Die Erstellung eines Awake Mausklick für Aufnahme neuronalen Antworten und Einspeisen von Tracer

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Antworten einzelner Neuronen bei einem wachen Maus zu erfassen. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst durch Inhalation von Isofluran anästhesiert, in einen stereotaktischen Halter für Nagetiere platziert und der Schädel freigelegt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die gewünschte Hirnregion anhand stereotaktischer Koordinaten zu lokalisieren und diese Region für eine anschließende Kraniotomie zu markieren.

Anschließend wird eine eigens angefertigte Kopfhalterung am Schädel befestigt, und die Kopfhalterung wird in eine Montagestange eingesetzt, die an einem Mikromanipulator der stereotaktischen Vorrichtung befestigt ist. Der letzte Schritt besteht darin, eine Kraniotomie durchzuführen, um die Einführung einer Elektrode ins Gehirn zu ermöglichen. Sobald die Maus sich von der Operation erholt hat, wird sie in einer Schaumstoffhalterung fixiert.

Die Kopfhalterung wird wieder in die Montagestange eingesetzt und an einer selbstgebauten stereotaktischen Apparatur befestigt, und eine Mikropipettenelektrode kann in das Gehirn eingeführt werden. Dieses Vorgehen ermöglicht die Isolierung einzelner Einheiten. Starke Reaktionen auf Reize können über mehrere Tage hinweg von derselben Hirnstruktur aufgezeichnet werden, und die Spuren können verwendet werden, um aufsteigende oder absteigende Projektionen zu physiologisch identifizierten Regionen zu untersuchen, ohne die Reaktionen durch Anästhetika zu beeinflussen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Antworteigenschaften von Neuronen nicht durch Anästhetika beeinflusst werden. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Zachary Mako, ein Doktorand aus meinem Labor, durchführen. Um die Kopfhalterung vorzubereiten, montieren Sie zunächst eine speziell angefertigte Kopfhalterung, indem Sie ein Loch in einen 15 Millimeter (drei 32tel Zoll) langen Edelstahlstab bohren. Danach wird ein 20 Millimeter langer Edelstahlbolzen senkrecht in das Loch eingesetzt.

Um einen Kreuzanschlag zu bilden, bearbeiten Sie ein Ende der vertikalen Stange so, dass sie eine Nr. 1 72-Schraube aufnimmt, wie hier gezeigt. Bereiten Sie anschließend den Montagebügel vor. Dieses Geräteteil besteht aus einem längeren Messing- oder Aluminiumbügel von etwa 90 Millimetern Länge und fünf bis zehn Millimetern Breite sowie einem kürzeren, 15 Millimeter langen Bügel, der am Ende des langen Bügels in einem Winkel von 45 Grad angebracht ist.

Der kürzere Balken weist eine Nut an der Unterseite und eine kürzere Nut quer zur Breite auf, in die der Kopfpfosten eingesetzt wird, wobei das Querstück in die kürzere Nut eingelassen wird. Der Halteblock besteht aus zwei Aluminiumstücken, die mit Schrauben zusammengesetzt sind und einen Block von etwa 30 Millimetern mal 30 Millimetern mal 25 Millimetern bilden, mit einer Aussparung zur Aufnahme des Haltebalkens. Setzen Sie den Haltebalken in die Aussparung des Halteblocks parallel zur Tischoberfläche ein. Befestigen Sie den Halteblock an einem Mikromanipulator, sodass die Position des Kopfpfostens genau entlang der Mittellinie und einer Brima platziert werden kann.

Schneiden Sie abschließend einen Wolframdraht mit einem Durchmesser von 0,01 Zoll auf eine Länge von etwa fünf Millimetern zu, wobei etwa ein Millimeter in einem Winkel von 45 Grad gebogen wird. Dieser Draht dient als Massestift. Nachdem das Tier in eine Induktionskammer mit 5 % Fluoranästhetikum gebracht wurde, überprüfen Sie durch einen Zehenquetschtest, ob das Tier vollständig anästhesiert ist, indem Sie das Fehlen einer Reaktion sicherstellen.

Wenn die Maus vollständig anästhesiert ist, platzieren Sie sie in den stereotaktischen Rahmen für Nagetiere mit Mäuseadapter, indem Sie zunächst die Zähne in die Öffnung der Bissstange einsetzen und die Nasenklemme vorsichtig so festziehen, dass sie fest sitzt. Um sicherzustellen, dass das Tier weiterhin anästhesiert bleibt, platzieren Sie eine aus einem Stück Latexhandschuh gefertigte Gesichtsmaske über die Nase der Maus und führen 5 % Isofluran zu, bis die Atemfrequenz etwa ein Atemzug pro Sekunde beträgt.

Nach dieser Zeit reduzieren Sie den Isofluran auf 1,5 bis 2 %. Befestigen Sie nun den Kopf, indem Sie die Ohrstifte vorsichtig in jeden Gehörgang einführen. Achten Sie darauf, das Trommelfell nicht zu verletzen, und befestigen Sie die Ohrstifte so, dass sie fest sitzen, aber nicht zu tief in die Gehörgänge eindringen. Legen Sie eine Gel-Heizauflage unter die Maus.

Dann vorsichtig Augensalbe auftragen, um zu verhindern, dass die Augen austrocknen. Verwenden Sie einen kleinen Rasierer oder eine feine Schere. Entfernen Sie die Haare vom Bereich zwischen den Ohren bis zu den Augen.

Reinigen und sterilisieren Sie nun die Kopfhaut mit Chlorhexidin- oder Betadinscrub, gefolgt von einer alkoholischen Spülung, die dreimal wiederholt wird. Führen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie vom Hinterkopf bis zu den Augen durch. Falls erforderlich, entfernen Sie das Periost mit einem Skalpell bis zu den Rändern des Schnittes abkratzend.

Ziehen Sie vorsichtig die Nackenmuskulatur mit einer Pinzette nach hinten, wobei das Muskelgewebe entlang der Sehnen einreißt, um Blutungen zu minimieren. Legen Sie Gelatineschwamm unter das Hautgewebe, um Feuchtigkeit zu reduzieren und zu verhindern, dass die Haut über den Schädel gleitet. Befeuchten Sie anschließend einen Wattestäbchen mit Isopropanol und trocknen Sie die Schädeloberfläche, um die Sichtbarkeit der Schädelmarkierungen zu verbessern.

Nachdem das Tier präpariert ist, setzen Sie eine feine Spitze, beispielsweise einen geschärften Metallstab, in den Elektrodenhalter ein und befestigen Sie sie am stereotaktischen Mikromanipulator. Bewegen Sie die Sonde vor und zurück zwischen bgma und Lambda, wobei sich die mediolateralen Koordinaten für jeden Ort um nicht mehr als 50 Mikrometer unterscheiden dürfen.

Positionieren Sie den Kopf vorsichtig unter gegebenenfalls notwendiger Verwendung der Ohrstifte neu. Überprüfen Sie, ob der dorsoventrale Höhenunterschied an Bgma und Lambda nicht mehr als 50 Mikrometer beträgt. Stellen Sie die Höhe der Nasenklemme gegebenenfalls so ein, dass die Neigung des Schädels ausgeglichen wird; möglicherweise muss auch die Höhe der Ohrstifte angepasst werden.

Verwenden Sie einen Atlas des Mausgehirns, um die Koordinaten des Zielgebiets relativ zum bgma zu bestimmen. Markieren Sie den Schädel oberhalb des Zielgebiets mit Tuschefarbe, wo eine Kraniotomie durchgeführt wird. Reinigen Sie zunächst den Schädel, indem Sie Dental-Ätzgel auf der Oberfläche verteilen und etwa 10 Sekunden lang abbürsten.

Danach mit Wasser waschen und vollständig trocknen. Als Nächstes den Haftvermittler für den dentalen Zement auf die Schädeloberfläche auftragen. Mit dem Applikator zunächst den Haftvermittler auftragen und dann einen neuen Applikator verwenden, um den Haftvermittler gleichmäßig zu verteilen; anschließend den Haftvermittler mit einem Zyklus einer UV-Lampe aushärten.

Wählen Sie eine Stelle distal zur Zielregion aus. Verwenden Sie zur Platzierung des Massestifts die Spitze eines Mini-Klingenskalpells der Größe 65, um vorsichtig ein kleines Loch im Schädel zu bohren. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Loch breit genug sein, um das kurze Ende des Massestifts aufzunehmen.

Setzen Sie den Erdungspflock so ein, dass er auf den Hirnhäuten aufliegt. Achten Sie darauf, dass der Pflock so ausgerichtet ist, dass er vom bgma und der Befestigungsstelle des Kopfpostens wegzeigt. Bewegen Sie nun den Mikromanipulator, sodass der Kopfposten über dem bgma positioniert ist und gerade die Schädeldecke berührt.

Die Basis der Kopfhalterung sollte flach auf dem Schädel liegen. Anschließend mit Dissektionssonden eine kleine Menge Zahnzement um die Kopfhalterung und die Erdungsnadel auftragen. Den Zement andrücken, um einen guten Kontakt mit dem Schädel sicherzustellen.

Danach mit drei bis vier Zyklen einer UV-Lampe aushärten. Abschließend eine zweite Schicht Klebstoff auftragen, um die Basis um den Kopf des Posts aufzubauen und die Rillen des Kopf-Posts zu bedecken, und aushärten. Zuerst die Kraniotomie-Referenzmarkierung lokalisieren, die teilweise durch den Primer verdeckt sein wird.

Verwenden Sie dann ein Miniklingenskalpell der Größe 65, um ein drei Millimeter mal drei Millimeter großes Quadrat um diese Stelle herum zu markieren. Geben Sie einen Tropfen Lidocain-Lösung auf, um die Empfindlichkeit zu verringern. Führen Sie nun mehrere Einschnitte an jeder Seite des Quadrats durch, wobei darauf geachtet werden muss, den Knochen nicht zu durchtrennen und ins Gehirn vorzudringen.

Sobald die Knochenplatte locker wird, verwenden Sie die Spitze des Skalpells, um sie vorsichtig anzuheben, wobei die Dura mater intakt bleibt. Danach bedecken Sie die Stelle mit Knochenwachs. Sobald die Operation abgeschlossen ist, schalten Sie das Isofluran aus und befreien die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.

Tragen Sie Lidocain auf die freiliegende Haut auf, gefolgt von einer Behandlung mit Neo-Spore-Salbe, verabreichen Sie je nach Anweisung des Tierarztes eine postoperative Analgesie und bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück. Nach 24 Stunden kann die Maus für elektrophysiologische Ableitungen verwendet werden. Diese Abbildung zeigt, dass eine erfolgreiche Implantation der Kopfhalterung es dem Experimentator ermöglicht, Einzel- und Multieinheitsantworten von einer wachen Maus über mehrere Tage hinweg aufzuzeichnen.

Das Fixiersystem ermöglicht stabile elektrophysiologische Ableitungen einzelner Neuronen im Gehirn. Ausgehend von derselben Hirnstruktur können über mehrere Tage hinweg eine hervorragende Isolierung einzelner Einheiten sowie starke Reaktionen auf Reize aufgezeichnet werden. Zum Beispiel im unteren Hügel des Mäusgehirns über einen Zeitraum von zwei Tagen zeigt das linke Panel die Aufzeichnungen vom ersten Tag und das rechte Panel die vom zweiten Tag, um absteigende Projektionen vom auditorischen Mittelhirn zum auditorischen Hirnstamm zu untersuchen; biotinylierte Dextra und Amine, die mithilfe von Dino Benadine als Chromogen sichtbar gemacht wurden, können in den unteren Hügel der Maus injiziert werden, wie hier nach der elektrophysiologischen Identifizierung neuronaler Reaktionseigenschaften an der Injektionsstelle und nach der Gewebeprozessierung zu sehen ist.

Die anterograden Markierungen im kontralateralen dorsalen Cochlearkern können wie hier gezeigt sichtbar gemacht und dargestellt werden. Außerdem können Foto-Mikroaufnahmen mit höherer Auflösung angefertigt werden, um stark markierte Axone und Endigungen zu betrachten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Antworteigenschaften einzelner Neuronen aufzeichnet und Farbstoffe oder Tracer für neuroanatomische Untersuchungen in einer wachen Maus injiziert.

Diese Vorbereitung eliminiert den Einfluss von Anästhetika auf die Eigenschaften neuronaler Antworten und ermöglicht Experimente über mehrere Tage hinweg am selben Tier. Der Schlüssel zum Verfahren besteht darin, sicherzustellen, dass die Kopfhalterung fest am Schädel befestigt ist und die Maus gut fixiert ist. Während dieses Video veranschaulicht hat, wie man mit dieser Methode Aufnahmen einzelner Neuronen im auditorischen System durchführen kann, lassen sich mit dieser Technik auch andere Bereiche des Gehirns untersuchen.