Name: TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung Vibrio cholerae On Natural Transformation und FLP-Rekombination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Erfahren Sie die TransFLP-Methode zur schnellen genetischen Veränderung von Vibrio cholerae mittels natürlicher Transformation und FLP-Rekombination. Diese Technik ermöglicht effiziente Genom-Editionierung für mikrobiologische Forschung.

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Ich möchte Olga de Souza Silva für die technische Unterstützung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Grant 31003A_127029 unterstützt.

Die TransFLP Methode (Abbildung 1) durch drei verschiedene Ansätze exemplifiziert: I) die Deletion von zwei benachbarten Genen Virulenzeigenschaften V. cholerae (zB ΔctxAB), II) die Entnahme einer Pathogenitätsinsel (zB ΔVPI-1), und III) die Integration eines T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz stromauf von einer Gen-von-Interesse, das anschließend erlaubt seinen künstliche Expression in dem jeweiligen Stamm Hintergrund (zB T7-tfox) (Abbildung 2). Ein. Vorbereitung der Chitin Flakes <ol><li> Gewicht 50-80 mg von Chitin Flocken in einem Standard 1,5 ml Plastikröhrchen. Dies kann in Substanz hergestellt werden. Chitin Flocken sind kommerziell erhältlich von Sigma (Kat. Zahl C9213). </li><li> Autoklavieren der Flocken halten die Deckel der Rohre offen. </li><li> Schließen Sie sofort die Deckel nach dem Autoklav abgekühlt hat. </li><li> Shop autoklaviert Chitin Flockenbei Raumtemperatur. </li></ol> 2. Optional: Artificial Transformation von V. cholerae mit Flp-Rekombinase-kodierende Plasmide <ol><li> Bereiten elektrokompetente V. cholerae Zellen unter Verwendung von Standardverfahren 11. Aliquots speichern kompetenter Zellen bei -80 ° C </li><li> Fügen Sie 1-2 ul einer regelmäßigen Mini-Präparation von Plasmid pBR-flp 5 zum elektrokompetente V. cholerae-Zellen und Übertragen der Mischung in eine Elektroporation Küvette (0,2 cm Spaltbreite). </li><li> Tragen Sie einen Puls bei 1,6 kV. </li><li> Fügen Sie 0,9 ml SOC-Medium, übertragen Sie leicht Zelle zu einer Standard-14-ml-Tube. Inkubieren unbewegten für 2,5 bis 3 Stunden bei 30 ° C. </li><li> Tafel 100 ul und 300 ul auf LB-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin und inkubieren bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Entschlacken einzigen Klon und speichern wie Glycerin Lager für zukünftige TransFLP Experimente. </li></ol> 3. Oligonukleotid Design und Polymerase-Kettenreaktion <ol><li> Mindestens sechs Oligonukleotiden erforderlich sind, um die DNA-Region (en) von Interesse als auch die FRT-Kassette flankiert Antibiotikums durch PCR (Abbildung 3) zu amplifizieren. Es empfiehlt sich, auch ein Paar von Oligonukleotiden Priming außerhalb des PCR-Fragment eingefügt. Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und Excision des korrekten FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette (z. B. als &quot;CHK-up&quot; und &quot;CHK-down&quot;-Primer in den 3 bis 5 dargestellt). </li><li> Entwerfen der Oligonukleotide # 2, # 3, # 4 und # 5 mit Sorgfalt. Sie sollten in der Lage sein, ausreichend annealen (zB ~ 28 bp) an die Template-DNA. Der Template-DNA genomische DNA ist (gDNA) zum Primern # 2 und # 5 und FRT-Kan-FRT-enthaltenden Plasmid-DNA, wie pROD17 12 und pBR-FRT-KAN-FRT (diese Studie) zum Primern # 3 und # 4 ( 3A). </li><li> Design Die Primer # 2 bis # 5 ermöglicht eine umfassende Basenpaarung an ihrem 5&#39;-Ende zwischen Nr. 2 / Nr. 3 und Nr. 4 / Nr. 5 bzw. (3A </strong&gt; Kasten). Zwei Runden PCR folgen. </li><li> Führen Sie drei unabhängige PCR-Reaktionen als 1 Runde der PCR. Die erste wird amplifizieren die upstream-Region des Gens / DNA-Bereich-von-Interesse mit Hilfe der Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 2. Das PCR sollte in einem Fragment von mindestens 500 bp in der Länge um eine homologe Rekombination in den Zellen ermöglichen führen. Kürzere Fragmente (~ 250 bp) eine ausreichende 8 sein, aber werden nicht empfohlen. </li><li> Parallel führt die zweite PCR, die die FRT-Kassette flankiert Antibiotikum verstärkt. Für die Beispiele hier bereitgestellten wir hauptsächlich verwendet aph (kan R). Verwendung Oligonukleotiden # 3 und # 4 für diese Reaktion (Abbildung 3A). </li><li> Begleitend verstärken die stromabwärts gelegenen DNA-Bereich durch PCR (drittes Beispiel). Das PCR-Fragment sollte ebenfalls mindestens 500 bp in der Länge sein. Durchführen der PCR mit gDNA als Template und Oligonukleotide # 5 und # 6 (Abbildung 3A). </li><li> Nach Reinigung aller drei PCRFragmente, führen Sie die 2. Runde der PCR. Verwenden Sie die gleiche Mischung aus allen drei Fragmente in der ersten Runde als Vorlage erhalten. Die Verstärkung wird durch Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 6 katalysiert. Das resultierende PCR-Fragment (3B) als transformierende DNA in der natürlichen Transformation Experiment (Abbildung 1). </li></ol> 4. Chitin-induzierte Natural Transformation <ol><li> Wachsen V. cholerae Zellen aerob in Vollmedium bei 30 ° C, bis sie eine optische Dichte erreicht bei 600 nm von etwa 0,5. </li><li> Ernte der Bakterien durch Zentrifugieren. Waschen Pellet einmal in definierten künstlichen Medium (DASW 6) vor Resuspendieren der Zellen in 2 Volumina DASW. 1 ml der Kultur auf 50-80 mg steriles Chitin Flocken (erläutert unter Punkt 1). Wenn Bakterien Hafen Plasmid pBR-flp (optional Punkt 2), Add Ampicillin (50 ug / ml) zu der Kultur. Inkubation bei 30 ° C für 16-24 Stunden ohne Bewegung. </li><li> Add &amp; ge; 200 ng des 2 nd-Runde PCR-abgeleiteten Fragment (erläutert unter Punkt 3). Vorsichtig mischen, ohne ausgiebig Ablösen der Bakterien von den Chitin Oberflächen. Inkubieren bei 30 ° C für 24 Stunden ohne Bewegung. </li><li> Vortex die Kultur ausgiebig für ≥ 30 sec. Verteilt 100-300 ul auf selektiven LB-Medium-Platten (zB Kanamycin oder Gentamicin-haltigen LB-Platten für die bereitgestellten Beispiele hier). Verwenden Sie doppelt selektiven Platten, wenn die Bakterien, die das Plasmid pBR-flp indem Ampicillin gleichzeitig die übrigen Antibiotika beherbergen. Inkubieren Platten bei 30 ° C für 16-24 h oder bis Kolonien sichtbar. </li><li> Isolieren einzelner Transformanten von selektiven Platten. Solche Transformanten haben den ursprünglichen chromosomalen Locus durch die PCR-Fragment durch eine doppelte Crossover-Ereignis ersetzt. Diese Stämme können direkt für weitere Versuche verwendet werden, falls das Entfernen des Antibiotikums Kassette nicht notwendig ist. </li></ol> 5. Entfernung von Selective Cassette (s) durch Flp-Rekombination <ol><li> Künstlich verwandeln Sie Ihr Transformanten mit Plasmid pBR-flp wie unter Punkt 2 beschrieben, wenn nicht vor dem natürlichen Transformation Assay. </li><li> Die Bakterien wachsen auf LB-Agarplatten mit Ampicillin bei 37 ° C für 16-24 Stunden. Optionen: Ändern Sie die Temperatur zwischen 2-3 Stunden auf 40 ° C als Ausdruck flp aus dem Plasmid pBR-flp bei höheren Temperaturen 5,10 de-unterdrückt; Übertragung Bakterien auf frische Platten nach ca. 8 h Inkubation. </li><li> Test für Antibiotika-Empfindlichkeit (hier für Kanamycin gezeigt; Abbildung 1) durch restreaking die Klone parallel auf Antibiotika-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten. Isolieren einzelner sensitive Kolonien. Frieren Ampicillin-resistente Klon als Glycerin Lager, wenn Sie weiter zu modifizieren die Belastung mit anderen Deletion / Insertion mit TransFLP wollen. </li></ol> 6. Plasmid Curing <ol><li> Wachsen Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen undbei 30 ° C. Verwenden Vollmedium ohne Zusatz von Antibiotika. </li><li> Optional: Wachsen frische Kultur für 3-6 Stunden durch Verdünnen der Übernachtkultur 1:100 in frischem Antibiotika-freien Mediums. </li><li> Platte oder Streifen Verdünnung (n) der Kultur auf einfache LB-Agarplatte (en) und Inkubation bei 30 ° C für 8-16 h (bis Kolonien sichtbar sind). </li><li> Test auf Ampicillin-Sensitivität der Klone durch restreaking die Klone, die parallel auf Antibiotikum-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten (Abbildung 1). Frieren Ampicillin-sensitiven Stamm wie Glycerin Lager. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die TransFLP oben beschriebenen Methode und anderswo 5 wurde ausgiebig in unserem Labor verwendet. Die Art der genetischen Manipulationen, die durchführbar sind, umfassen unter anderem: Deletion einzelner Gene und Gencluster, Deletion Genominseln (zB VPI-1), Insertion von Sequenzen stromaufwärts eines Gens von Interesse (z. B. Promotorsequenzen) und Einführen Sequenzen am Ende eines spezifischen Gens (zB Codierung Affinitätstags). Ein Import Voraussetzun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Chitin Flocken </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Autoklavieren erforderlich </td></tr><tr><td> OPTIONAL: Micropulser (bei Antibiotika-Kassette sollte durch Flp Rekombinase auf pBR-flp kodiert herausgeschnitten werden) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> Oder vergleichbare electroporators </td></tr></tbody></table>

transflp - eine methode zur genetischen veränderung<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; on natural transformation und flp-rekombination

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Mehrere Methoden stehen zur Verfügung, um zu manipulieren bakteriellen Chromosomen 1-3. Die meisten dieser Protokolle beruhen auf der Einbringung von konditional replizierende Plasmide (z. beherbergen pir-abhängigen oder temperaturempfindlichen Replikons 1,2). Diese Plasmide sind in bakteriellen Chromosomen auf Homologie-vermittelte Rekombination integriert. Solche Insertions-Mutanten werden häufig direkt in der experimentellen Einstellungen verwendet. Alternativ kann Selektion auf Plasmid Exzision durch seinen Verlust gefolgt durchgeführt werden, die für Gram-negative Bakterien häufig der Zähler wählbare Levansucrase Enzyms durch die sacB Gen 4 codiert wird. Die Excision kann entweder wieder die vor dem Einsetzen Genotyp oder führen zu einem Austausch zwischen dem Chromosom und dem Plasmid-kodierten Kopie des modifizierten Gens. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass es zeitraubend ist. Das Plasmid muss zuerst geklont werden, sondern erfordert horizontalen Transfer in V. cholerae (höchstens n<html> otably durch Paarung mit einem E. coli Donor-Stamm) oder künstliche Umwandlung der letzteren, und die Exzision des Plasmids ist zufällig und kann entweder wieder die anfängliche Genotyp oder erzeugen die gewünschte Modifikation, wenn kein positiver Selektion ausgeübt wird. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle Manipulation der V. cholerae-Chromosom (s) 5 (Abbildung 1). Diese TransFLP Verfahren basiert auf der kürzlich entdeckten Chitin-vermittelte Induktion der natürliche Kompetenz in diesem Organismus 6 und anderen Vertreter der Gattung Vibrio wie V. basierend fischeri 7. Natürliche Kompetenz ermöglicht die Aufnahme von freier DNA einschließlich PCR-generierten DNA-Fragmenten. Sobald aufgenommen, rekombiniert die DNA mit dem Chromosom bei Vorliegen einer minimalen von 250-500 bp der flankierenden homologen Bereich 8. Einschließlich einen Selektionsmarker in-zwischen diesen flankierenden Regionen ermöglicht eine einfache Erkennung von häufig auftretenden Transformanten. t &quot;&gt; Diese Methode kann für verschiedene genetische Manipulationen von V. cholerae verwendet werden und möglicherweise auch andere natürlich kompetente Bakterien. Wir bieten drei neue Beispiele, was man mit dieser Methode zusätzlich zu unseren bereits veröffentlichten Studie auf einzelne Gen-Deletionen und durchgeführt werden Neben der Affinität-tag-Sequenzen 5. Mehrere Optimierungsschritte über die erste Protokoll von Chitin-induzierte natürliche Transformation 6 sind in diesem TransFLP Protokoll aufgenommen. Dazu gehören unter anderem der Austausch von Krabben Granatsplitter durch kommerziell erhältliche Chitin Flocken 8, die Spende von PCR abgeleiteten DNA als transformierenden Materials 9, und die Addition von FLP-Rekombination Zielstellen (FRT) 5. FRT erlauben ortsspezifische Exzision des Selektionsmarkers durch die Rekombinase Flp 10 vermittelt.

Repräsentative Ergebnisse der drei Beispiele sind in den 4 bis 6 gezeigt. Der erste Ansatz, der die Streichung der benachbarten Gene ctxA und ctxB soll. Gemeinsam codieren die wichtigsten Virulenzfaktor von V. cholerae, Cholera-Toxin. Wir entwickelten Oligonukleotiden zur TransFLP Verfahren wie oben beschrieben und gemäß 3. Die elterliche Stamm wurden die Zwischenschicht Stamm, die FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette in der ursprünglic...

Eine schnelle Methode, um das Genom zu ändern<em&gt; V. cholerae</em&gt; Beschrieben. Diese Änderungen umfassen das Löschen von einzelnen Genen, Gen-Cluster und genomische Inseln sowie die Integration von kurzen Sequenzen (zB Promotorelemente oder Affinitäts-tag-Sequenzen). Das Verfahren basiert auf der natürlichen Transformation und FLP-Rekombination.

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Es stehen verschiedene Methoden zur Manipulation bakterieller Chromosomen zur Verfügung1-3. Die meisten dieser Protokolle basieren auf der Insertion konditional replikativer Plasmide ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vio-Cray genetisch mittels dieser schnellen und defizienten Methode zu verändern, die auf natürlicher Transformation und Flip-Kombination basiert. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geeignete Chitinquelle vorbereitet wird, da Chitin der natürliche Induktor der Transformation ist. Im zweiten Schritt wird ein DNA-Konstrukt mittels zweier PCR-Runden erzeugt, und anschließend erfolgt deren natürliche Transformation, wodurch das Plasmid PBR flip enthaltende Bakterien das PCR-Fragment aufnehmen und in ihr Genom integrieren können.Anschließend erfolgt eine Temperaturerhöhung zur Induktion des plasmidcodierten Lipaseenzyms, um die das Antibiotikaresistenzkassette flankierende Flip-Rekombinationstelle (FRT) zu entfernen. Im letzten Schritt werden die Bakterien von dem das FLP kodierenden Plasmid befreit. Abschließend werden PCR und Sequenzierung verwendet, um nachzuweisen, dass die genetische Modifikation erfolgreich war.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung von Suizid-Plasmiden zur genetischen Manipulation von Viren, liegt darin, dass diese Methode sehr schnell und effizient ist. Wiegen Sie zunächst 50 bis 80 Milligramm Proben von Chitin-Flocken in standardmäßigen 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen ab, lassen Sie die Deckel der Röhrchen geöffnet und autoklavieren Sie die Flocken. Sobald der Autoklav fertig ist, schließen Sie die Deckel unverzüglich und lagern Sie die autoklavierten Chitin-Flocken bei Raumtemperatur. Mindestens sechs Oligonukleotide sind erforderlich, um die DNA-Bereiche von Interesse sowie die durch FRT flankierte Antibiotika-Kassette mittels PCR zu amplifizieren. Es wird außerdem empfohlen, ein Paar Oligonukleotid-Primer außerhalb des eingefügten PCR-Fragments einzubeziehen.Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und der korrekten Entfernung der von FRT-Flanken umgebenen Antibiotikaresistenzkassette, der Oligonukleotide Nummer zwei, Nummer drei, Nummer vier und Nummer fünf, mit Sorgfalt. Die Primer Nummer zwei und fünf sollten mindestens 28 Basenpaare enthalten, um ausreichend an die genomische DNA und die Primer binden zu können. Die Primer drei und vier sollten unter Verwendung eines Plasmids, das eine FRT-Sequenz enthält, als Vorlage konstruiert werden; die Primer zwei und fünf sind so zu entwerfen, dass eine umfangreiche komplementäre Basenpaarung am 5′-Ende zwischen den Primern zwei und drei sowie zwischen den Primern vier und fünf jeweils ermöglicht wird.Nun führen Sie für die erste Runde der PCR mit den Oligonukleotiden eins und zwei die erste von drei gleichzeitigen, aber unabhängigen PCR-Reaktionen durch, um den upstream gelegenen Bereich des experimentellen Interessenbereichs der kundenspezifisch konzipierten Konstrukte zu amplifizieren. Parallel dazu bereiten Sie die zweite PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide drei und vier vor, um die durch FRT flankierte Antibiotika-Kassette zu amplifizieren. Beispielsweise wurde in diesem Experiment das APH-Gen, das für Kanamycinresistenz kodiert, verwendet.Amplifizieren Sie gleichzeitig den downstream gelegenen DNA-Abschnitt, indem Sie die dritte PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden fünf und sechs sowie genomischer DNA als Vorlage vorbereiten. Starten Sie anschließend die PCR-Reaktion für alle drei Proben, nachdem alle drei PCR-Fragmente gereinigt wurden. Verwenden Sie ein Gemisch mit gleichen Mengen der in der ersten Runde erhaltenen Fragmente als Vorlage, um eine zweite PCR-Runde durchzuführen. Diese Amplifikation wird durch die Oligonukleotide eins und sechs katalysiert.Das resultierende PCR-Fragment dient als transformierende DNA in den Experimenten zur natürlichen Transformation. Nach dem Anzüchten von V. cholerae-Zellen in angereichertem Medium unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius. Die Bakterien durch Zentrifugation bei Raumtemperatur gewinnen.Übertragen Sie als Nächstes die Bakterienkultur in Form von Flocken auf den Drachen und inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht bei 30 Grad Celsius. Geben Sie anschließend mindestens 200 Nanogramm der aus der zweiten PCR-Runde stammenden Fragmente vorsichtig in die Bakteriensuspension. Achten Sie darauf, die Bakterien nicht stark von den Chitinoberflächen zu lösen, und inkubieren Sie diese Lösung dann einen weiteren Tag lang bei 30 Grad Celsius ohne Bewegung.Nun vortexen Sie die Kultur mindestens 30 Sekunden lang kräftig und geben 100 bis 300 Mikroliter der Zelllösung auf doppelt selektive Platten, die Ampicillin sowie ein weiteres Antibiotikum enthalten. Inkubieren Sie die Bakterienkulturen bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar sind. Isolieren Sie anschließend die einzelnen Transformanten von den selektiven Platten.Beginnen Sie diesen Schritt mit dem Anzüchten der Bakterien auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Optional kann die Temperatur für zwei bis drei Stunden auf 40 Grad Celsius erhöht werden, da die Expression von flip aus dem PBR-flip-Plasmid bei höheren Temperaturen dereprimiert wird. Nach weiteren acht Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius werden die Bakterien auf frische Platten übertragen.Jetzt die Klone parallel auf Antibiotikahaltigen und antibiotikafreien Agarplatten einschränken, um die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu testen, und anschließend eine einzelne resultierende, antibiotikasensitive Kolonie isolieren. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius in einem Medium ohne Antibiotika anreichern. Am nächsten Morgen eine neue Kultur für drei bis sechs Stunden durch Verdünnen der Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 in frischem, antibiotikafreiem Medium aufziehen. Am Nachmittag erfolgt die Strich- oder Plattendilution der Kultur auf einfachen LB-Agarplatten, gefolgt von einer Inkubation der Platten für weitere acht bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius, bis die Kolonien sichtbar sind.In diesem ersten Experiment, das darauf abzielte, die benachbarten Gene CTXA und CTXB zu löschen, wurden die Oligonukleotide für die trans-Flip-Methode erzeugt, wie gerade am Elternstamm demonstriert. Der intermediäre Stamm, der die durch FRT flankierte Antibiotikaresistenzkassette anstelle des ursprünglichen DNA-Lokus von C-T-X-A-B enthält, sowie der finale Stamm, aus dem C-T-X-A-B gelöscht und die Resistenzkassette entfernt wurde, wurden alle auf ihr Genotypmuster getestet. Für dieses Experiment wurde eine komplette PCR durchgeführt, wobei Primer verwendet wurden, die nicht an das transformierende PCR-Fragment, sondern ausschließlich an die chromosomale DNA binden. Die PCR-Fragmente wurden mittels standardmäßiger Agarosegelelektrophorese getrennt, um ihre Größe zu bestimmen.In Spur eins befand sich der Weltstamm vom Typ B Cholera bei der erwarteten Fragmentgröße von 3.143 Basenpaaren. In Spur zwei befand sich das PCR-Fragment, das vom Stamm delta C-T-X-A-B-F-R-T kann. FRT stammt, bei 3.162 Basenpaaren.Und in Spur drei befand sich das Delta-ctxA-B-FFR-TP-CR-Fragment bei 1.769 Basenpaaren im Vergleich zur 1-KB-Leiter. Im zweiten Beispiel, bei dem eine gesamte genomische Insel entfernt wurde, wurde die Vibrio-Pathogenitätsinsel eins oder VPI eins als Ziel für dieses Experiment gewählt. Die Trans-Flip-Methode wurde in zwei Schritten modifiziert.Zunächst erfolgte die Integration des Kanamycin-Resistenzgens durch eine einzelne FRT-Stelle am Anfang der Pathogenitätsinsel eins. Anschließend wurde eine zweite Runde der natürlichen Transformation durchgeführt, die die Einfügung eines zusätzlichen Antibiotikaresistenzmarkers ermöglichte, nämlich der Gentamicin-Resistenz, gefolgt von einer zweiten FRT-Stelle am Ende der Pathogenitätsinsel. Die jeweiligen Primerpaare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben, und die trans-FLP-Methode wurde wie gerade gezeigt fortgesetzt.Die elterlichen, intermediären und endgültigen Stämme wurden alle durch PCR der gereinigten genomischen DNA in Lane eins verifiziert. Das PCR-Fragment des Wildtyp-Stamms von V. cholerae wurde in Lane zwei laufengelassen. Das durch den Stamm VPI-1-FRT::GM-FRT erzeugte PCR-Fragment wurde laufengelassen.Und in Spur drei wurde das aus dem Stamm delta VPI eins FRT abgeleitete PCR-Produkt analysiert. Die Primer-Paare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben. Der endgültige Stamm fehlt das gesamte VPI eins.Im dritten Beispiel wurde eine T7-RNA-Polymerase-abhängige Promotorsequenz mithilfe der Trans-Flip-Methode mit geringfügiger Abwandlung des Standardprotokolls upstream in das Gen T fox, einen wichtigen Regulator der natürlichen Transformation, integriert. Die Konsensussequenz des T7-RNA-abhängigen Promotors wurde als Überhänge in die Oligonukleotide Nummer vier und Nummer fünf eingefügt, sodass diese DNA-Sequenz im Chromosom erhalten blieb. Auch nach Entfernung des Antibiotikaresistenzkassette wurde der Konstrukt anschließend in einen T7-RNA-Polymerase-enthaltenden V-colorisierten Stamm integriert.In diesem Stamm wurde die Expression des T7-RNA-Polymerase-Gens durch den LAC UV5-Promotor gesteuert, um die T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression von T Fox zu testen. Natürliche Transformationsassays wurden in LB-Medium durchgeführt. Der Elternstamm, dem der T7-abhängige Promotor vor dem Gen T Fox fehlt, ist unter diesen Bedingungen aufgrund der fehlenden T-FOX-Transkription in reichem Medium und in Abwesenheit seines natürlichen Induktors Chitin nicht natürlich transformierbar. Dieses Phänotyp war unabhängig davon, ob die T7-RNA-Polymerase künstlich durch IPTG induziert wurde oder nicht.Jedoch war der Trans-Flip-Generierungsstamm, der den von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotor upstream des Kompetenzgens T Fox enthält, tatsächlich aufgrund der Leckage des LAC UV 5-Promotors im LB-Medium in der Lage, sich natürlich in Anreicherungsmedium zu transformieren. Die produzierte T7-RNA-Polymerase transkribierte bereits T Fox vom T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor, ohne dass eine Induktion durch IPTG erfolgte. Dies initiierte die natürliche Kompetenz und Transformation und bestätigte somit die Funktionalität der integrierten, von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotorsequenz.Dieses Phänotyp wurde signifikant verstärkt durch die vollständige Induktion der T7-RNA-Polymerase, die durch die Zugabe des Induktors des lacUV5-Promotors IPTG ausgelöst wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Vibrio cholerae genetisch mittels einer Kombination aus chitininduzierter natürlicher Transformation und Flip-Rekombination verändert. Sobald diese Technik beherrscht ist, ermöglicht sie das gezielte Löschen von Genen oder genomischen Inseln sowie die Integration von DNA-Sequenzen innerhalb weniger Tage auf site-direktionierte Weise.

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

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