TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung Vibrio cholerae On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vio-Cray genetisch mittels dieser schnellen und defizienten Methode zu verändern, die auf natürlicher Transformation und Flip-Kombination basiert. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geeignete Chitinquelle vorbereitet wird, da Chitin der natürliche Induktor der Transformation ist. Im zweiten Schritt wird ein DNA-Konstrukt mittels zweier PCR-Runden erzeugt, und anschließend erfolgt die natürliche Transformation, wodurch das Plasmid PBR Flip tragende Bakterien das PCR-Fragment aufnehmen und in ihr Genom integrieren können.

Anschließend wird eine Temperaturerhöhung verwendet, um das plasmidkodierte Lipase-Enzym zur Entfernung der durch Flip-Rekombinationsstelle (FRT-Stelle) flankierten Antibiotikaresistenzkassette zu induzieren. Im letzten Schritt werden die Bakterien des FLP-kodierenden Plasmids entledigt. Abschließend werden PCR und Sequenzierung eingesetzt, um zu zeigen, dass die genetische Modifikation erfolgreich war.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung von Suizid-Plasmiden zur genetischen Manipulation von Viren, liegt darin, dass diese Methode sehr schnell und effizient ist. Wiegen Sie zunächst 50 bis 80 Milligramm Chitin-Flocken in standardmäßigen 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen ab, lassen Sie die Röhrchendeckel geöffnet und autoklavieren Sie die Flocken. Sobald der Autoklavvorgang beendet ist, schließen Sie unverzüglich die Deckel und lagern Sie die autoklavierten Chitin-Flocken bei Raumtemperatur. Mindestens sechs Oligonukleotide sind erforderlich, um die gewünschten DNA-Bereiche sowie die durch FRT-Sequenzen flankierte Antibiotikakassette mittels PCR zu amplifizieren. Es wird außerdem empfohlen, ein Paar Oligonukleotid-Primer außerhalb des eingefügten PCR-Fragments zu verwenden.

Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und korrekten Entfernung der von FRT-Sequenzen flankierten Antibiotikaresistenzkassette, der Oligonukleotide Nummer zwei, Nummer drei, Nummer vier und Nummer fünf, mit Sorgfalt. Die Primer Nummer zwei und fünf sollten mindestens 28 Basenpaare enthalten, um ausreichend an die genomische DNA und die Primer binden zu können. Die Primer drei und vier sollten unter Verwendung eines Plasmids, das eine FRT-Sequenz enthält, als Vorlage konstruiert werden; die Primer zwei und fünf sollten so entworfen werden, dass eine umfangreiche komplementäre Basenpaarung am 5'-Ende zwischen den Primern zwei und drei sowie zwischen den Primern vier und fünf jeweils ermöglicht wird.

Verwenden Sie nun für die erste PCR-Runde die Oligonukleotide eins und zwei, um die erste von drei gleichzeitigen, aber unabhängigen PCR-Reaktionen vorzubereiten, mit der der upstream gelegene Bereich der experimentellen Region des Interesses in den maßgeschneiderten Konstrukten amplifiziert wird. Parallel dazu bereiten Sie die zweite PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide drei und vier vor, um die durch FRT flankierte Antibiotikakassette zu amplifizieren. Beispielsweise wurde in diesem Experiment das APH-Gen, das für Kanamycinresistenz kodiert, verwendet.

Amplifizieren Sie gleichzeitig den downstream gelegenen DNA-Bereich, indem Sie die dritte PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden fünf und sechs sowie genomischer DNA als Vorlage vorbereiten. Starten Sie anschließend die PCR-Reaktion für alle drei Proben, nachdem alle drei PCR-Fragmente gereinigt wurden. Verwenden Sie ein Gemisch mit gleichen Mengen aller drei in der ersten Runde erhaltenen Fragmente als Vorlage, um eine zweite PCR-Runde durchzuführen. Diese Amplifikation wird durch die Oligonukleotide eins und sechs katalysiert.

Das resultierende PCR-Fragment dient als transformierende DNA in den Experimenten zur natürlichen Transformation. Nach dem Anzüchten von V. cholerae-Zellen in aerob angereichertem Medium bei 30 Grad Celsius. Die Bakterien durch Zentrifugation bei Raumtemperatur gewinnen.

Überführen Sie als Nächstes die Bakterienkultur in Form von Flocken auf den Drachen und inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht bei 30 Grad Celsius. Geben Sie danach vorsichtig mindestens 200 Nanogramm der aus der zweiten PCR-Runde stammenden Fragmente in die Bakteriensuspension. Achten Sie darauf, die Bakterien nicht stark von den Chitinoberflächen zu lösen, und inkubieren Sie diese Lösung anschließend einen weiteren Tag lang bei 30 Grad Celsius ohne Bewegung.

Vortexen Sie nun die Kultur mindestens 30 Sekunden intensiv; geben Sie 100 bis 300 Mikroliter der Zelllösung auf doppelt selektive Platten, die Ampicillin sowie ein weiteres Antibiotikum enthalten. Inkubieren Sie die Bakterienkulturen bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar sind. Isolieren Sie anschließend die einzelnen Transformanten von den selektiven Platten.

Beginnen Sie diesen Schritt mit dem Anzüchten der Bakterien auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Als optionaler Schritt kann die Temperatur für zwei bis drei Stunden auf 40 Grad Celsius erhöht werden, da die Expression von Flip aus dem PBR-Flip-Plasmid bei höheren Temperaturen dereprimiert wird. Nach weiteren acht Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius überführen Sie die Bakterien auf frische Platten.

Jetzt die Klone parallel auf Antibiotikahaltigen und antibiotikafreien Agarplatten einschränken, um die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu testen, und anschließend eine einzelne resultierende, antibiotikasensitive Kolonie isolieren. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius in einem Medium ohne Antibiotika anreichern. Am nächsten Morgen eine neue Kultur für drei bis sechs Stunden ansetzen, indem Sie die Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 in frisches, antibiotikafreies Medium verdünnen. Am Nachmittag erfolgt die Strich- oder Plattendilution der Kultur auf einfachen LB-Agarplatten, gefolgt von einer Inkubation der Platten für weitere acht bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius, bis die Kolonien sichtbar sind.

In diesem ersten Experiment, das darauf abzielte, die benachbarten Gene CTXA und CTXB zu löschen, wurden die Oligonukleotide für die trans-Flip-Methode wie gerade gezeigt generiert. Der Stamm der Ausgangslinie, der Zwischenstamm, der das durch FRT flankierte Antibiotikaresistenzkassette anstelle des ursprünglichen DNA-Lokus von C-T-X-A-B enthält, sowie der endgültige Stamm, bei dem C-T-X-A-B gelöscht und die Resistenzkassette entfernt wurde, wurden alle auf ihr Genotyp hinsichtlich einer Gesamt-PCR überprüft. Für dieses Experiment wurde eine PCR mit Primern durchgeführt, die nicht an das transformierende PCR-Fragment, sondern ausschließlich an die chromosomale DNA binden. Die PCR-Fragmente wurden mittels standardmäßiger Agarose-Gelelektrophorese getrennt, um ihre Größe zu bestimmen.

In Spur eins befand sich der Welttyp-B-Cholera-Stamm bei der erwarteten Fragmentgröße von 3.143 Basenpaaren. In Spur zwei befand sich das PCR-Fragment, das vom Stamm delta C-T-X-A-B-F-R-T FRT abgeleitet war, bei 3.162 Basenpaaren.

Und in Bahn drei befand sich das Delta-ctxA-B-FFR-TP-CR-Fragment bei 1.769 Basenpaaren im Vergleich zur 1-KB-Leiter. Im zweiten Beispiel, bei dem eine gesamte genomische Insel entfernt wurde, wurde die Vibrio-Pathogenitätsinsel eins oder VPI eins als Ziel für dieses Experiment gewählt. Die Trans-Flip-Methode wurde in zwei Schritten modifiziert.

Zunächst erfolgte die Integration des Kanamycin-Resistenzgens durch eine einzelne FRT-Stelle am Anfang der Pathogenitätsinsel eins. Anschließend wurde eine zweite Runde der natürlichen Transformation durchgeführt, die die Einfügung eines zusätzlichen Antibiotikaresistenzmarkers ermöglichte, nämlich der Gentamicin-Resistenz, gefolgt von einer zweiten FRT-Stelle am Ende der Pathogenitätsinsel. Die jeweiligen Primerpaare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben, und die trans-FLP-Methode wurde wie gerade gezeigt fortgesetzt.

Die elterlichen, intermediären und endgültigen Stämme wurden alle durch PCR der gereinigten genomischen DNA in Lane eins verifiziert. Das PCR-Fragment des Wildtyp-Stamms von V. cholerae wurde in Lane zwei laufengelassen. Das durch den Stamm VPI-1-FRT::GM-FRT erzeugte PCR-Fragment wurde laufengelassen.

Und in Spur drei wurde das PCR-Produkt des Stammes delta VPI one FRT analysiert. Die Primerpaare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben. Der endgültige Stamm fehlt das gesamte VPI one.

Im dritten Beispiel wurde eine T7-RNA-Polymerase-abhängige Promotorsequenz mithilfe der Trans-Flip-Methode mit geringfügiger Abwandlung des Standardprotokolls upstream in das Gen T fox, einen wichtigen Regulator der natürlichen Transformation, integriert. Die Konsensussequenz des T7-RNA-abhängigen Promotors wurde als Überhänge in die Oligonukleotide Nummer vier und Nummer fünf eingefügt, sodass diese DNA-Sequenz im Chromosom erhalten blieb. Nachdem das Antibiotikaresistenzkassette entfernt worden war, wurde der Konstrukt in einen T7-RNA-Polymerase-enthaltenden V-colorisierten Stamm integriert.

In diesem Stamm wurde die Expression des T7-RNA-Polymerase-Gens durch den LAC UV5-Promotor gesteuert, um die T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression von T Fox zu testen. Natürliche Transformationsassays wurden in LB-Medium durchgeführt. Der Elternstamm, dem der T7-abhängige Promotor vor dem Gen T Fox fehlt, ist unter diesen Bedingungen aufgrund der fehlenden T-FOX-Transkription in reichem Medium und in Abwesenheit seines natürlichen Induktors Chitin nicht natürlich transformierbar. Dieses Phänotyp war unabhängig davon, ob die T7-RNA-Polymerase künstlich durch IPTG induziert wurde oder nicht.

Allerdings war der trans-flip-erzeugte Stamm, der den von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotor upstream des Kompetenzgens t fox enthält, tatsächlich aufgrund der Leckage des lacUV5-Promotors im LB-Medium in angereichertem Medium natürlich transformierbar. Die produzierte T7-RNA-Polymerase transkribierte bereits t fox vom T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor, ohne dass eine Induktion durch IPTG erfolgte. Dadurch wurde natürliche Kompetenz und Transformation ausgelöst, was die Funktionalität der integrierten, von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotorsequenz bestätigt.

Dieses Phänotyp wurde signifikant durch die vollständige Induktion der T7-RNA-Polymerase verstärkt, die durch die Zugabe des Induktors des lacUV5-Promotors IPTG ausgelöst wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Vibrio cholerae genetisch mittels einer Kombination aus chitininduzierter natürlicher Transformation und Flip-Rekombination verändert. Sobald diese Technik beherrscht ist, ermöglicht sie Ihnen, Gene oder genomische Inseln zu löschen sowie DNA-Sequenzen innerhalb weniger Tage gezielt an bestimmten Stellen einzufügen.