Name: Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die mehrstufige Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen durch Endothelzell-Co-Kultur. Diese Methode liefert höhere Ausbeuten und verbesserte Reifung für Diabetes-Forschung.

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Dieses Projekt wurde von NIH New Innovator Award DP2 116520 und ORAU Ralph Powe Junior Faculty Enhancement Award.

1. Zell-Wartung <ol><li> H1 hESC (WiCell) wurden an menschlichen embryonalen Stammzellen qualifizierte Matrigel beschichteten Wells mit mTeSR1 Medien gepflegt, mit Medien täglich ändern. F12: Die Vertiefungen wurden mit verdünnter Matrigel Lösung, durch Zugabe von 300 ul hESC Matrigel in 25 ml DMEM beschichtet. 1 ml dieser Lösung wurde Matrigel in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen gegeben, oder 400 ul in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und man ließ die Beschichtung 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden mechanisch mit einer Split-Verhältnis von 1:4 durch Abkratzen Kolonien, wenn sie zwischen 1 und 1,5 mm im Durchmesser erreicht passagiert. </li><li> RHMVEC (VEC-Technologien) wurde im MCDB-131 Medien mit Medien verändern jeden zweiten Tag gepflegt. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung aufgeteilt einmal 80% Konfluenz in einem Teilungsverhältnis von 1:3 erreicht wurde. Endothelzellen zwischen den Kanälen 3 und 7 wurden für diese Studie verwendet. </li></ol> 2. Herstellung von Stammlösungen <ol><li> Activin A wurde bei 50 pg / ml in sterilem P rekonstituiertBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin. Die Lösung wurde aliquotiert und bei -20 ° C gelagert </li><li> EGF wurde bei 500 pg / ml in sterilem 10 mM Essigsäure rekonstituiert. Die Lösung wurde aliquotiert und bei -20 ° C gelagert </li><li> Insulin wurde mit 10 mg / ml mit indem angesäuert H 2 O (pH-Wert ≤ 2), durch Zugabe von 0,1 ml Eisessig zu 10 ml Wasser hergestellt rekonstituiert. </li><li> DAPT wurde in DMSO bei 18 mg / ml rekonstituiert. Es wurde weiter auf 300 pM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -20 ° C </li><li> KAAD-Cyclopamin wurde in DMSO bei 5mg/ml rekonstituiert. Es wurde weiter auf 2 pM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -20 ° C </li><li> All-trans-Retinsäure wurde mit 2,7 mg / ml in 95% Ethanol rekonstituiert. Ferner wurde auf 2 mM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -80 ° C </li></ol> 3. Definitive Endoderm (DE) und Pankreas-Vorläuferzellen (PP) Induction <ol><li> Einmal hESC Kolonien erreicht zwischen 1 und 1,5 mm im Durchmesser, wurde DE Induktion mit indem DMEM durchgeführt: F12 mit B27, 0,2% BSA, 100 ng / ml Activin A und 1 nM Wortmannin für 4 Tage (Tag 0-Tag 4) mit Medien ergänzt täglich ändern. </li><li> Nach DE Induktion beendet war, wurde Pankreas-Vorläuferzellen Induktion durch Veränderung der Medien zu DMEM induziert: F12 mit B27, 0,2% BSA und KAAD-Cyclopamin bei 0,2 pM Konzentration für 24 Stunden (Tag 4-Tage-5) ergänzt. </li><li> Nach 24 Stunden wurde auf Medien DMEM geändert: F12 ergänzt mit B27, 0,2% BSA, KAAD-Cyclopamin bei 0,2 pM Konzentration und all-trans-Retinsäure auf 2 pM Konzentration für 3 Tage mit den Medien jeden Tag ändern (Tag 5-Tages-8) . </li></ol> 4. Pankreas-Reifung <ol><li> Nach PP Induktion wurden alle Gruppen zur Reifung Medien aus DMEM geändert: F12 mit B27, 0,2% BSA, 10 mM Nicotinamid, 25 ug / ml Insulin, 30 nM Na 2 SeO 3 und 50 pg / ml Transferrin für 2 d ergänztays mit Medien jeden Tag ändern (Tag 8-Tag 10). </li><li> Nach 2 Tagen in Medien Reifung wird die endgültige Reifung Schritt aus parallel unter Verwendung von verschiedenen Bedingungen zum Vergleich durchgeführt. (I) der Kerbe Inhibitor DAPT (ii) unter Verwendung von Co-Kulturmedium nur ohne endothelialen Zellen als Kontrolle und (iii) mit Kontakt Co-Kultur mit RHMVEC Zellen: Die Differenzierung wurde unter den folgenden Bedingungen induziert. Die Zellen wurden in DAPT oder Co-Kultur-Medien für eine Woche aufrecht erhalten (Tag 10-Tage-17) mit den Medien täglich ändern. <ol><li> DAPT Medien wurde durch eine Ergänzung der Reifung Medien mit 30 uM DAPT vorbereitet. Die Zellen in dieser Gruppe wurden zunächst ausgesetzt MCDB131 für 24 Stunden abzuschließen und dann zu DAPT Medien ausgesetzt für 6 Tage (Tag 11-Tage-17). </li><li> Co-Kulturmedium wurde durch Hinzufügung MCDB-131 hergestellt Medien mit B27, 0,2% BSA, 10 mM Nicotinamid, 10 ng / ml EGF, 1 pg / ml Hydrocortison, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml Heparin. Für die media control Zustand differenzierenden Zellen ausgesetzt waren,um MCDB-131 vollständig Weg für 24 Stunden (Tag 10-Tage-11), nach der die Medien, um die Zusammenarbeit Kulturmedien für 6 Tage (Tag 11-Tag 17) (keine Endothelzellen) geändert wurde. </li><li> Für den Kontakt Co-Kultur Bedingungen wurde eine Million RHMVEC den differenzierenden Zellen in völliger MCDB-131 Medien (VEC Technologien) für 24 Stunden (Tag 10-Tage-11) zugegeben, um die Befestigung zu ermöglichen. Nach 24 Stunden wurde auf Medien Co-Kultur-Medien für 6 Tage (Tag 11-Tage-17) mit den Medien verändert sich täglich ändern. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR-Analyse <ol><li> Am Ende jeder Phase der Differenzierung (Endoderm, Pankreas-Vorläuferzellen, reife Insel) wurden lysiert und RNA wurde unter Verwendung NucleoSpin RNA II-Extraktions-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> RNA-Qualität wurde durch Prüfen RNA Absorption bei 260 nm und 280 nm, gefolgt von RNA-Quantifizierung unter Verwendung eines SmartSpec Zzgl. Spektrophotometer analysiert. </li><li> Die reverse Transkription wurde unter Verwendung ImProm II reverse Transkription kes nach den Anweisungen des Herstellers. Alle Reaktionen wurden mit 100 ng RNA durchgeführt. </li><li> qRT-PCR erfolgte unter Verwendung des Mx3005P QPCR System (Agilent) und Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix nach Anweisungen des Herstellers. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Initialisierung Schritt wurde bei 50 ° C für 2 Minuten bei 95 ° C für 10 Minuten. 50 Amplifikationszyklen wurden wie folgt durchgeführt: 95 ° C für 30 Sekunden, 54 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute. </li><li> Fache Änderung der Ziel-mRNA-Expression in undifferenzierten Zellen wurde aus CT-Werte nach folgenden Formeln berechnet: ΔCT (Markierung i) = CT (Markierung I) - CT (GAPDH) Δ ΔCT (Markierung i) = ΔCT (Markierung i) (Sample) - ΔCT (Markierung i) (undifferenzierte Zellen) Relativen Expression (Markierung i) = 2-ΔΔCT(Marker-i) </li></ol> 6. Immunzytochemie <ol><li> Am Ende jeder Phase der Differenzierung (Endoderm, Pankreas-Vorläuferzellen, reife Insel-Zellen) wurden in 4% Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. </li><li> Die fixierten Zellen wurden permeabilisiert mit 0,25% Triton X-100 (TX) für 15 Minuten. </li><li> Nicht-spezifische Färbung wurde durch Inkubation in 10% Eselserum in 0,05% für 30 Minuten blockiert TX. </li><li> Der primäre Antikörper Inkubation wurde über Nacht bei 4 ° C in Blocking-Puffer in der empfohlenen Antikörper-Verdünnung (siehe Tabelle 1). </li><li> Die Zellen wurden mit 0,05% TX dreimal für 5 Minuten gewaschen. </li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln mit geeigneten Antikörpern in Blocking-Puffer verdünnt durchgeführt. </li><li> Die Zellen wurden mit 0,05% TX dreimal für 5 Minuten gewaschen. </li><li> Kernfärbung wurde durch Inkubation mit Hoechst durchgeführt Tinte in einer Verdünnung von 1:1000 in PBSfür 5 Minuten mit 3 Waschschritten mit PBS. </li><li> Fixierten und gefärbten Zellen wurden aufgenommen mit Olympus IX81 inversen Mikroskop und Metamorph Imaging-Software. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Die Zugabe von Activin A und Wortmannin undifferenzierte HES für 4 Tage induziert endgültigen Endoderm durch qRT-PCR-Analyse für DE Marker Sox17, CXCR4, und Foxa2 bestätigt und Immunfärbung auf Sox17 wie in 2 dargestellt. Abgrenzung zu Pankreas-Vorläuferzellen nach Zugabe von Cyclopamin und Retinsäure wurde durch qRT-PCR von Pankreas-Vorläuferzellen Marker und Immunfärbung für Pdx1 wie in 3 dargestellt bestätigt. In der letzten Stufe der Differenzierung, wenden Sie sich Co-Kultur mit RHMVEC Zellen stark induziert Hochregulierung der Insulin-Expression in den humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen. Die Effizienz der Co-Kultur vermittelten Differenzierung wurde durch die gleichzeitige Analysemparing mit Kontrollbedingung mit DAPT. DAPT wurde als positive Kontrolle verwendet, da es derzeit eine der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Reifung Pankreas zu erreichen. Da die Co-Kultur in einem modifizierten Medienstroms durch Faktoren unterstützt Endothelzellen ergänzt durchgeführt wurde, wurde zusätzliches Steuerelement mit den Medien in Abwesenheit von Endothelzellen, um die Wirkung von Medien auf die Differenzierung zu verifizieren. Details zu dieser Analyse sind in Abbildung 4 dargestellt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mehrstufige Protokoll für die Differenzierung von hES in Insulin exprimierenden Zellen. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> 2. Definitive Endoderm Induktion von humanen embryonalen Stammzellen. A) qRT-PCR-Analyse der repräsentativen DE Marker in HES Zellen, die A und Wortmannin für 4 Tage Activin. Ergebnisse ar<html> e, bezogen auf undifferenzierte HES normalisiert. B) Sox17 Färbung (grün) und DAPI (blau) zeigen nukleare Expression von Sox17. Maßstab: 50 um. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Abbildung 3. Pankreas-Vorläuferzellen Induktion des embryonalen Stammzellen abgeleitet Entodermzellen. A) qRT-PCR-Analyse der frühen Pankreas-Marker im HES abgeleitet Entodermzellen ausgesetzt Cyclopamin und Retinsäure für 4 Tage nach der DE Induktion. Die in Bezug auf undifferenzierte HES normalisiert. B) Pdx1 Färbung (violett) und DAPI (blau) zeigen nukleare Expression von Pdx1. Maßstab: 50 um. &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Abbildung 4. Pancreatic Reifung Stufe A) qRT-PCR-Analyse von Pankreas-Hormone im menschlichen embryonalen Stammzellen nach Pankreas-Reifung mit DAPT, wenden Sie sich Co-Kultur-oder Co-Kultur-Medien (Kontrolle). Die in Bezug auf undifferenzierte HES normalisiert. p erhaltenen Werte von Student t-Tests. B) Co-Kultur mit Dil-Ac-LDL beschriftet RHMVEC (Rot) zeigen Regionen, in denen ECs auf den Teller legen, wenn es leere Räume (oben) sind, können andere RHMVEC in direkten Kontakt mit der differenzierenden ESC (unten) zu finden. C) C-Peptid (grün) Färbung für Zellen differenziert mit Co-Kultur-Methode. Maßstab: 12,5 um (oben) und 50 um (unten) D) Immunfärbung von RHMVEC zeigt kein Insulin Ausdruck in der RHMVEC. <table border="1"><tbody><tr><td> Marker </td><td> Primer1 (5 &#39;nach 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;nach 3&#39;) </td><td> Ref </td></tr><tr><td> Sox17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Foxa2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Isl1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> GLUCAGON </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INSULIN </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Primer für die qPCR-Reaktionen verwendet.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Während Bauchspeicheldrüsenentwicklung sind Differenzieren Pankreaszellen in unmittelbarer Nähe mit Endothelzellen aus der Aorta, ferner sind Pankreasinseln dicht vaskularisiert raschen Austausch von Blutglukose und Inselhormone zu präsentieren. Angesichts dieser Tatsachen ist es nicht verwunderlich, dass Endothelzellen eine wichtige Rolle im Prozess der Organogenese Pankreas spielen. Während die Bedeutung von Endothelzellen während der Pankreas-Entwicklung wird zunehmend geschätzt wird seine Rolle bei der in vitro<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Die Konzentrationen </td></tr><tr><td> mTeSR1 (mit Zuschlag) </td><td> Stammzellentechnologien </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC qualifizierte Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Complete) </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activin A </td><td> F &amp; E </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1 &amp;mgr; M </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0,2 um </td></tr><tr><td> All-trans-Retinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2 &amp;mgr; m </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nicotinamid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> F &amp; E </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Technologies </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II Reverse Transkription-System </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 polyklonaler Ziege-IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 polyklonaler Ziege-IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptid Kaninchen polyklonale </td><td> Cell Signaling </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Ziege-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Kits.

endothelial cell co-kultur vermittelt reifung von humanen embryonalen stammzellen zu pankreas-insulin-produzierenden zellen in einer gerichteten differenzierung ansatz

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonale Stammzellen (ESC) haben zwei wesentliche Eigenschaften: Sie können unbegrenzt in vitro vermehrt in einem undifferenzierten Zustand und sie sind pluripotent, somit die Möglichkeit besteht, sich in verschiedene Linien zu differenzieren. Solche Eigenschaften machen WSR äußerst attraktiv für die Zell-basierte Therapie und regenerative Behandlung Anwendungen ein. Jedoch für das volle Potenzial realisiert werden die Zellen zu reifen und funktionellen Phänotypen, die eine schwierige Aufgabe ist unterschieden werden. Ein vielversprechender Ansatz bei der Induktion der zellulären Differenzierung ist es, genau imitieren den Pfad der Organogenese in der In-vitro-Einstellung. Pankreas-Entwicklung ist bekannt, dass in bestimmten Stufen 2 auftreten, beginnend mit Entoderm, die in mehrere Organe, einschließlich Leber und Bauchspeicheldrüse entwickeln können. Endoderm Induktion durch Modulation des Knotenkörpers Weg durch Zugabe von Activin A 3 in Kombination mit mehreren Wachstumsfaktoren 4-7 erreicht werden </sup&gt;. Definitive Entodermzellen dann einer Pankreas-Einsatz durch Hemmung der Sonic-Hedgehog-Hemmung, die in vitro durch Zugabe von Cyclopamin 8 erreicht werden. Pankreas-Reifung wird durch mehrere parallele Ereignisse einschließlich der Hemmung der Notch-vermittelt; Aggregation von Pankreas-Vorläuferzellen in 3-dimensionale Cluster; Induktion der Vaskularisierung; um einige zu nennen. Mit Abstand das erfolgreichste in-vitro-Reifung der ESC abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen wurden durch Hemmung der Notch-Signalweg durch DAPT Supplementierung 9 erreicht worden. Obwohl erfolgreich, führt dies zu geringen Ausbeute des reifen Phänotyp mit eingeschränkter Funktionalität. Ein weniger erforschtes Gebiet ist die Wirkung von Endothelzellen Signalgebung in der Bauchspeicheldrüse Reifung, die zunehmend als wichtiger Faktor in In-vivo-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Reifung 10,11 geschätzt. Die aktuelle Studie untersucht, wie Wirkung von Endothelial Zellsignalen in Reifung menschlicher ESC abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin produzierenden Inselzellen-Zellen. Wir berichten über einen mehrstufigen gerichtete Differenzierung Protokoll, bei dem die menschlichen WSR zuerst in Richtung Endoderm von Activin A zusammen mit der Hemmung der PI3K induziert. Pancreatic Spezifikation von Entoderm-Zellen wird durch Hemmung der Sonic-Hedgehog-Signalgebung durch Cyclopamin zusammen mit Retinoid-Induktion durch Zugabe von Retinsäure erzielt. Die letzte Stufe der Reifung wird durch Endothelzellen Signalisierung durch eine Co-Kultur-Konfiguration erreicht induziert. Während mehrere Endothelzellen in der Co-Kultur getestet worden, hier präsentieren wir unsere Daten mit Ratten-Herzen mikrovaskulären Endothelzellen (RHMVEC), vor allem für die Analyse erleichtern.

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Embryonale Stammzellen (ESC) weisen zwei Hauptmerkmale auf: Sie können in vitro in einem undifferenzierten Zustand unbegrenzt propagiert werden und sie sind ...

Dieses Protokoll beschreibt die mehrstufige Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen als effektive Methode zur Herstellung insulinproduzierender Zellen mit einer höheren Ausbeute als bisher entwickelte Protokolle. Zunächst wird das definitive Endoderm durch Aktivierung von Akt und eines PI3K-Inhibitors induziert. Anschließend erfolgt die Induktion von Pankreasvorläuferzellen durch Behandlung mit Aktivin A und Retinsäure. Danach wird eine Ko-Kultivierung mit endothelialen Zellen durchgeführt, um die Reifung der Pankreasvorläufer zu insulinexprimierenden Zellen zu unterstützen.Fahren Sie mit funktionellen Analysen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und qPCR fort, um die Expression von C-Peptid und die Hochregulation von Insulin nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie beispielsweise nicht, ist, dass diese Methode zu einer stärkeren Hochregulation von Insulin sowie zu einer höheren Ausbeute an C-Peptid in exprimierenden Zellen führt. Kultivieren Sie menschliche embryonale Stammzellkolonien auf eine Größe zwischen einem und 1,5 Millimetern Durchmesser, um die Zellen CO zu 12.In der Zwischenzeit Platte mit einem Milliliter pro Vertiefung HESC-Matrigel, verdünnt in D-M-E-M-F-12-Medium, vorbereiten, das Medium von den HSCs abpipettieren und durch MTS eins ersetzen. Anschließend die Zellen durch Abkratzen gewinnen. In ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben, frisches MTR eins hinzufügen und dann im Aufteilungsverhältnis 1 zu 4 in die zuvor mit Matrigel beschichteten Vertiefungen einer 12-Loch-Platte aussäen.Sobald sich die proliferierenden Zellen auf einen Durchmesser von einem bis 1,5 Millimetern ausgedehnt haben, wird die Differenzierung durch Zugabe eines definitiven Endoderm-Induktionsmediums, das aktiv in a und den PI-3-K-Inhibitor enthält, eingeleitet. Die Kultur wird vier Tage lang gezüchtet.Ersetzen Sie das Medium täglich. Fahren Sie mit der Induktion der Pankreasprogenitoren fort, indem Sie zunächst 24 Stunden in vollständigem D-M-E-M-F 12, das 0,2 Mikromolar KAAD-Cyclodopamin enthält, kultivieren. Danach wechseln Sie das Medium zu vollständigem D-M-E-M-F 12, das 0,2 Mikromolar KAAD-Cyclodopamin und zwei Mikromolar All-trans-Retinsäure enthält, und inkubieren Sie drei Tage lang, wobei Sie das Medium täglich erneuern.Die Zellen zwei Tage in Reifungsmedium kultivieren, bevor der letzte Reifungsschritt als positiver Kontrollansatz für die in-vivo-Reifung von aus ESC abgeleiteten pankreatischen Vorläuferzellen in Gegenwart des Notch-Inhibitors DAPT vor der Aufspaltung durchgeführt wird. Die endothelialen Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, anschließend trypsieren und die Zellen für die Kontakt-Kokulturbedingung zählen. 1 Million rat heart microvascular endothelial cells zu den differenzierenden Zellen in vollständigem MCDB 131-Medium hinzufügen.Bereiten Sie außerdem eine Kontrollkultur mit nur Co-Kulturmedien und unseren endothelialen Zellen vor. Stellen Sie alle Behandlungsbedingungen sechs Tage lang in einen Inkubator mit Medienwechsel. Sammeln Sie täglich Zellen als Proben vom Ende jedes Differenzierungsstadiums. Extrahieren Sie RNAs aus Endoderm, pankreatischen Vorläuferzellen und reifen Inselzellen mit einem Nucleospin E-R-R-N-A-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie die RNA-Qualität mithilfe eines Smart Spec Plus-Spektrophotometers und einer Quarzzelle anhand des Absorptionsverhältnisses von 260 Nanometern zu 280 Nanometern. Berechnen Sie außerdem die Probenkonzentrationen mit 100 Nanogramm RNA-Vorlage pro Probe.Führen Sie RT-Reaktionen mit dem Impromptu-Reversen-Transkriptionskit durch. Fahren Sie fort, indem Sie die QPCR mit den gezeigten Primern einrichten, die Reaktionen auf den Thermocycler laden und das QPCR-Programm durchführen. Berechnen Sie anschließend anhand der CT-Werte die Faltungsänderung der Ziel-mRNA-Expression im Vergleich zu undifferenzierten Zellen am Ende jedes Differenzierungsstadiums.Festlegung der Zellen mit 4% Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend mit 0,25% Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisieren, um unspezifische Färbungen zu blockieren. 10% Essserum in 0,05% TX für 30 Minuten hinzufügen.Fügen Sie anschließend den Primärantikörper in Blockierpuffer hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Proben fünf Minuten lang mit 0,05 % Triton X. Geben Sie dann den in Blockierpuffer verdünnten Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.Führen Sie drei Fünf-Minuten-Waschschritte mit 0,05 % x durch, um die Kerne bei Pferde-Färbung bei einer Verdünnung von 1 zu 1000 zu belassen. In PBS für fünf Minuten inkubieren, gefolgt von drei Waschungen mit PBS. Nehmen Sie Bilder der fixierten und gefärbten Zellen mithilfe eines inversen Mikroskops und einer Bildgebungssoftware auf.Die Zugabe von aktivem in a und Wart manin zu undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen über vier Tage induziert definitives Endoderm. Die Q-R-T-P-C-R-Analyse bestätigte das Vorhandensein der erwarteten Marker für definitives Endoderm: SOX 17, CXCR vier und Fox A zwei.Die Immunfärbung für SOX 17 in Grün zeigt hier eine Kolokalisation mit dem blau mit DAPI gefärbten Zellkern. Die Differenzierung zu pankreatischen Vorläuferzellen nach Zugabe von Cyclo, Amin und Retinsäure wurde durch Q-R-T-P-C-R von Markern pankreatischer Vorläuferzellen sowie durch Immunfärbung für PDX1 bestätigt. Im Endstadium der Differenzierung induzierte die Kontakt-Kokultur mit mikrovaskulären endothelialen Zellen des Rattenherzens eine starke Hochregulation der Insulinexpression in den aus HES-Zellen abgeleiteten pankreatischen Vorläuferzellen.L-Ko-Kulturen mit AC-LDL-markierten RHM-VEC zeigen Bereiche, in denen ECS an die Platte angeheftet sind. Sofern Lücken vorhanden sind, finden sich andere RHM-VEC in direktem Kontakt mit den differenzierenden ESC, wie erwartet. Die Immunfärbung von RHM-VEC zeigt keinen nachweisbaren Insulinausdruck.Die Eptid-Färbung ist ebenfalls ein nützlicher Marker für Zellen, die nach ihrer Entwicklung mittels der Co-Kultur-Methode differenziert wurden. Dieses Verfahren ermöglichte die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen während des Differenzierungsprozesses von Stammzellen, was offensichtlich die Funktionalität des ausgereiften Phänotyps erhöht.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz (Video) | JoVE Journal

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