Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einlagerung neuronaler Proteine in die Plasmamembran sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem kultivierte hippokampale Neuronen zunächst mit Sinusvirus infiziert werden, um das Protein von Interesse zu exprimieren, das mit Super-ecliptischem Florin oder Sep markiert ist. Anschließend wird ein interessierender Bereich oder ROI photobleicht.

Dann werden flankierende Segmente wiederholt photobleicht, während der ursprüngliche Bereich von Interesse die Möglichkeit zur fluoreszenztechnischen Erholung erhält. Schließlich wird die Fluoreszenzerholung im Bereich von Interesse analysiert. Letztendlich wird diese Anpassung herkömmlicher FRAP-Experimente verwendet, um das Muster von Exozytoseereignissen des Zielproteins in der Plasmamembran darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Oberflächen-Biotinylierung oder der Antikörper-Fütterung besteht darin, dass sie die Visualisierung der Dynamik von Membraneinbaueignissen ermöglicht. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich des Proteintransports zu beantworten, insbesondere wo und wie Exozytoseereignisse stattfinden. Ich hatte die Idee zu dieser Methode erstmals, als ich nach einer Alternative zur TURB-Kennzeichnung suchte, um Exozytosevorgänge in Dornfortsätzen in Live-Zell-Experimenten untersuchen zu können. Zunächst kultiviere man dicht bepflanzte hippokampale Neuronen aus Embryonen des 18. Entwicklungstages auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasdeckchen für 14 bis 25 Tage in vitro, sechs bis 24 Stunden vor dem Live-Experiment.

Transduzieren Sie die Zellen mit Symbis-Virus, das das membranständige Protein der Interesse codiert, markiert mit dem SUP-ecliptischen Fluoreszenzfarbstoff Osep. Geben Sie das Pseudovirion direkt in das Kulturmedium auf den Deckglaser, der ein Milliliter konditioniertes Medium enthält, und stellen Sie die Zellen anschließend wieder in den Zellkultur-Inkubator. Zum Abbilden der Zellen schalten Sie ein Zeiss Axio Vert LSM 510 Meta Konfokalmikroskop mit 100 % Laserleistung mindestens 20 Minuten vor der Aufnahme ein.

Um Leistungsschwankungen während der Bildgebung zu minimieren und die Probe vorzuwärmen. Wenn das Mikroskop bereit ist, wählen Sie das 63-fache Objektiv aus, übertragen Sie dann die Deckglaspräparation in die Bildgebungskammer und ersetzen Sie unverzüglich das Kulturmedium durch vorgewärmte extrazelluläre Aufzeichnungslösung.

Platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Mikroskopbühne. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass die Zellgesundheit während des Aufzeichnungsprozesses nicht beeinträchtigt wird. Da dieses Protokoll eine umfangreiche Photobleiche erfordert, um erfolgreich zu sein, stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungsparameter optimiert sind, bevor Sie umfangreiche Experimente beginnen, und bevorzugen Sie eine schnelle Aufnahme gegenüber hochwertigen Bildern.

Um die Parameter für die Bildaufnahme festzulegen, identifizieren Sie ein Neuron, das ein rekombinantes Protein von Interesse exprimiert, und stellen Sie es scharf. Scannen Sie die gesamte Zelle mit einem 488 Nanometer Laser bei geringer Leistung. Um die Photobleiche zu minimieren.

Verwenden Sie eine hohe nominelle Geschwindigkeit und eine niedrige Pixelauflösung. Halten Sie die gesamte Scan-Geschwindigkeit unter einer Sekunde. Wählen Sie einen Abschnitt des Dendriten zur Abbildung aus und verwenden Sie einen optischen Zoom von 1,5 bis 2,5.

Erfassen Sie einen Frame, der den Bereich von Interesse enthält, um festzustellen, ob unspezifisches Photo-Bleichen auftritt. Achten Sie darauf, dass das Sichtfeld mehrere Fortsätze enthält, sodass Messungen von Referenzdendriten erhalten werden können. Passen Sie mithilfe einer Bereichsindikator-Palette die Bildgebungsparameter an, um maximale Fluoreszenz bei minimaler Laseranregung, jedoch mit begrenzter Sättigung zu erzielen.

Es wird empfohlen, einen großen Lochblenden-Durchmesser zu verwenden, um die Sammlung von Photonen zu maximieren. Die Detektorempfindlichkeit sollte ausreichend hoch sein, um kleine Zunahmen der Fluoreszenz zu erfassen, sodass die allerersten Bilder vor der photobleaching nicht mehr als 10 % gesättigter Pixel überschreiten. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die fokale Ebene der Mittellinie erreicht wird.

Nach der Konfigurationseinstellung speichern Sie diese, um sie für die Phasen der Vor- und Nachbehandlung des Experiments zu verwenden. Definieren Sie anschließend die Photobleichbereiche, indem Sie einen interessierenden Bereich oder ROI für die anfängliche Photobleiche sowie angrenzende Bereiche für die anschließende wiederholte Photobleichphase auswählen.

Bei der ersten Photobleiche werden sowohl das zentrale als auch die flankierenden ROIs photobleicht. Bei der wiederholten Photobleiche hingegen werden nur die flankierenden ROIs ausgewählt. Stellen Sie sicher, dass die flankierenden Bereiche breit genug sind, um eine Wiederherstellung durch Diffusion zwischen den Scans zu verhindern.

Passen Sie die Bleichparameter für beide Fotobleich-ROIs an. Die anfängliche Fotobleiche sollte schnell erfolgen und je nach optischem Zoom und Volumen des ROI zwischen einer und fünf Wiederholungen erfordern. Bei den flankierenden Regionen sollte die Laseranregung so eingestellt werden, dass eine kontinuierliche Fotobleiche gewährleistet ist, jedoch ohne phototoxische Schäden. Sobald die Parameter festgelegt sind, führen Sie ein FRA-Flip-Experiment als variable Zeitraffer-Bildsequenz durch, indem Sie zunächst drei bis zehn Präbleich-Grundlinienbilder bei niedriger Laserleistung und ohne Zeitverzögerung aufnehmen.

Als Nächstes den zentralen ROI mit voller Laserleistung für eine bis fünf Iterationen ausbleichen. Danach drei bis zehn Wiederherstellungsbilder nach dem Ausbleichen aufnehmen. Führen Sie ein wiederholtes Photobleaching der flankierenden Bereiche mit mittlerer Laserleistung durch, wobei die Bildaufnahme in einem typischen Zeitintervall von einer bis fünf Sekunden erfolgt, abhängig von der Wiederherstellungsrate des untersuchten Proteins.

Um schließlich die Fluoreszenz zu löschen, ersetzen Sie die extrazelluläre Aufzeichnungslösung durch eine Aufzeichnungslösung, die auf pH sechs gepuffert ist, oder verwenden Sie zum Sichtbarmachen des Proteins in intrazellulären Speichern mit niedrigem pH eine Pufferlösung, die mit 50 Millimolar Ammoniumchlorid ergänzt ist. Sammeln Sie mindestens 10 bis 20 Datensätze für jedes rekombinante Protein, um eine statistische Analyse zu ermöglichen und verfälschte Ergebnisse zu vermeiden; stellen Sie sicher, dass die Bildgebungsbedingungen über alle Wiederholungen hinweg konstant gehalten werden. Öffnen Sie die Bilder, um sie zu analysieren.

Passen Sie mithilfe der Image-J-Software die Stapel an, um kleine Schwankungen in der XY-Ebene auszugleichen, die während der Zeitreihe aufgetreten sein könnten. Verwenden Sie für Bilder, die an einem ZES-Konfokalmikroskop aufgenommen wurden, das Stack-Reg-Plugin, und nutzen Sie das LSM-Toolbox-Plugin, um die Zeitwerte als Textdatei auszugeben; importieren Sie diese Werte anschließend in eine Analysetabelle, um die Fluoreszenzschwankungen zu messen. Teilen Sie während des FRA-Flip-Experiments den Bereich der Photobleiche in einzelne Pixelbereiche mithilfe des ROI-Manager-Analysewerkzeugs des Bildes, um mehrere ROIs auszuwählen.

Verwenden Sie anschließend den Befehl „Profil der Z-Achse des Diagramms“, um die mittlere Fluoreszenz pro Pixel zu jedem Zeitpunkt zu messen. Wiederholen Sie den Vorgang, um die mittlere Fluoreszenzintensität eines hintergrundbezogenen, nicht fluoreszierenden Bereichs zu bestimmen. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Hintergrundwerte subtrahieren, um experimentelles Rauschen zu entfernen, und dividieren Sie alle Werte durch das mittlere Vor-Photobleaching-Basislinienmaß oder den unmittelbaren Nach-Photobleaching-Wert.

Untersuchen Sie die Erholungskurve für jede ROI in Abhängigkeit von der Zeit, um zu berechnen, ob eine signifikante Erholung stattgefunden hat. Berechnen Sie in einer ROI den Delta-F-Wert, indem Sie den Mittelwert der ersten fünf bis zehn Messungen der Photobleaching-Erholungssequenz vom Mittelwert der letzten fünf bis zehn Messungen subtrahieren. Bestimmen Sie anschließend die statistische Signifikanz des Delta-F-Werts und charakterisieren Sie die sich erholenden und nicht erholenden ROIs, um das Muster der Exozytose zu bewerten.

Das sind Exozytose-Hotspots oder die Wiederherstellung von Dornfortsätzen im Vergleich zum Axonfortsatz. Dieses Video zeigt das repräsentative Ergebnis eines typischen FRAP-Flip-Experiments unter Verwendung von SERP-Kleber. Ein zwei.

Ein Bereich des Dendriten wird einmalig photobleicht, gefolgt von einer Erholungsphase von einer Minute. Anschließend wird die wiederholte Photobleiche der flankierenden Bereiche eingeleitet, wie durch die blauen Pfeile angezeigt. Der rote Pfeil markiert einen kleinen interessierenden Bereich, in dem die Wiederherstellung der Fluoreszenz beobachtet wird, vergrößert dargestellt im rechten Panel des Bildschirms.

Die Erholung wird im folgenden Diagramm verfolgt, wobei ein gesamter Anstieg der Fluoreszenz als Delta F gekennzeichnet ist. Der beobachtete Anstieg der Fluoreszenz über diese Abfolge hinweg ist auf die Insertion von Klebstoff A zwei in den dendritischen Fortsatz zurückzuführen. Die starken Änderungen der Fluoreszenzintensität am Ende des Experiments zeigen den Einfluss der niedrigen pH-Werte sowie der pH-7,4- und Ammoniumchlorid-Waschungen auf das SEP-Fluoreszenzsignal. In diesem Beispiel wurden die Neuronen mit SEP-Klebstoff K zwei infiziert.

Hier wurde ein großes ROI mit mehreren Dendriten im Bildfeld photobleicht, gefolgt von einer selektiven, wiederholten Photobleiche nur eines einzelnen Dendriten. Diese Neuronen wurden zwei Stunden vor der Bildaufnahme mit Cycloheximid behandelt, um die Proteinsynthese zu blockieren. Daher zeigt die Fluoreszenzrestitution in den jeweils gemessenen ROI den Anteil der Restitution durch laterale Diffusion und Recycling im Standard-FRAP-Dendriten im Vergleich zum alleinigen Recycling in den Dendriten, die dem FRAP-Flip-Protokoll unterzogen wurden.

Der Vergleich der Delta-F-Werte aus den FRAP- mit den FRAP-Flip-Recovery-Kurven ermöglicht die Ableitung der relativen Beiträge von Rezyklierung gegenüber lateraler Diffusion aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese. Die Recovery zeigt einen anschließenden Abfall des Signals, da der verfügbare Rezeptorpool erschöpft wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man erfolgreiche Bildgebungsexperimente an Neuronen aufbaut, durchführt und analysiert.

Mithilfe dieser Kombination von Photobleaching-Techniken können Sie Hinweise auf die Membraninsertion Ihres Proteins der Untersuchung erhalten.