Name: Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Exozytose-Ereignisse in kultivierten hippocampalen Neuronen mit FRAP- und FLIP-Photobleaching-Techniken visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Membranprotein-Dynamiken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken dem Wellcome Trust und dem ERC für finanzielle Unterstützung. IMGG ist ein EMBO-Fellow. KLH ist ein BBSRC finanzierte Doktorand. Wir danken Philip Rubin und Patrick Tidball für technische und Zellkultur-Unterstützung und Dr. Andrew Doherty für die Wartung und Unterstützung bei den Mikroskopen.

1. Cell Culture, virale Transduktion, und Protein Expression <ol><li> Kultur mit hoher Dichte hippocampalen Neuronen aus embryonalen Tag 18 (E18) Rattenbabys auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser für 14-25 Tage in vitro (DIV). </li><li> 6-24 Std. vor der Live-Experimente, transduzieren Zellen mit verminderter Sindbis-Virus enthält, der das Membranprotein von Interesse, mit dem Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) markiert. </li><li> In den Pseudovirion-Medium direkt auf das Deckglas mit 1 ml konditioniertes Medium und wieder in den Inkubator. Der Titer und die Zeit für die Proteinexpression nach virale Transduktion wird abhängig von der Charge-Virus und sollte für jede Charge vor Beginn lebenden Zellen ermittelt werden. </li></ol> 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging <ol><li> Gerätesatz-up <ol><li> Übertragen Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer eines Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalen Mikroskop.Um Leistungsschwankungen während der Bilderzeugung zu minimieren, sicherzustellen, das Mikroskop eingeschaltet ist, mit 100% Laserleistung, für mindestens 20 Minuten vor der Bebilderung. </li><li> Unmittelbar, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmten (37 ° C) Aufnahme extrazellulären Lösung mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH eingestellt 7,4 mit NaOH) und platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Bühne (37 ° C) des Zeiss Axiovert. Stellen Sie sicher, die Osmolarität der extrazellulären Recording-Lösung, um innerhalb von 10 mOsM Ihrer Kulturmedium eingestellt. Keine wesentliche Verdampfung auftritt während der Zeitverlauf des Experiments, aber dieses CO 2-unabhängige Lösung für kurze Experimente (&lt;10 Stunden). Die Ergänzung mit 1-2 mM Natriumbicarbonat wird empfohlen. </li></ol></li><li> Die Definition der Parameter Image Capturing <ol><li> Zuerst ermitteln die ein Neuron die Expression des rekombinanten ProProtein von Interesse und bringen sie in den Fokus. </li><li> Mit einem 63X Öl widersprochen, erwerben Sie ein Bild der gesamten Zelle mit 488nm Laserlicht Anregung bei geringer Laserleistung. Zur Minimierung von Ausbleichen, verwenden Sie einen schnellen Nenndrehzahl (7-9) und geringen Pixel-Auflösung (512 bis 512) halten insgesamt Scan-Geschwindigkeit &lt;1 Sekunde. </li><li> Wählen Sie einen Teil der Dendriten zu Bild und Zoom, um einen Rahmen mit dem ROI (~ 1,5 bis 2,5 x optischen Zoom) zu erfassen. Wo möglich, sicherzustellen, das Gesichtsfeld enthält mehrere Prozesse, so dass Messungen von Referenz-Dendriten erhalten werden kann, um festzustellen, ob nicht-spezifische Photobleichen aus dem Erwerb auftritt. </li><li> Veränderung der Filter aus, Pinhole, Scan-Geschwindigkeit und-Verstärkung, um maximale Fluoreszenz von minimal Laseranregung aber mit begrenzter Sättigung ermöglichen. Ein großer Durchmesser der Blende wird empfohlen, um Photon Sammlung zu maximieren (2 &amp;mgr; m eignet sich für die Stacheln und ternären Dendriten). Der Detektor Gain sollte stark genug sein, um kleinen Schritten Fluoreszenz zu erkennen,derart, dass die allerersten Bilder, vor dem Ausbleichen nicht überwunden 10% aus gesättigten Pixel. </li><li> Speichern Sie diese Konfiguration, um für die Pre-/ Post-Bleich-und Erholungsphasen des Experiments genutzt werden. </li><li> Weiter definieren die Photobleichmittels Regionen; Auswahl eines ROI für die anfängliche Photobleichmittels und flankierenden Regionen für die nachfolgende Phase wiederholende Ausbleichen. Sicherstellen, dass die flankierenden Bereiche sind breit genug, um Recovery durch Diffusion zwischen den Scans (typischerweise 5 um, siehe Abb. 2) zu verhindern. </li><li> Passen Sie die Parameter sowohl für Bleich-ROIs Photobleichmittels. Die anfängliche schnelle Photobleichmittel sollte (0,1-0,5 s) zwischen 1-5 Iterationen erforderlich, abhängig von der optischen Zoom und das Volumen des ROI sein. Für den flankierenden Regionen, sollte die Laseranregung eingestellt, um kontinuierliche Ausbleichen der flankierenden Regionen zu gewährleisten, aber ohne phototoxische Schäden. </li><li> Als Anhaltspunkt gilt, verwenden wir 100% Laser-Anregung für die anfängliche Photobleichmittels, und 10% für die sich wiederholenden Photobleaching phase. </li></ol></li><li> Bildaufnahme <ol><li> Nachdem alle Parameter eingestellt sind, führen Sie die FRAP-FLIP-Experiment als Variable Zeitraffer-Bildfolge, in den 4 Blöcken im Folgenden erläutert: Block 1: 10.03 Vorbleiche Basis-Images, bei niedrigen Laserleistung, keine Zeitverzögerung Block 2: Photobleichmittel die zentrale ROI bei voller Laserleistung, 1-5 Iterationen Block 3: 10.03 Post-Bleiche Recovery Images Block 4: Repetitive Photobleichmittels der flankierenden Bereiche mit mittlerer Laserleistung mit der Aufnahme von Bildern in einer typischen Verzögerung von 1 - 5 Sekunden, abhängig von der Recovery Rate des Proteins untersucht. </li><li> Schließlich ersetzen die extrazelluläre Recording-Lösung mit Recording-Lösung bei pH 6 mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM MES (zu löschen Fluoreszenz) oder ergänzt mit 50 mM gepufferten NH4Cl mit 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mMMgCl 2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (um die Proteine ​​im niedrigen pH-Wert intrazellulären Speichern verraten), (siehe Abb. 2). </li><li> Sammeln von mindestens 10 bis 20 Datensätze für jede rekombinanten Proteins, die statistische Analyse zu ermöglichen. Um Voreingenommenheit Ergebnisse zu vermeiden, achten Imaging Bedingungen eingehalten werden konsistent repliziert. Entsorgen Sie Datensätze in denen eine unvollständige Bleichen, signifikante Brennebene Drift oder phototoxische Zellschädigung beobachtet werden. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ-Software. </li><li> Richten Sie die Stapel auf Rechnung für kleine Schwankungen in der xy-Ebene, die im gesamten Zeitserie im Stackreg Plugin (Plugins → stackreg → Transformation aufgetreten sein könnten: starrer Körper → <ok> ). </ok></li><li> Für Bilder auf konfokalen Zeiss genommen, verwenden Sie die LSM-Toolbox-Plugin, um die Zeitwerte als Textdatei (Plugins → LSM-Toolbox → Show LSM-Toolbox Bericht → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),und importieren Sie diese Werte in einer Analyse Tabellenkalkulation. </apply></apply></li><li> Um die Schwankungen bei der Fluoreszenz-FRAP-FLIP-Experiment zu messen, teilen die photogebleicht Segment in einzelne Pixel-Bereiche (~ 20pixels) und messen die mittlere Fluoreszenz von dieser ROIs zu jedem Zeitpunkt (F). Um schnell diese Werte zu erhalten, wählen Sie mehrere ROIs mit der ImageJ &quot;ROI-Manager&quot;-Analyse-Tool (Analyze → Extras → ROI-Manager) und melden Sie den mittleren Fluoreszenz pro Pixel unter Verwendung des &#39;Plot Z-Achse Profil &quot;-Befehl (Bild → Stapel → Plot Z Profil-Achse). </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Intensität der Fluoreszenz aus einem Hintergrund, nicht fluoreszierende Region zu messen. </li><li> Normalisieren der Fluoreszenzintensität zu jedem Zeitpunkt durch Subtrahieren die Hintergrundwerte der experimentellen Rauschen zu entfernen, und teilen alle Werte durch den Mittelwert vorgebleicht Baseline-Messung. </li><li> Messen der Fluoreszenzintensität der benachbarten nicht-photogebleicht Dendriten, die Höhe der nicht-spezifischen BeurteilungAusbleichen während der Akquisition. Korrektur für unspezifische Ausbleichen ist für die Interpretation von &#39;FRAP-Flip&#39; Daten entmutigen und sollte möglichst vermieden werden. </li><li> Um zu berechnen, wenn deutliche Erholung hat Platz in einer ROI genommen, subtrahieren Sie den Mittelwert der letzten 5-10 Maßnahmen der Sequenz aus dem Mittelwert der ersten 5-10 Maßnahmen (AF) und bestimmen die statistische Signifikanz. Kategorisieren Sie die Wiederherstellung und Rückgewinnung von Nicht-ROIs um das Muster der Exozytose (dh Exozytose Hotspots oder Wirbelsäule vs Welle Verwertung) zu beurteilen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Das Ergebnis der typischen FRAP-FLIP-Experiment wird in Abb. 2. Hier wurde eine Expression des Neurons GluA2 Untereinheit von AMPA-Typ Glutamat-Rezeptor, mit SEP markiert selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Abb. 2.A zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, und gibt die ROIs, die für Ausbleichen (White-Box-Regionen) ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. Abb. 2.B, zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments. In diesem Beispiel wurde eine Minute Erholungszeit nach der ersten Photobleichmittel aufgezeichnet, damit rohen Rezeptoren, den ROI durch laterale Diffusion in Kraft. Wenn die flankierenden Regionen gebleicht werden, wird das Fluoreszenzsignal von dieser hoch beweglichen Teil der Rezeptoren vom zentralen Bereich eingeschlossen ist, und die innerhalb der Region ausverdünnt werden. Der Anstieg der Fluoreszenz (AF) über das &quot;Flip&quot;-Sequenz kann daher beobachtet, um das Einsetzen des SEP-GluA2 in der dendritischen Welle zurückgeführt werden. Der niedrige pH-Wasch-und pH 7,4 + NH 4 Cl zusätzlich jeweils bestätigen, dass die gemessene Fluoreszenz von der Oberfläche abgeleitetProteine ​​und zeigen den Anteil der intrazellulären, einsamen Proteine ​​innerhalb der ROI gemessen. Im Gegensatz zu FRAP isoliert dieser Methode Wiederherstellung aufgrund Exozytose, was zu einer stark verringerten Grad der Fluoreszenz Erholung der photogebleicht Region. Um keine zuverlässigen mathematischen Modell bisher wurde entwickelt, um zu passen und zu analysieren, die Erholung aufgezeichneten Traces über diese selektive Bleichen Technik. Es ist jedoch möglich, die Erholung mit einer Mono-Spur exponentiellen Aufschwung fit machen: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) Wobei f (t) Fluoreszenz zum Zeitpunkt t, A s stationären Wert ist, A 0 die zum Zeitpunkt 0 versetzt ist, ist τ die Zeitkonstante. Die Erholung Wachstum mit einer gegebenen Rate festgelegt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, entsprechend einem stationären Zustand zwischen Insertion und Diffusion. Wichtig ist, extrahiert die Zeitkonstante aus diesem einnalyse spiegelt nicht die Zeitkonstante der Exozytose und können nur für vergleichbaren Behandlungen für ein einzelnes Protein verwendet werden. Darüber hinaus ist das erwartete Muster von Fluoreszenz wieder wahrscheinlich in Unterbereichen entlang der photogebleicht Bereich beobachtet werden. Analyse von kleinen ROI innerhalb eines photogebleicht Segment wesentlich sein kann, um Exozytose &quot;Hotspots&quot; zu offenbaren und es ist ratsam, Regionen vergleichbarer Länge wie die Variabilität der Dichte dieser Flecken unter den Dendriten analysieren wird die berechnete Rate beeinflussen. 3 zeigt eine Erweiterung des Protokolls, die Anwendung des Photobleichmittels zu großer Teil ROI mit mehreren Dendriten in dem Sichtfeld, gefolgt von einer selektiven wiederholende Bleichen von nur einem Dendriten. Dieser Ansatz ermöglicht traditionellen &quot;FRAP&quot; und &quot;FRAP-FLIP&quot; Daten parallel erfasst werden. In diesem Beispiel haben hippocampalen Neuronen durch ein Glutamat-Rezeptor-Untereinheit der Klasse Kainat infiziert; GluK2 SEP-markiert. Prior, um Bildgebung, wurden diese mit Neuronen-cylcohexamide (2 Std. bei 200μg/ml), um die Proteinsynthese blockieren behandelt. Als solche Fluoreszenz Erholung in der jeweiligen gemessenen ROIs (Abb. 3.B) zeigt den Anteil der Wiederherstellung aufgrund laterale Diffusion und Recycling in der Standard-FRAP Dendriten im Vergleich zu Recycling allein in den Dendriten unterzogen, um die &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll. Vergleicht man die Werte aus der &amp;Dgr; FRAP versus &#39;FRAP-FLIP &quot;Verwertung Kurven, die jeweiligen Beiträge des Recyclings (AF rec = 11,05%) versus laterale Diffusion (AF diff = 9,35%) geschlossen werden kann. Im Gegensatz zu Abbildung 2, die Erholung nicht halten einen stabilen Zustand Ebene, sondern aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese, zeigt ein vorübergehender Anstieg und nachfolgende Drop-off in Signal, entsprechend Erschöpfung des zur Verfügung stehenden Rezeptor-Pool (ca. 20% Rückgang beobachtet über die Aufnahme Zeitraum). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Prinzipien der FRAP vs FRAP-FLIP-Protokolle Dieses Diagramm veranschaulicht die Ergebnisse einer regelmäßigen FRAP im Vergleich zu einem &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll, mit SEP-markierten Rezeptoren. Fluorescence Recovery in traditionellen FRAP ist auf der linken Seite gezeigt. Gemessen Fluoreszenzerholung im zentralen ROI ist eine Kombination der lateralen Diffusion f nicht photogebleicht SEP-markierten Rezeptoren von außerhalb der ROI photogebleicht und Einsetzen von Rezeptoren durch Recycling und / oder De-novo-Exozytose in die dendritische Welle zurückzuführen. Dagegen ist die sich wiederholende photogebleicht der flankierenden ROIs in der rechten Seite dargestellt ist, zeigt, wie diesem modifizierten &quot;FRAP-Flip &#39;Protokoll Schweigen Erholung durch laterale Diffusion. Als solches kann jede gemessene Fluoreszenz wieder auf direkte Insertion in der ROI zurückgeführt werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Abbildung 2.Einfügen von SEP-GluA2 in die Plasmamembran auf der dendritischen Welle A) Eine Hippocampus exprimiert SEP-GluA2, selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während der obere linke Panel unterstreicht die ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. Das große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor Ausbleichen. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. B) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als Graupegel in dem ROI (nicht normalisiert). Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &amp;Dgr; Zeigt the Anstieg der Fluoreszenz über der Erholungsphase beobachtet werden, durch Einsetzen der September-GluA2 in den dendritischen Schaft. Nachfolgende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Abbildung 3. Recycling &amp; laterale Diffusion vs Recycling von SEP-GluK2 auf der dendritischen Schaft nach Cyclohexamid Behandlung A) Ein Hippocampus ausdrückt SEP-GluK2, selektiv photogebleicht mit parallelen FRAP und &#39;FRAP-FLIP &quot;Verwertung Protokolle entlang getrennten dendritischen ROIs durchgeführt. Dieses Neuron war Gegenstand einer Vorbehandlung mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese (2 Stunden bei 200 ug / ml) zu blockieren. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während die linke Hand Panel Hervorhebung der ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden Regionen boxed, der unteren Dendriten nur mit zwei Spitzen blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor dem Ausbleichen. Rote Pfeile markieren die ROIs in hoher Vergrößerung in B gezeigt), welche die Fluoreszenz Erholung im traditionellen FRAP gegenüber dem &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll. Ein Vergleich der Werte der Fluoreszenzintensität in der späten Phase der Rückgewinnung (dritte Feld) für den Beitrag der lateralen Diffusion und Recycling gegenüber Recycling allein. C) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROIs über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als normierte Intensität Werte. Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &amp;Dgr; Rec zeigt den Einschwingvorgang durch Rezeptor-Recycling, von der FRAP / FLIP Dendriten bestimmt, während &amp;Dgr;Unterschied wird der Beitrag des lateralen Diffusion von SEP-GluK2 in den dendritischen Welle in der &quot;FRAP nur &#39;Return on Investment. Die vorübergehende Erhöhung wird durch allmählichen Rückgang der Signal entsprechend dem Herunterfahren der verfügbaren Rezeptoren durch Cycloheximid-Behandlung. Die anschließende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht.

<ol><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+green+outside%3A+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li>
<li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells%3A+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li>
<li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li>
<li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li>
<li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir beschreiben eine innovative Strategie, um die Komponenten des Plasmas Membranproteinen visualisieren. Der kombinatorische Ansatz von Photobleaching Techniken mit SEP-markierte Protein ermöglicht selektiv Plasmamembran Einfügung Ereignisse zu beurteilen. Durch die kontinuierliche Bleichen die Membranproteine ​​in flankierenden Regionen während der Genesung, beurteilt die &quot;FRAP-Flip &#39;Methode der Beitrag der Vesikeltransport zur Fluoreszenz Erholung. Dieser neue Ansatz ermöglicht die direkte Aufnahme von Protein Membraninsertion, so dass sowohl die Anzahl der Sub-Laderäumen, in denen Erholung beobachtet wird und die Amplitude der Erholung (AF) im stationären Zustand bestimmt werden. Ferner ermöglicht den Vergleich von FRAP mit und ohne FLIP der Anteil der Verwertung zurückzuführen laterale Diffusion zu berechnen. Darüber hinaus, im gleichen Experiment können Bereiche von nicht-photogebleicht Dendriten benachbart zu den flankierenden Regionen photogebleichtwährend der Erholungsphase qualitativ beurteilt; Fluoreszenz Verlust in diesen Regionen zu beobachten sein wird durch laterale Diffusion photogebleicht Rezeptoren in diesen nicht-photogebleicht Segmente des Dendriten. Diese selektive Photobleichen Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Transports Verfahren, wie die Charakterisierung excocytosis in der Plasmamembran in definierten Teilbereichen (z. B. Dendriten oder Stacheln) oder die Bewertung des Beitrags der lateralen Diffusion vs Einsetzen durch die parallele FRAP und &quot;FRAP untersuchen -Flip &#39;Protokolle entlang benachbarten Dendriten (Abb. 3). Klar, während spezifische Leitlinien präsentiert wurden, wird jedes Labor benötigen Optimierung der Bildparameter nach bestimmten Proben und Ausrüstungen. Wichtig ist, dass alle Oberflächen-Rezeptoren in der ROI zu photogebleicht, unabhängig von der z-Achse Brennebene, jedoch ohne signifikante Beschädigung oder phototoxische unspezifische Ausbleichen. UnsERS sollten Vorsicht walten lassen, wenn versucht wird dieses Protokoll in der Zelle soma, wie den hohen Anteil an relativ niedrigen pH intrazelluläre Kompartimente führt in der Regel hohe Hintergrundfluoreszenz in diesen Regionen. Darüber hinaus, während wir haben gezeigt, wie diese Technik angewendet werden kann in unterschiedlich Wege, vor Beginn der selektiven Bleichexperimenten auf eine neue September-Tag bauen, empfehlen wir, dass eine erste Charakterisierung der ersten markierten Rezeptoren durchgeführt wird, wie von Ashby et al 2. Insgesamt ist diese Methode eine leistungsstarke und vielseitige Anpassung der Standard-FRAP-Protokoll, die das Einsetzen Ereignisse in Plasmamembran, um nahezu in Echtzeit ausgewertet werden.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenzes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm Deckgläsern</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-Lysin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1 mg in Boratpuffer zu beschichten Deckgläser</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasalmedium</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% in neuronalen Plattieren und Nährmedium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillin Streptomycin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% in neuronalen Plattieren und Nährmedium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamin</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 mm / 0,8 mm in Ausplattieren / Fütterung Medium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% in neuronalen Plattierungsmedien nur</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 Klonierungsvektor</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Für Sindbisvirus Produktion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META Konfokalsystem</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Image J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Open-Access-Software. Alle hier beschriebenen Plugins sind verfügbar unter<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

laterale diffusion und exozytose von membranproteinen in kultivierten neuronen veranlagte mit fluorescence recovery-und fluoreszenz-verlust photobleaching

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Membranproteine ​​wie Rezeptoren und Ionenkanäle unterziehen aktiven Handel mit Neuronen, die stark polarisiert und morphologisch komplex sind. Diese gerichtete Menschenhandel ist von fundamentaler Bedeutung zu liefern, zu erhalten oder zu entfernen synaptischer Proteine.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) ist eine pH-sensitive Derivat des eGFP wurde ausgiebig für Live Cell Imaging von Plasmamembranproteinen verwendet<sup&gt; 1-2</sup&gt;. Bei niedrigen pH-Wert sinkt Protonierung September Photonen-Absorption und Fluoreszenz-Emission eliminiert. Da die meisten intrazellulären Transport Ereignisse in Fächer mit niedrigem pH-Wert, wo September Fluoreszenz wird verfinstert, die Fluoreszenz-Signal vom September-markierte Proteine ​​auftreten, ist in erster Linie von der Plasmamembran, wo der September auf einen neutralen pH extrazelluläre Umgebung ausgesetzt ist. Bei einer hohen Intensität September beleuchtet, wie jeder Fluoreszenzfarbstoff, ist irreversibel lichtgeschädigter (photogebleicht)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Wichtig ist, weil niedrige pH-Photonen-Absorption löscht, nur ausgedrückt Oberfläche gebleicht September können während intrazelluläre September ist unbeeinflusst von der hohen Intensität Beleuchtung werden<sup&gt; 10.06</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) von September-markierten Proteinen ist eine komfortable und leistungsfähige Technik für die Beurteilung der Dynamik von Proteinen an der Plasmamembran. Wenn fluoreszierend markierten Proteine ​​in einem Bereich von Interesse sind gebleicht (ROI) die Rückgewinnung der Fluoreszenz tritt aufgrund der Bewegung des rohen SEP-markierte Proteine ​​in der gebleichten Region. Dies kann durch laterale Diffusion und / oder von Exozytose nicht photogebleicht Rezeptoren entweder durch zugeführt auftreten<em&gt; De-novo-</em&gt; Synthese oder Recycling (siehe Abb. 1). Der Anteil der bewegliche und unbewegliche Proteins bestimmt werden und die Mobilität und die Kinetik des diffusionsfähigen Fraktion kann unter basalen und stimulierten Bedingungen wie Agonisten Anwendung oder neuronale Aktivierung Reize wie NMDA oder KCl-Anwendung abgefragt werden<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir beschreiben Photobleaching Techniken entwickelt, um selektiv visualisieren die Erholung der Fluoreszenz zuzuschreiben Exozytose. Kurz gesagt, wird ein ROI einmal als mit Standard-Protokollen FRAP gebleicht, gefolgt, nach einer kurzen Erholung, durch wiederholtes Bleichen der flankierenden Regionen. Diese &quot;FRAP-Flip &#39;Protokoll, in unserem Labor entwickelt, wurde genutzt, um AMPA-Rezeptor-Handel bei dendritischen Dornen charakterisieren<sup&gt; 10</sup&gt;, Und ist anwendbar auf eine Vielzahl von Studien zur Bekämpfung den intrazellulären Transport und der Exozytose zu bewerten.</p

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membranproteine wie Rezeptoren und Ionenkanäle unterliegen in Neuronen, die hochgradig polarisiert und morphologisch komplex sind, einem aktiven Transport. Dies ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einlagerung neuronaler Proteine in die Plasmamembran sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem kultivierte hippokampale Neuronen zunächst mit Sinusvirus infiziert werden, um das Protein von Interesse zu exprimieren, das mit Super-ecliptischem Florin oder Sep markiert ist. Anschließend wird ein interessierender Bereich oder ROI photobleicht.Dann werden flankierende Segmente wiederholt photobleicht, während der ursprüngliche Bereich von Interesse die Möglichkeit zur fluoreszenztechnischen Erholung erhält. Schließlich wird die Fluoreszenzerholung im Bereich von Interesse analysiert. Letztendlich wird diese Anpassung herkömmlicher FRAP-Experimente verwendet, um das Muster von Exozytoseereignissen des Zielproteins in der Plasmamembran darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Oberflächen-Biotinylierung oder der Antikörper-Fütterung besteht darin, dass sie die Visualisierung der Dynamik von Membraneinbaueignissen ermöglicht. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich des Proteintransports zu beantworten, insbesondere wo und wie Exozytoseereignisse stattfinden. Ich hatte die Idee zu dieser Methode erstmals, als ich nach einer Alternative zur TURB-Kennzeichnung suchte, um Exozytosevorgänge in Dornfortsätzen in Live-Zell-Experimenten untersuchen zu können. Zunächst kultiviere man dicht bepflanzte hippokampale Neuronen aus Embryonen des 18. Entwicklungstages auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasdeckchen für 14 bis 25 Tage in vitro, sechs bis 24 Stunden vor dem Live-Experiment.Transduzieren Sie die Zellen mit Symbis-Virus, das das membranständige Protein der Interesse codiert, markiert mit dem SUP-ecliptischen Fluoreszenzfarbstoff Osep. Geben Sie das Pseudovirion direkt in das Kulturmedium auf den Deckglaser, der ein Milliliter konditioniertes Medium enthält, und stellen Sie die Zellen anschließend wieder in den Zellkultur-Inkubator. Zum Abbilden der Zellen schalten Sie ein Zeiss Axio Vert LSM 510 Meta Konfokalmikroskop mit 100 % Laserleistung mindestens 20 Minuten vor der Aufnahme ein.Um Leistungsschwankungen während der Bildgebung zu minimieren und die Probe vorzuwärmen. Wenn das Mikroskop bereit ist, wählen Sie das 63-fache Objektiv aus, übertragen Sie dann die Deckglaspräparation in die Bildgebungskammer und ersetzen Sie unverzüglich das Kulturmedium durch vorgewärmte extrazelluläre Aufzeichnungslösung.Platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Mikroskopbühne. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass die Zellgesundheit während des Aufzeichnungsprozesses nicht beeinträchtigt wird. Da dieses Protokoll eine umfangreiche Photobleiche erfordert, um erfolgreich zu sein, stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungsparameter optimiert sind, bevor Sie umfangreiche Experimente beginnen, und bevorzugen Sie eine schnelle Aufnahme gegenüber hochwertigen Bildern.Um die Parameter für die Bildaufnahme festzulegen, identifizieren Sie ein Neuron, das ein rekombinantes Protein von Interesse exprimiert, und stellen Sie es scharf. Scannen Sie die gesamte Zelle mit einem 488 Nanometer Laser bei geringer Leistung. Um die Photobleiche zu minimieren.Verwenden Sie eine hohe nominelle Geschwindigkeit und eine niedrige Pixelauflösung. Halten Sie die gesamte Scan-Geschwindigkeit unter einer Sekunde. Wählen Sie einen Abschnitt des Dendriten zur Abbildung aus und verwenden Sie einen optischen Zoom von 1,5 bis 2,5.Erfassen Sie einen Frame, der den Bereich von Interesse enthält, um festzustellen, ob unspezifisches Photo-Bleichen auftritt. Achten Sie darauf, dass das Sichtfeld mehrere Fortsätze enthält, sodass Messungen von Referenzdendriten erhalten werden können. Passen Sie mithilfe einer Bereichsindikator-Palette die Bildgebungsparameter an, um maximale Fluoreszenz bei minimaler Laseranregung, jedoch mit begrenzter Sättigung zu erzielen.Es wird empfohlen, einen großen Lochblenden-Durchmesser zu verwenden, um die Sammlung von Photonen zu maximieren. Die Detektorempfindlichkeit sollte ausreichend hoch sein, um kleine Zunahmen der Fluoreszenz zu erfassen, sodass die allerersten Bilder vor der photobleaching nicht mehr als 10 % gesättigter Pixel überschreiten. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die fokale Ebene der Mittellinie erreicht wird.Nach der Konfigurationseinstellung speichern Sie diese, um sie für die Phasen der Vor- und Nachbehandlung des Experiments zu verwenden. Definieren Sie anschließend die Photobleichbereiche, indem Sie einen interessierenden Bereich oder ROI für die anfängliche Photobleiche sowie angrenzende Bereiche für die anschließende wiederholte Photobleichphase auswählen.Bei der ersten Photobleiche werden sowohl das zentrale als auch die flankierenden ROIs photobleicht. Bei der wiederholten Photobleiche hingegen werden nur die flankierenden ROIs ausgewählt. Stellen Sie sicher, dass die flankierenden Bereiche breit genug sind, um eine Wiederherstellung durch Diffusion zwischen den Scans zu verhindern.Passen Sie die Bleichparameter für beide Fotobleich-ROIs an. Die anfängliche Fotobleiche sollte schnell erfolgen und je nach optischem Zoom und Volumen des ROI zwischen einer und fünf Wiederholungen erfordern. Bei den flankierenden Regionen sollte die Laseranregung so eingestellt werden, dass eine kontinuierliche Fotobleiche gewährleistet ist, jedoch ohne phototoxische Schäden. Sobald die Parameter festgelegt sind, führen Sie ein FRA-Flip-Experiment als variable Zeitraffer-Bildsequenz durch, indem Sie zunächst drei bis zehn Präbleich-Grundlinienbilder bei niedriger Laserleistung und ohne Zeitverzögerung aufnehmen.Als Nächstes den zentralen ROI mit voller Laserleistung für eine bis fünf Iterationen ausbleichen. Danach drei bis zehn Wiederherstellungsbilder nach dem Ausbleichen aufnehmen. Führen Sie ein wiederholtes Photobleaching der flankierenden Bereiche mit mittlerer Laserleistung durch, wobei die Bildaufnahme in einem typischen Zeitintervall von einer bis fünf Sekunden erfolgt, abhängig von der Wiederherstellungsrate des untersuchten Proteins.Um schließlich die Fluoreszenz zu löschen, ersetzen Sie die extrazelluläre Aufzeichnungslösung durch eine Aufzeichnungslösung, die auf pH sechs gepuffert ist, oder verwenden Sie zum Sichtbarmachen des Proteins in intrazellulären Speichern mit niedrigem pH eine Pufferlösung, die mit 50 Millimolar Ammoniumchlorid ergänzt ist. Sammeln Sie mindestens 10 bis 20 Datensätze für jedes rekombinante Protein, um eine statistische Analyse zu ermöglichen und verfälschte Ergebnisse zu vermeiden; stellen Sie sicher, dass die Bildgebungsbedingungen über alle Wiederholungen hinweg konstant gehalten werden. Öffnen Sie die Bilder, um sie zu analysieren.Passen Sie mithilfe der Image-J-Software die Stapel an, um kleine Schwankungen in der XY-Ebene auszugleichen, die während der Zeitreihe aufgetreten sein könnten. Verwenden Sie für Bilder, die an einem ZES-Konfokalmikroskop aufgenommen wurden, das Stack-Reg-Plugin, und nutzen Sie das LSM-Toolbox-Plugin, um die Zeitwerte als Textdatei auszugeben; importieren Sie diese Werte anschließend in eine Analysetabelle, um die Fluoreszenzschwankungen zu messen. Teilen Sie während des FRA-Flip-Experiments den Bereich der Photobleiche in einzelne Pixelbereiche mithilfe des ROI-Manager-Analysewerkzeugs des Bildes, um mehrere ROIs auszuwählen.Verwenden Sie anschließend den Befehl „Profil der Z-Achse des Diagramms“, um die mittlere Fluoreszenz pro Pixel zu jedem Zeitpunkt zu messen. Wiederholen Sie den Vorgang, um die mittlere Fluoreszenzintensität eines hintergrundbezogenen, nicht fluoreszierenden Bereichs zu bestimmen. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Hintergrundwerte subtrahieren, um experimentelles Rauschen zu entfernen, und dividieren Sie alle Werte durch das mittlere Vor-Photobleaching-Basislinienmaß oder den unmittelbaren Nach-Photobleaching-Wert.Untersuchen Sie die Erholungskurve für jede ROI in Abhängigkeit von der Zeit, um zu berechnen, ob eine signifikante Erholung stattgefunden hat. Berechnen Sie in einer ROI den Delta-F-Wert, indem Sie den Mittelwert der ersten fünf bis zehn Messungen der Photobleaching-Erholungssequenz vom Mittelwert der letzten fünf bis zehn Messungen subtrahieren. Bestimmen Sie anschließend die statistische Signifikanz des Delta-F-Werts und charakterisieren Sie die sich erholenden und nicht erholenden ROIs, um das Muster der Exozytose zu bewerten.Das sind Exozytose-Hotspots oder die Wiederherstellung von Dornfortsätzen im Vergleich zum Axonfortsatz. Dieses Video zeigt das repräsentative Ergebnis eines typischen FRAP-Flip-Experiments unter Verwendung von SERP-Kleber. Ein zwei.Ein Bereich des Dendriten wird einmalig photobleicht, gefolgt von einer Erholungsphase von einer Minute. Anschließend wird die wiederholte Photobleiche der flankierenden Bereiche eingeleitet, wie durch die blauen Pfeile angezeigt. Der rote Pfeil markiert einen kleinen interessierenden Bereich, in dem die Wiederherstellung der Fluoreszenz beobachtet wird, vergrößert dargestellt im rechten Panel des Bildschirms.Die Erholung wird im folgenden Diagramm verfolgt, wobei ein gesamter Anstieg der Fluoreszenz als Delta F gekennzeichnet ist. Der beobachtete Anstieg der Fluoreszenz über diese Abfolge hinweg ist auf die Insertion von Klebstoff A zwei in den dendritischen Fortsatz zurückzuführen. Die starken Änderungen der Fluoreszenzintensität am Ende des Experiments zeigen den Einfluss der niedrigen pH-Werte sowie der pH-7,4- und Ammoniumchlorid-Waschungen auf das SEP-Fluoreszenzsignal. In diesem Beispiel wurden die Neuronen mit SEP-Klebstoff K zwei infiziert.Hier wurde ein großes ROI mit mehreren Dendriten im Bildfeld photobleicht, gefolgt von einer selektiven, wiederholten Photobleiche nur eines einzelnen Dendriten. Diese Neuronen wurden zwei Stunden vor der Bildaufnahme mit Cycloheximid behandelt, um die Proteinsynthese zu blockieren. Daher zeigt die Fluoreszenzrestitution in den jeweils gemessenen ROI den Anteil der Restitution durch laterale Diffusion und Recycling im Standard-FRAP-Dendriten im Vergleich zum alleinigen Recycling in den Dendriten, die dem FRAP-Flip-Protokoll unterzogen wurden.Der Vergleich der Delta-F-Werte aus den FRAP- mit den FRAP-Flip-Recovery-Kurven ermöglicht die Ableitung der relativen Beiträge von Rezyklierung gegenüber lateraler Diffusion aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese. Die Recovery zeigt einen anschließenden Abfall des Signals, da der verfügbare Rezeptorpool erschöpft wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man erfolgreiche Bildgebungsexperimente an Neuronen aufbaut, durchführt und analysiert.Mithilfe dieser Kombination von Photobleaching-Techniken können Sie Hinweise auf die Membraninsertion Ihres Proteins der Untersuchung erhalten.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierter Proteine ​​in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wir untersuchten die mobile / immobile Fraktionen der GFP durch die Analyse der Fluoreszenz-Recovery-Anteil nach Ausbleichen. In dieser Studie wurde FRAP am Rücken von Hippocampus-Neuronen durchgeführt.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Erfahren Sie, wie Sie Exozytose-Ereignisse in kultivierten hippocampalen Neuronen mit FRAP- und FLIP-Photobleaching-Techniken visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Membranprotein-Dynamiken.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching (Video) | JoVE Journal

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Weitere Videos entdecken