TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung Vibrio cholerae On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Vio Cray mit dieser schnellen und defizitären Methode, die auf natürlicher Transformation und Flip-Kombination basiert, genetisch zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zuerst eine geeignete Chitinquelle vorbereitet wird, da Chitin der natürliche Induktor der Transformation ist. Während des zweiten Schritts wird ein DNA-Konstrukt unter Verwendung von zwei PCR-Runden erzeugt und deren natürliche Umwandlung durchgeführt, so dass die Plasmid-PBR-Flip-haltigen Bakterien das PCR-Fragment aufnehmen und in ihr Genom einbauen können.

Als nächstes wird eine Temperaturerhöhung verwendet, um das Plasmid-kodierte Lipase-Enzym zur Entfernung des Flip-Rekombinationsziels oder der von der FRT-Stelle flankierten Antibiotikaresistenzkassette zu induzieren. Im letzten Schritt werden die Bakterien von dem FLP-kodierenden Plasmid geheilt. Letztendlich werden PCR und Sequenzierung verwendet, um zu zeigen, dass die genetische Manipulation erfolgreich war.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Verwendung von Selbstmordplasmiden zur genetischen Manipulation von Vire, besteht darin, dass diese Methode sehr schnell und effizient ist. Beginnen Sie mit dem Wiegen von 50 bis 80 Milligramm Proben von Chitinflocken in Standard-1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen, halten Sie dann die Deckel der Röhrchen offen, autoklavieren Sie die Flocken, nachdem der Autoklav aufgerufen hat, schließen Sie sofort die Deckel und lagern Sie das Autoklaven-Kit in Flocken bei Raumtemperatur. Mindestens sechs Oligonukleotide sind erforderlich, um die DNA-Regionen von Interesse zu amplifizieren. sowie die FRT-flankierte Antibiotikakassette mittels PCR. Es wird auch empfohlen, ein Paar Oligonukleotid-Primer außerhalb des eingefügten PCR-Fragments einzuschließen.

Dies ermöglicht es, die Integration und korrekte Exzision des FRT-flankierten Antibiotikaresistenzkassettendesigns, der Oligonukleotide Nummer zwei, drei, vier und fünf, mit Vorsicht zu überprüfen. Die Primer zwei und fünf sollten mindestens 28 Basenpaare enthalten, um ausreichend auf der genomischen DNA und den Primern knien zu können. Die Primer drei und vier sollten mit einem FRT-Dosen-FRT, das Plasmid als Template enthält, konstruiert werden, um eine umfangreiche komplementäre Basenpaarung am Primzahlende von fünf zwischen den Primern zwei und drei bzw. den Primern vier und fünf zu ermöglichen.

Für die erste PCR-Runde verwenden Sie nun die Oligonukleotide eins und zwei, um die erste von drei gleichzeitigen, aber unabhängigen PCR-Reaktionen für die Amplifikation des stromaufwärts gelegenen Bereichs des experimentellen Bereichs von Interesse für die kundenspezifisch entwickelten Konstrukte vorzubereiten. Parallel dazu wird die zweite PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden drei und vier vorbereitet, um die FRT-flankierte Antibiotikakassette zu amplifizieren. In diesem Experiment wurde beispielsweise das A-PH-Gen verwendet, das für die Canin-Resistenz kodiert.

Gleichzeitige Amplifikation der stromabgewandten DNA-Region durch Vorbereitung der dritten PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide fünf und sechs und genomischer DNA als Vorlage. Starten Sie dann die PCR-Reaktion für alle drei Proben nach der Aufreinigung aller drei PCR-Fragmente und verwenden Sie eine Mischung mit gleichen Mengen aller drei Fragmente, die in der ersten Runde erhalten wurden, als Vorlage, um eine zweite PCR-Runde durchzuführen. Diese Amplifikation wird durch die Oligonukleotide eins und sechs katalysiert.

Das resultierende PCR-Fragment wird als transformierende DNA in den natürlichen Transformationsexperimenten dienen. Nach dem Züchten von Cholerazellen aerob angereichertes Medium bei 30 Grad Celsius. Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei Raumtemperatur.

Als nächstes überträgst du die Bakterienkultur in Flocken auf den Drachen und inkubierst die Zellsuspension über Nacht bei 30 Grad Celsius. Mischen Sie anschließend vorsichtig mindestens 200 Nanogramm der aus der zweiten PCR-Runde abgeleiteten Fragmente in die bakterielle Zellsuspension. Achten Sie darauf, dass sich die Bakterien nicht zu stark von den Chitinoberflächen lösen, und inkubieren Sie diese Lösung dann einen weiteren Tag lang unbewegt bei 30 Grad Celsius.

Nun Vortex, die Kultur für mindestens 30 Sekunden kräftig für Bakterien, die das PBR-Flip-Plasmid beherbergen, verteilen Sie 100 bis 300 Mikroliter der Zelllösung auf doppelt selektive Platten, die Ampicillin enthalten. Zusätzlich zu den anderen Antibiotika in den Platten inkubieren Sie die Bakterienzellkulturen bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar sind. Isolieren Sie dann die einzelnen Transformanten von den selektiven Platten.

Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Bakterien 16 bis 24 Stunden lang auf LB-Agarplatten züchten, die Ampicillin bei 37 Grad Celsius enthalten. Als optionaler Schritt ändern Sie die Temperatur für zwei bis drei Stunden auf 40 Grad Celsius, da die Expression von Flip aus dem PBR-Flip-Plasmid bei höheren Temperaturen unterdrückt wird. Nach weiteren acht Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius übertragen Sie die Bakterien auf frische Platten.

Beschränken Sie nun die Klone parallel auf antibiotikahaltige und antibiotikafreie Agarplatten, um auf Antibiotikaempfindlichkeit zu testen, und isolieren Sie dann eine einzelne resultierende antibiotikaempfindliche Kolonie. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius wachsen lassen und das Medium ohne Antibiotika anreichern. Am nächsten Morgen züchten Sie eine neue Kultur für drei bis sechs Stunden, indem Sie die Übernachtkultur im Verhältnis eins zu 100 in frischem, antibiotikafreiem Medium verdünnen, nachmittags oder durch Plattenverdünnung der Kultur auf einfache LB-Agarplatten und dann die Platten weitere acht bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren, bis die Kolonien sichtbar sind.

In diesem ersten Experiment ging es darum, die benachbarten Gene CTXA und CTXB zu löschen. Die Oligonukleotide für die trans-Flip-Methode wurden, wie gerade gezeigt, erzeugt: der Elternstamm, der Zwischenstamm, der die FRT-flankierte Antibiotikaresistenzkassette anstelle des ursprünglichen DNA-Locus von C-T-X-A-B beherbergt, und der endgültige Stamm, der für C-T-X-A-B deletiert und von der Resistenzkassette befreit wurde, wurden alle auf ihren Genotyp getestet. Die PCR wurde für dieses Experiment unter Verwendung von Primern durchgeführt, die nicht vor dem transformierenden PCR-Fragment knieten. sondern nur auf die chromosomale DNA. Die PCR-Fragmente wurden durch Standard-Aerogel-Elektrophorese getrennt, um ihre Größe zu bestimmen.

In Spur eins befand sich der weltweite Cholerastamm vom Typ B bei der erwarteten Fragmentgröße von 3.143 Basenpaaren. Auf Spur zwei kann das PCR-Fragment, das vom Stamm Delta C-T-X-A-B-F-R-T abgeleitet wurde. FRT lag bei 3.162 Basenpaaren.

Und auf der dritten Bahn befand sich das Delta CTX A B FFR TP CR-Fragment bei 1.769 Basenpaaren im Vergleich zu der einen KB-Leiter. Im zweiten Beispiel, in dem eine ganze genomische Insel entfernt wurde, wurde die Vibrio-Pathogenitätsinsel oder VPI-Insel als Ziel für dieses Experiment ausgewählt. Die trans flip Methode wurde in zwei Schritten modifiziert.

Zunächst wurde die Integration des Kanamycin-Resistenzgens durch eine einzige FRT-Stelle zu Beginn von PI one durchgeführt. Dann wurde eine zweite Runde der natürlichen Transformation durchgeführt, die die Einfügung eines zusätzlichen Antibiotikaresistenzmarkers, nämlich der Gentamycin-Resistenz, ermöglichte, gefolgt von einer zweiten FRT-Stelle am Ende der Pathogenitätsinsel. Die jeweiligen Primerpaare sind über jedem Gelbild angegeben und die trans FLP-Methode wurde wie gerade gezeigt fortgesetzt.

Die Eltern-, Intermediär- und Endstämme wurden alle durch PCR der gereinigten genomischen DNA auf Spur eins verifiziert. Das PCR-Fragment des Cholera-Wildstamms vom Typ V wurde auf Bahn zwei gefahren. Das PCR-Fragment, das aus dem Stamm VPI, einer FRT, einer Dose GM FRT resultierte, wurde durchgeführt.

Und auf Spur drei wurde das von einem FRT abgeleitete PCR-Produkt des Stammes delta VPI one analysiert. Primerpaare sind über jedem Gelbild angegeben. Dem letzten Stamm fehlt der gesamte VPI-Stamm.

In diesem dritten Beispiel wurde eine T-sieben-RNA-Polymerase-abhängige Promotorsequenz stromaufwärts mit dem Gen T-Fuchs integriert, einem wichtigen Regulator der natürlichen Transformation unter Verwendung der trans-Flip-Methode mit einer leichten Modifikation gegenüber dem Standardprotokoll. Die T-sieben-RNA-abhängige Promotor-Konsensussequenz wurde als Überhänge in die Oligonukleotide Nummer vier und fünf eingeschlossen, so dass diese DNA-Sequenz innerhalb des Chromosoms erhalten blieb. Auch nachdem die Antibiotikaresistenzkassette exzidiert worden war, wurde das Konstrukt in einen T-Sieben-RNA-Polymerase-haltigen V-gefärbten Stamm integriert.

In diesem Stamm wurde die Expression des T-Sieben-RNA-Polymerase-Gens durch den LAC-UV-Fünf-Promotor gesteuert, um die T-Sieben-RNA-Polymerase-abhängige Expression von T Fox zu testen. Natürliche Transformationsassays wurden im LB-Medium durchgeführt. Der elterliche Stamm, dem der T-7-abhängige Promotor vor dem Gen T Fox fehlt, ist unter diesen Bedingungen aufgrund der fehlenden T-FOX-Transkription im reichhaltigen Medium und des Fehlens seines natürlichen Induktors Chitin nicht natürlich transformierbar. Dieser Phänotyp war unabhängig davon, ob die T-Sieben-RNA-Polymerase künstlich durch IPTG induziert wurde oder nicht.

Der trans-flip-generierte Stamm, der den T-Sieben-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor stromaufwärts des Kompetenz-Gens T Fox enthält, war jedoch aufgrund des Lecks des LAC-UV-Fünf-Promotors im LB-Medium tatsächlich ein natürlich transformierbares Anreicherungsmedium. Die hergestellte T-sieben-RNA-Polymerase transkribierte bereits T FOX aus dem T-sieben-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor ohne Induktion durch IPTG. Dies initiierte die natürliche Kompetenz und Transformation, die die Funktionalität der integrierten T-Sieben-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz bestätigte.

Dieser Phänotyp wurde durch die vollständige Induktion der T-Sieben-RNA-Polymerase durch Zugabe des Induktors des LAC-UV-Fünf-Promotors IPTG signifikant verstärkt. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man VI-Cholera mit einer Kombination aus Chitin-induzierter natürlicher Transformation und Flip-Rekombination genetisch manipulieren kann. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik, Gene oder genomische Inseln zu löschen, sowie DNA-Sequenzen innerhalb weniger Tage ortsgerichtet zu integrieren.