Name: Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Bildgebung der HIV-1-induzierten virologischen Synapse mit TIRF-Mikroskopie auf synthetischen Lipiddoppelschichten. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Signalproteinen wie LCK.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI071815 (CEH) und der Roadmap Nanomedizin Development Center Award PN2EY016586 (MLD) unterstützt.

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.

Frühere Studien haben visualisiert VS in der Zell-Zell-Konjugat-System, aber diese Studien nicht liefern Bilder von hoher Auflösung genug, um die supramolekularen Strukturen an der Synapse zu visualisieren. In unserem Labor verwendeten wir das Glas-unterstützten ebene Bilayer-System, um die Oberfläche der infizierten Zellen, die Virushülle gp120 und die zelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 darstellen. In Verbindung mit TIRF Mikroskopie, die Fluoreszenz-Signale erkennt innerhalb 100-200 nm aus der Doppelschicht Oberfläche mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis, konnten wir supramolekularen Trennung von gp120 von ICAM-1 in der VS zu erfassen. Darüber hinaus kann die Standard-Immunfärbung Verfahren zur Doppelschicht-System angewendet werden und ist auch hier zu erkennen und zu quantifizieren, die spezifische Einstellung von aktiven Lck, nicht aber Fyn, der gp120-Kontaktfläche an VS 15. Daher bietet die planare Doppelschicht ein experimentelles System für hochauflösende Bildgebung von Synapse-Schnittstelle in einer 2D-Ebene durch TIRF-Mikroskopie sowie Weitwinkel-oder konfokale Beleuchtung Methoden. Allerdings ist das System auch Einschränkungen Einstellen Liganden Mobilität, out-of-plane, und Schwankungen von biologischen Membranen werden durch planare Doppelschichten wiedergegeben. Darüber hinaus ist dies ein in vitro-System und hat daher andere Einschränkungen, wie der Mangel an anderen Membran-Moleküle, die vorhanden sein auf einer infizierten Zelle und des Zytoskeletts Maschinen, die molekularen und zellulären Mobilität Motilität reguliert würden. Auch können die Dynamik und Verteilung der Moleküle, wie Trimeren gegenüber Monomeren von gp120, physiologisch nicht auf dem Doppelschichtkern dargestellt werden. Doch selbst mit diesen Einschränkungen ist dieses System noch sehr wertvoll für das Studium Virus-Zell-oder Zell-Zell-Interaktionen, und diese Methoden können als nützlicher Leitfaden für Forscher, die versuchen Bilder mit hoher Auflösung sind supramolekulare Organisation erkennen zu dienen, die nicht erkennbar ist bei dem herkömmlichen Zell-Zell-konjugiertes System.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> His-markierten HIV-gp120 </td><td> Geschenk von Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> His-markierten HIV-gp120 </td><td> Immun-Technologie </td><td></td><td> Verschiedene X4 oder R5 Tropic </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Human Serum Albumin 25% </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-Zentrifugalmühle Filter </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Kaninchen mAb </td><td> Cell Signaling </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Rabbit pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Kaninchen mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> Carbonsäure Succinimidylester </td></tr><tr><td> FCS2 Kammer </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Round w / Löcher </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 mm dick </td></tr><tr><td> Rectangle-Dichtung </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 mm dick </td></tr><tr><td> Tygon-Schlauch </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 Fuß) </td></tr><tr><td> Dreiwegehahn </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Wege-Hahn </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Sticky Slide ich 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml-Spritze </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> DOGS-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging von hiv-1 envelope-induzierte virologische synapse und signalisierung auf synthetic lipiddoppelschichten

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Infektion erfolgt höchst effizient über Zelle zu Zelle Übertragung 2,10,11. Diese Zelle zu Zelle zwischen CD4 + T-Zellen ist die Bildung einer virologischen Synapse (VS), die eine F-Aktin-abhängigen Zell-Zell-Übergang auf den Eingriff von HIV-1 envelope gp120 auf der infizierten Zelle mit CD4 und ausgebildet ist das Chemokinrezeptor (CKR) CCR5 oder CXCR4 auf der Zielzelle 8. Zusätzlich zu gp120 an die Rezeptoren, andere Membranproteine, insbesondere das Adhäsionsmolekül LFA-1 und seinen Liganden, die ICAM-Familie spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung und VS eine Übertragung des Virus, wie sie auf der Oberfläche von virusinfizierten Donorzellen und Zielzellen, als auch auf der Hülle von HIV-1-Virionen 1,4,5,6,7,13. VS Bildung wird durch intrazelluläre Signalwege, die als Ergebnis von gp120-Eingriff seiner Rezeptoren transduziert begleitet. In der Tat haben wir kürzlich zeigen, dass CD4 &lt;sup&gt; + T-Zell-Interaktion mit gp120 Einstellung und Phosphorylierung von Signalmolekülen mit dem TCR Signalosom einschließlich Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76 Itk und PLCγ 15 zugeordnet induziert. In diesem Artikel stellen wir eine Methode, um supramolekulare Anordnung und Membran-proximalen Signalisierung Veranstaltungen im Verlauf VS Bildung sichtbar zu machen. Wir nutzen das Glas-unterstützten ebenen Bi-Schicht System nach einem reduktionistischen Modells, um die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen, die das virale Hüll-gp120 und die zelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 darstellen. Das Protokoll beschreibt allgemeine Verfahren für die Überwachung von HIV-1 gp120-induzierte VS und Signal-Aktivierung Ereignisse, die i) bi-Schicht Vorbereitung und Montage in einer Flusszelle umfassen, ii) Injektion von Zellen und Immunfluoreszenzfärbung an intrazellulären Signalmolekülen auf Zellen interagieren erkennen mit HIV-1 gp120 und ICAM-1 auf bi-Schichten, iii) Bildaufnahme durch TIRF-Mikroskopie, einnd iv) Analyse der Daten. Dieses System erzeugt Bilder mit hoher Auflösung von VS-Schnittstelle darüber hinaus mit dem herkömmlichen Zell-Zell-System erreicht, wie sie abhängig vom Erfassen unterschiedliche Cluster von einzelnen molekularen Komponenten der VS ermöglicht zusammen mit Signalmoleküle rekrutiert, um diesen Sub-Domains.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Die Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) erfolgt am effizientesten über die Zell-zu-Zell-Übertragung2,10,11. Dieser Zell-zu-Zell-Transfer zwischen ...

Diese Methode erzeugt Lipiddoppelschichten, die eine infizierte Zelloberfläche nachahmen. Um die mit primären humanen CD4+-T-Zellen gebildete HIV-virologische Synapse zu untersuchen, markieren Sie zunächst Proteine ​​von Interesse mit fluoreszenten Farbstoffen, erzeugen anschließend Lipiddoppelschichten und lassen die Zellen Synapsen bilden, fixieren und färben die Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern zur Visualisierung von Signalproteinen. Anschließend erfassen Sie mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Mikroskopie Bilder der Signalproteine in den synapsenbildenden Zellen.Analysieren Sie die Rasenbilder, um die Lokalisation aktiver Signalmoleküle in Bezug auf die Struktur der virologischen Synapse abzugrenzen. Dieser experimentelle Ansatz kann darauf hinweisen, ob zelluläre Proteine wie die lymphozytenspezifische Proteinkinase LCK an die HIV-virologische Synapse rekrutiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der HIV-Virologie und Immunologie zu beantworten, beispielsweise, welche zellulären Bestandteile an der virologischen Synapse beteiligt sind.Welche Rolle spielt sie bei der Synapsenbildung und wie könnte sie die HIV-Übertragung von Zelle zu Zelle beeinflussen? Dieses Bier-System bietet eine Endphasenansicht der Synapse mit dem Vorteil, die Synapse in hoher räumlicher Auflösung in einer einzelnen Ebene visualisieren zu können. Die Ergebnisse zeigen deutlich die synaptische Struktur, die Bildung des Biers und die Montage der Flusszelle ist eine Kunstform, ein Kinter.Hier demonstrieren wir die Bilar-Präparation an der biooptischen Flusszelle für Studien mit infektiösen Viren oder infizierten Zellen oder wenn aufgrund begrenzter Reagenzien kleine Volumina verwendet werden müssen. Einmalige OB-Flusszellen können mit demselben Bilar-Präparationsverfahren verwendet werden. Michael Kramer und ich werden ein Verfahren zur Markierung von Proteinen demonstrieren.Wählen Sie fluoreszierende Farbstoffe wie LOR 4 88 aus, die effektiv an Proteine binden, ausreichend photostabil für die Mikroskopie-Bildgebung sind und zu den Anregungswellenlängen der auf dem Mikroskop verfügbaren Laser passen. Beginnen Sie mit gereinigtem his-markiertem GP one 20 DH 12 Protein. Tauschen Sie den Proteinpuffer mittels einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 50 Kilodalton gegen steriles PBS aus.Als Nächstes überprüfen Sie den pH-Wert und geben Natriumbicarbonat pH 9,0 hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Millimolar Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von etwa 8,5 zu erreichen. Danach fügen Sie einen mittleren reaktiven LOR 4 88 Fluoreszenzfarbstoff im zehnfachen molaren Überschuss hinzu. Inkubieren Sie dieses Gemisch 45 Minuten bis eine Stunde lang im Dunkeln.Fahren Sie fort, indem Sie den überschüssigen Farbstoff mit einer Zentrifugalfiltereinheit entfernen. Geben Sie frisches steriles PBS auf die Säule und waschen Sie weiterhin das Protein vom freien Farbstoff ab. Anschließend konzentrieren Sie das GP one 20 Protein auf etwa ein Milligramm pro Milliliter.Messen Sie die Konzentration des fluoreszierenden Farbstoffs bei 488 Nanometern. Bestimmen Sie außerdem die Protein-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektrophotometer unter Verwendung der Einstellung für Proteine und Markierungen.Teilen Sie die beiden Zahlen, um die Fluoreszenzintensität pro Proteinmolekül zu bestimmen. Bereiten Sie eine Piranhalösung aus 45 Milliliter Schwefelsäure und 15 Milliliter 30%iger Wasserstoffperoxid mit Plastikklammern vor. Tauchen Sie die Deckgläser 15 Minuten lang ein.Überführen Sie die Deckgläser in einen Becher, der mit PIKA-reinem Wasser gefüllt ist. Waschen Sie jedes Deckglas zwei Minuten lang unter fließendem Wasser, eine Minute pro Seite, und stellen Sie sie zum Trocknen auf ein Gestell. Fahren Sie fort, indem Sie nach der Optik F CS zwei Kammern wie zuvor von Varona et al. 2008 beschrieben zusammenbauen. Danach erfassen und präsentieren Sie Hiss GP eins 20 auf der Doppelschichtoberfläche, ohne die Spitze mit dem Glas berühren zu lassen.Pipettieren Sie fünf Tropfen der Liposom-Mischung mit je einem Mikroliter auf eine Mikro-Aquädukt-Objektträger, um fünf Doppelschichten pro Durchflusszelle vorzubereiten. Legen Sie nun eine Deckglas auf die Lipide. Danach bedecken Sie den weißen Haltering mit einer Klemmbasis aus rostfreiem Stahl.Drehen Sie die gesamte Apparatur um und verschließen Sie sie. Markieren Sie anschließend die Position der Doppelschichten und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend schließen Sie einen Schlauch mit einem Zwei-Wege-Hahn an das linke Perfusionsrohr an.Füllen Sie den Schlauch, der mit einem Dreiweghahn verbunden ist, mit 1 % menserlichem Serumalbumin in heis-pufferter Salzlösung und vergewissern Sie sich, dass die Apparatur blasenfrei ist. Verbinden Sie nun diesen Schlauch mit dem rechten Perfusionsrohr und erzeugen Sie einen positiven Meniskus. Drücken Sie vorsichtig Puffer durch die Flusszelle, um die Doppelschicht zu blockieren.Befestigen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die 300 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von Nickelchlorid-ENC-Casein enthält, an dem Dreiweghahn, und drücken Sie vorsichtig Puffer durch, um beide Hähne zu schließen, bevor Sie die Spritze abnehmen. Inkubieren Sie die Spritze 30 Minuten bei Raumtemperatur.Laden Sie nun 250 Moleküle des mit Hiss markierten LOR 4 88-markierten GP1 20 pro Mikrometer auf, um die lokale Dichte von Endclustern an der HIV V1-Oberfläche nachzuahmen. Inkubieren Sie 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur und waschen Sie mit fünf Millilitern H-B-S-H-S-A-Puffer in Schichten. Äquilibrieren Sie die Durchflusszelle auf 37 Grad Celsius. Unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze die aktivierten humanen CD4-positiven T-Zellen in 400 Mikroliter 1 %iger Humanalbuminlösung hinzufügen und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Anheftung der Zellen an die Lipidmonoschicht zu ermöglichen. Danach die Zellen mit 2 % Paraformaldehyd fixieren und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dreimal mit je einem Milliliter waschen.PBS, anschließend permeabilisieren die Zellen durch Einwirken von 0,1 % Triton X-100 für fünf Minuten bei Raumtemperatur, nachdem dreimal mit je einem Milliliter PBS gewaschen wurde; Blockierung mit Casein, das 5 % Zieuserserum enthält, für 25 Minuten bei Raumtemperatur; dreimaliges Waschen mit PBS. Danach primären Antikörper und 300 Mikroliter Puffer pro Durchflusskammer für 20 Minuten bis eine Stunde hinzufügen.Bei Raumtemperatur nach drei Pufferwechseln mit PBS die geeignete fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörperlösung in Puffer hinzufügen. In dem Experiment wird die Kontrollprobe der nächsten Schicht ausschließlich mit sekundärem Antikörper behandelt, um die Stärke des unspezifischen Signals dieses Reagenzes zu bestimmen. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend dreimal mit einem Milliliter waschen.PBS gewinnt Bilder aller Proben mittels totaler innerer Reflexion. Fluoreszenzmikroskopie. Führen Sie eine quantitative Analyse der Bilder mit einem Bildanalyse-Softwarepaket durch, beispielsweise in ImageJ im Reiter „Messungen analysieren“.Wählen Sie die Felder für Fläche und mittleren Grauwert aus. Wählen Sie einen interessierenden Bereich im Bild aus, der ein Polygon oder eine frei gezeichnete geschlossene Form ist. Wählen Sie dann die Registerkarte „Analysieren messen“, damit die Software Daten aus dieser Messung aufzeichnet.Stellen Sie in einer Ergebnistabelle die Messungen auf Mittelwert und Fläche ein, öffnen Sie dann die Bilder für eine experimentelle Bedingung für jede Zellspur und messen Sie den interessierenden Bereich sowie die Spur; messen Sie außerdem einen Hintergrundbereich für jede experimentelle Bedingung. Kopieren Sie die Messwerte und fügen Sie sie in Excel ein. Wenn alle Daten gesammelt wurden, berechnen Sie die durchschnittliche Intensität in willkürlichen Einheiten.Ziehen Sie die Hintergrundintensität vom Mittelwert ab und multiplizieren Sie dann mit der Fläche, um die integrierte Intensität des Proteins in beliebigen Einheiten zu erhalten, um die Aktivierung und Rekrutierung der anfänglichen membranproximalen Signalmoleküle zu messen. Als Ergebnis der Interaktion mit GP one 20 an der VIROLOGISCHEN Synapse wurden humane primäre CD four positive T-Zellen auf Bilagen mit G one 20 und ICAM one aufgebracht; Zellen, die auf Bilagen mit nur ICAM one aufgebracht wurden, dienten als Kontrolle zur Bestimmung der basalen Signalisierungslevel. Nachdem die Zellen mit Bilagen, die GP one 20 und ICAM one enthielten, interagiert hatten, wurde das LCK-Protein an die Virologische Synapsenschnittstelle rekrutiert und kolokalisierte mit GP one 20.Die durchschnittliche Intensität des gesamten LCK war auf der Doppelschicht, die sowohl GP one 20 als auch ICAM one enthielt, höher als bei alleinigem ICAM one. Interessanterweise waren die integrierten Intensitätswerte ähnlich. Insgesamt genommen.Diese Daten deuten darauf hin, dass LCK in einen zentralen Cluster umverteilt wird. Nach der Bindung von CD4-positiven T-Zellen an GP120 wurden die durch Turf-Mikroskopie erfassten durchschnittlichen und integrierten Intensitäten der phosphorylierten LCK-Tyrosin-394-Stellen abgebildet und quantifiziert.Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von GP120 die Phosphorylierung des Tyrosinrests 394 in der LCK-Aktivierungsschleife erhöhte. Im Gegensatz dazu war mehr Finn im Kontaktbereich von Zellen auf ICAM-1-Einzel-Bilayern vorhanden als auf Bilayern, die sowohl GP120 als auch ICAM-1 enthielten. Folglich wurde Finn nicht an die virologische Synapse rekrutiert.Folglich schlussfolgern wir, dass LCK und nicht Finn die aktive Kinase in der HIV-1-GP-120-induzierten virologischen Synapse ist. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit bestimmten Proteinen beladene Biers bevorzugt, immunfluoreszenzmarkierte Färbungen an Flusskammer-Zell-Bilar-Interaktionen mittels Totalreflexionsmikroskopie durchführt und grundlegende Analysen vornimmt. Dieses Bilar-System eignet sich außerdem für die Live-Cell-Abbildung, bei der Sie die Dynamik der Bildung virologischer Synapsen verfolgen können.Außerdem können Zellen mit fluoreszenzmarkierten Proteinen wie GFPs Z 70 transfiziert werden. Dies ermöglicht die Verfolgung von Änderungen in der Verteilung und Rekrutierung von Signalproteinen an die Synapse in Echtzeit.

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Das Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Ansatz zur Bestimmung Strukturen von Membranproteinen mittels Kryo-Elektronen-Tomographie und 3D-Bildverarbeitung. Es deckt die Einzelheiten der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenverarbeitung und-interpretation, und schließt mit der Produktion von einer repräsentativen Ziel für den Ansatz, die HIV-1 Envelope Glykoproteins. Diese Berechnungsverfahren sind in einer Weise, Forscher und Studenten ermöglicht, remote arbeiten und einen Beitrag zur...

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Visualisierung der Bildung der immunologischen Synapse in natürlichen Killerzellen (NK) auf einer gestützten Lipiddoppelschicht (SLB). Der SLB wird zunächst mit einem Fluorophor-markierten NK-Zell-aktivierenden Rezeptorliganden markiert, gefolgt von der Inkubation mit NK-Zellen. Anschließend werden die Zellen mit polymerisiertem Aktin und Perforin-positiven lytischen Granulaten angefärbt. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Synapsenbildung...

Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Untersuchung der Immunsynapsenbildung zwischen primären menschlichen T-Zellen und gestützten Lipiddoppelschichten (SLB). T-Zell-Oberflächenproteine interagieren mit den jeweiligen Liganden, die auf SLB immobilisiert sind, um eine Immunsynapse zu bilden, gefolgt von der Bewegung der lytischen Granula in Richtung der Synapse, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wird.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der T-Zell-Interaktion mit gestützten planaren Lipid-Doppelschichten

Dieses Video zeigt die Bildgebung von lebenden Zellen der immunologischen Synapsentopologie und untersucht die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und Epithelzellen, die fluoreszierende Antigene tragen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine rote Zytoplasma-Verschiebung und gelbe Membranringe in Endothelzellen, was auf die Bildung immunologischer Synapsen hinweist.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

Die adaptive Immunität wird durch dynamische 'immunologische Synapsen' gesteuert, die zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen gebildet werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von Endothelzellen sowohl als wenig untersuchte physiologische APCs als auch als eine neuartige Art von "planarem zellulärem APC-Modell".

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Wir veranschaulichen hier einen in vitro Membranbindungsassay, in dem Wechselwirkungen zwischen HIV-1 Gag und Lipidmembranen visuell analysiert werden, unter Verwendung von YFP-tagged Gag, synthetisiert in einem weizenkeimbasierten in vitro Translationssystem und GUVs, die durch eine Elektroformationstechnik hergestellt wurden.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

Erfahren Sie die Bildgebung der HIV-1-induzierten virologischen Synapse mit TIRF-Mikroskopie auf synthetischen Lipiddoppelschichten. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Signalproteinen wie LCK.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Weitere Videos entdecken