rückenmark von einer Maus präpariert und homogenisiert, um eine Knochenmarkzell-Suspension zu erzeugen. Anschließend wird die Zellpopulation angereichert für Zellen, die C kit exprimieren, unter Verwendung magnetischer Mikroperlen-Fluss.

Die zytometrische Analyse der angereicherten Population zeigt, dass diese Methode hochreine hämatopoetische Zelllinien, Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen liefert, die anschließend für funktionelle Untersuchungen in vitro und in vivo verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Ausspülen aus Knochen besteht darin, dass sie eine effizientere und schnellere Gewinnung von Knochenmarkzellen ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienzen, degenerativen Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs-Immunmodellen, da sie die phänotypische Charakterisierung und die funktionelle Analyse hämatopoetischer Vorläuferzellen ex vivo erlaubt.

Daher kann diese Methode Einblicke in die Überwachung der Hämatopoese unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen bieten. Sie kann außerdem verwendet werden, um die zellbiologische Signalübertragung und die entwicklungsregulierte Genexpression in unterschiedlichen Vorläufer-Teilpopulationen zu untersuchen. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus in eine Edelstahlschale zu legen.

Sprühen Sie den Bauch und den Rücken mit 70 % Ethanol ein, um die Knochen zu sammeln, die als Zellquelle verwendet werden. Verwenden Sie eine Schere, um mit Hilfe einer Pinzette an den Hinterbeinen zwei kleine Öffnungen in die Haut zu schneiden, lösen Sie den Femur aus der Gelenkpfanne und drehen Sie dann die Maus auf den Kopf, um die Haut längs zu schneiden. Um die Wirbelsäule freizulegen, entfernen Sie die Wirbelsäule.

Dann mit einer Schere mit scharfer Spitze vorsichtig alle Weichgewebsreste von der Wirbelsäule entfernen. Mit Mull das Weichgewebsrest vom Femur und Tibia entfernen.

Legen Sie die Knochen anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das 30 Milliliter ergänztes RPMI-Medium enthält. Geben Sie mehrere vierfünftel sterile Filter in einen sterilen Mörser. Überführen Sie die Knochen dann mit einer Pinzette in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer weiteren Filterschicht, um eine Reibfläche zu erzeugen.

Als Nächstes einen 40-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischgefäß geben. Anschließend die Knochen mit einem Pistill zerstoßen, bis eine homogene Zellsuspension erhalten ist. Die Suspension dann mit einer Pipette in den Zellfilter überführen.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter frisches, supplementiertes RPMI in den Mörser ein, um die verbleibenden Zellen abzuwaschen und durch Pipettieren auf und ab zu gewinnen. Geben Sie dann das RPMI in das Röhrchen mit dem Filter. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis die homogenisierten Knochen klar erscheinen.

Wenn die Lösung einmal durch den Filter gegangen ist, überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und filtrieren Sie erneut, um das verbleibende Gewebefragmente zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Phänotypen hämatopoetischer Vorläuferzellen zu charakterisieren. Beginnen Sie damit, das Zellpräparat jeder Maus in 15 Milliliter PBS mit 2 % FBS erneut in Suspension zu bringen. Zentrifugieren Sie dann das Gefäß bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.

Stören Sie das Pellet nicht. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS mit 2 % FBS und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Sobald die Zellkonzentration bestimmt wurde, überführen Sie je eine Million der sechs Zellen in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte.

Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 500 × g für fünf Minuten. Während des Zentrifugierens bereiten Sie eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern vor, die gegen die hier aufgeführten Oberflächenmarker in PBS mit 2 % FBS gerichtet sind, um die Zellen zu färben. Sobald der Zentrifugierlauf beendet ist, entsorgen Sie das Überstandsvolumen, indem Sie die Platte umdrehen, und geben Sie 50 µL der Antikörpermischung in jedes Loch.

Dann mit einem Mehrkanalpipettierer mehrmals auf- und abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellen 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit 150 Mikroliter PBS und 2 % FBS waschen. Anschließend die Platte fünf Minuten bei 500 × g zentrifugieren.

Danach die Senna verwerfen, indem die Platte umgedreht wird. Anschließend 50 Mikroliter verdünntes 1:300 AP-three-size-sieben-Streptavidin in PBS mit 2 % FBS in jedes Loch geben und durch Pipettieren in eine Einzelzell-Suspension dissoziieren. Die Zellen 10 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren; nach der Inkubation fortfahren.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 Mikrolitern PBS und 2 % FBS. Nach dem Zentrifugieren der Platte wird der überstehende Überstand verworfen und die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und 2 % FBS resuspendiert. Analysieren Sie die Proben per Durchflusszytometrie. Als Nächstes erfolgt zur Anreicherung ausgewählter Teilpopulationen hämatopoetischer Zellen eine magnetische Anreicherung des Knochenmarks, um c-Kit-positive Zellen anzureichern. Resuspendieren Sie das Zellpräparat aus Knochenmark, das aus mindestens 10 Mäusen gewonnen wurde, in einem Milliliter Pufferlösung, die monoklonalen C-Kit-Antikörper, konjugiert mit PC, im Verdünnungsverhältnis 1:50 enthält.

Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 40 Milliliter Pufferlösung. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter Anti-A-PC-Mikroperlen pro Maus direkt zum Pellet hinzu. Gründlich mischen und 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen wie zuvor waschen und zentrifugieren. Suspendieren Sie das Zellpellet anschließend in vier Milliliter Pufferlösung. Für je drei Mäuse max-LS-Säulen in das Magnetfeld eines geeigneten max-Separators stellen.

Bereiten Sie die Säulen vor, indem Sie diese mit vier Litern Pufferlösung spülen. Anschließend wird die Zellsuspension aufgetragen und die nicht markierten Zellen, die durchlaufen, in einem Sammelröhrchen gesammelt. Spülen Sie die Säule dreimal mit je einem Liter Pufferlösung.

Wenn der Pufferbehälter der Säule leer ist, neuen Puffer hinzufügen. Sobald die gesamte Lösung durchgelaufen ist, entsorgen Sie den Durchlauf. Entfernen Sie die Säulen vom Trennmagneten und stellen Sie jede Säule auf ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Pipettieren Sie vier Milliliter Pufferlösung auf jede Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben in die Säule hineindrücken.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Resuspendieren Sie jedes Pellet mit einem Milliliter Pufferlösung und sammeln Sie die Pellets in einem einzigen 15-Milliliter-Konischglas.

Nachdem die Population der positiven Zellen für Sea-Kit angereichert wurde, färben und sortieren Sie die Zellen mittels FACS. Hämatopoetische Vorläuferzellen und hämatopoetische Stammzellen aus einer Knochenmarkssuspension, die für sea-kit-positive Zellen angereichert wurde, unter Verwendung magnetischer Kügelchen, und LT-HSCs sowie THSCs wurden entsprechend der Expression von Oberflächenmolekülen sortiert, wie in diesem Video beschrieben. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel des elektronischen Gating-Verfahrens zur Bestimmung gemeinsamer lymphoider Vorläuferzellen als Lin⁻.

Sehen Sie niedrige Interleukin-sieben-R-positive Zellen. Lin-negativ, SEE-Kit-positiv, Scar-1-positiv und Lin-negativ, SEE-Kit-positiv, Scar-1-niedrig. Zellen aus dem SEE-Kit-positiven Gatter.

Die gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen werden als FC gamma R.low CD34-positive Zellen identifiziert. Ebenso werden aus dem C-kit-positiven Gating die Granulozyten-Monozyten-Vorläufer als FC gamma hoch CD34-positive Zellen und die Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer als FC gamma niedrig CD34-negative Zellen identifiziert. LKS+ (Lin⁻K⁺Sca-1⁺) und L-T-H-S-C sowie S-T-H-S-C werden als CD34-negative bzw. CD34-positive Zellen definiert. So erhält man zwei angereicherte und hochreine Populationen, die physiologisch in geringer Zahl vorkommen, um die Auswirkung von Autoimmunität auf die Hämatopoese von HSCs aus Kontrolltieren und Mäusen mit entzündlicher Darmerkrankung zu untersuchen.

Wurden mit KI-67-Antikörper und DPI gefärbt, wie hier zu sehen ist. Proliferierende Zellen sind im LKS-CD34-negativen Kompartiment hämatopoetischer Stammzellen gesunder Kontrollen kaum oder gar nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ist derselbe Zellteil bei entzündlichen Darmerkrankungen signifikant erhöht, und eine beträchtliche Anzahl hämatopoetischer Stammzellen befindet sich in den Phasen S und G2/M des Zellzyklus.

Dies legt nahe, dass eine T-Zell-vermittelte chronische Entzündung den Eintritt von HSCs in den Zellzyklus bestimmt. Um das Vorhandensein von in Vesikeln gespeichertem ATP zu überprüfen, wurden CD34-negative Zellen von gesunden Mäusen mit der nukleotidbindenden Verbindung Chinin und Kernrot gefärbt, und die Analyse mittels konfokaler Mikroskopie an lebenden Zellen ergab, dass in HSCs, jedoch nicht in GMPs, chininpositive Vesikel im Zytoplasma sichtbar sind, um zu bestimmen, ob HSCs auf extrazelluläres ATP ansprechen. Die Kalziumantwort sortierter hämatopoetischer Stammzellen, die mit 4 0 2 beladen und mit ATP sowie Ionomycin stimuliert wurden, wurde wie hier gezeigt analysiert. Einzelzell-Kalziumanstiegsverläufe zeigen, dass eine Erhöhung des zytosolischen Kalziums in LT-HSCs durch Aktivierung reiner anergischer P2-Rezeptoren erfolgte.

Bei Exposition gegenüber einem TP, da zytoplasmatische Kalziumerhöhungen die Freisetzung vesikulären ATPs induzieren. Dieses Experiment legt nahe, dass ein TP möglicherweise seine eigene Freisetzung aus HSCs regulieren kann, und zeigt, dass dieses Verfahren für funktionelle Studien an HSCs verwendet werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuronale Stammzellen und linienbestimmte Vorläuferzellen für funktionelle Assays isoliert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Rekonstitution nicht myeloablatierter Empfängermäuse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise das Rekonstitutionspotenzial hämatopoetischer Stammzellen, die aus einem C-Zustand oder einer entzündlichen Umgebung gewonnen wurden.