Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Visualisierung der in vivo-Proteindynamik und Lokalisierungsmuster in lebenden Drosophila-Embryonen mittels zeitaufgelöster konfokaler Mikroskopie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus gepflegten Drosophila-Stämmen gewonnen werden. Anschließend werden die Embryonen auf einen Objektträger überführt und manuell die Küchen von den Embryonen entfernt, um beschichtete Embryonen zu erhalten.

Ein anschließend in geordneter Weise auf zuvor vorbereitete Objektträger aufgebrachtes Präparat kann je nach Experiment mit geeigneten Reagenzien zur Induktion des Spindel-Checkpoint mikroinjiziert werden. Der letzte Schritt dieses Verfahrens besteht in der Durchführung einer Zeitrafferaufnahme von Embryonen mittels konfokaler Mikroskopie. Letztendlich dienen Zeitraffer- und Fokalmikroskopie dazu, das Verhalten von Spindel-Checkpoint-Proteinen, deren Kolokalisation mit Chromosomen sowie die Wirkung von Checkpoint-induzierenden Substanzen in checkpointerellevanten transgenen Oph-Linien darzustellen.

Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der ME-Regulation zu beantworten, beispielsweise den Effekt von Mutationen oder Depletionen von Spindel-Checkpoint-Proteinen mithilfe genetischer Linien auf die Kolokalisation weiterer Checkpoint-Komponenten sowie die Konsequenz daraus für die Fähigkeit des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints, effizient zu funktionieren. Transgene Fliegen werden bei 25 Grad Celsius in Plastikgefäßen mit Fliegenfutter und einer zusätzlichen Schicht Trockenhefe oben auf dem Futter gehalten. Das Gefäß wird regelmäßig alle zwei bis drei Wochen je nach Wachstumsbedingungen ausgetauscht.

Um die Fliegenkost herzustellen, eine geeignete Menge der Fliegenkostmischung unter ständigem Rühren erwärmen, um die Bestandteile mithilfe einer peristaltischen Pumpe aufzulösen, acht bis zehn Milliliter dieses Mediums als Brei in jedes Plastikfläschchen abzugeben. Wenn der Kostbrei erstarrt ist und Raumtemperatur erreicht hat, jedes Fläschchen mit einem Watte- oder Schaumstoffpfropfen verschließen. Diese Kostfläschchen in ein Tablett stellen, in einer Plastiktüte verschließen und für eine kleine Sammlung von Eiern bei vier Grad Celsius lagern.

Überführen Sie etwa 50 Paare von zwei bis drei Tage alten erwachsenen Fliegen in ein frisches Fliegenfuttergefäß, das zusätzlich mit Trockenhefepulver auf der Oberfläche versehen ist, um die Eiablage zu ermöglichen. Inkubieren Sie bei 25 Grad Celsius, was in diesem Fall der durch die Klimaanlage aufrechterhaltenen Temperatur entspricht. Überführen Sie stündlich die Fliegen in ein neues Gefäß und lassen Sie die Embryonen jeweils 30 Minuten lang zurück.

Um sicherzustellen, dass sich einige der gesammelten Embryonen im Bereich der nuklearen Teilungszyklen acht bis zehn befinden. Die erste Sammlungsstunde wird normalerweise verworfen, da sie oft gealterte Embryonen enthält, die im Körper der Weibchen zurückgehalten wurden, wenn die Bedingungen für das Abladen ungünstig waren. Daher werden nur Embryonen ab dem zweiten Transferstunde und danach in diesen Experimenten verwendet.

Mikroskopische Objektträger und 50 mal 22 Millimeter große Deckgläser werden für dieses Verfahren verwendet. Beginnen Sie damit, ein Deckglas zu nehmen und mit einem feuchten, feinen Pinsel die vier Ecken auf einer Seite mit einer sehr geringen Menge Wasser leicht anzufeuchten. Legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger.

Die kapillare Oberflächenspannung, verursacht durch den dünnen Flüssigkeitsfilm, sollte verhindern, dass die Deckglasplatte verrutscht. Tragen Sie einen dünnen Streifen Heptanleim über die Mitte der Deckglasplatte auf. Das Heptan sollte innerhalb von Sekunden verdampfen und den Leim auf der Deckglasplatte zurücklassen.

Verwenden Sie anschließend einen Diamantschreiber, um eine weitere Deckglasplatte in kleine Quadrate von etwa 1,5 Millimeter Kantenlänge zu schneiden. Nehmen Sie ein Quadrat auf und platzieren Sie es an einem Ende des Klebestreifens. Dies wird verwendet, um die Nadelspitze zu öffnen, wenn eine Mikroinjektion erforderlich ist.

Nehmen Sie einen weiteren Objektträger, befestigen Sie ein zwei Zentimeter langes Stück doppelseitiges Klebeband daran und entfernen Sie die Schutzfolie, um mit dem Verfahren zur Beschichtung von Embryonen zu beginnen. Überführen Sie die Fliegen mit einem feuchten, feinen Pinsel in ein frisches Nährmediumröhrchen. Übertragen Sie etwa 50 Eier auf das doppelseitige Klebeband auf dem vorbereiteten Objektträger.

Verwenden Sie eine geeignete Menge Flüssigkeit, damit die Eier verteilt werden können. Sobald die Flüssigkeit verdunstet ist, haften die Eier unter dem Stereomikroskop am Klebeband. Berühren Sie die Eier mehrmals vorsichtig entlang ihrer Längsachse mit der Außenseite einer der beiden Hälften eines Pinzettenpaares, bis das Corian gebrochen und geöffnet ist.

Lassen Sie das Embryo in der Corian-Schale, um eine schnelle Austrocknung zu verhindern. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis 10 bis 20 der Eier behandelt wurden. Danach heben Sie die Embryonen auf, entfernen sie einzeln aus der Corian-Schale und platzieren die Embryonen vorsichtig in einem vertikalen Streifen.

Auf dem Klebestreifen. Richten Sie die Embryonen mit der langen Seite antiparallel zur langen Seite des Klebestreifens aus. Legen Sie die Embryonen für drei bis acht Minuten in eine Trocknungskammer.

Schließlich die Embryonen mit einer geeigneten Menge Voltar-Light-Tennis-Öl bedecken, um eine übermäßige Austrocknung vor der Mikroinjektion zu verhindern. Die Mikroinjektion ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um die Mikroinjektion so einfach und effizient wie möglich zu gestalten, sollte das spezifische Protokoll für die Präparation befolgt werden.

Die Embryonen müssen sorgfältig vorbereitet werden, damit sie für die Mikroeinspritzung in optimalem Zustand sind. Die Nadeln für die Mikroeinspritzung von Embryonen werden im Voraus hergestellt. Füllen Sie mit einer feinen Ladespitze eine Nadel rückwärts mit ein bis zwei Mikrolitern einer geeigneten Konzentration des Reagenz in Injektionspuffer.

Befestigen Sie die Nadel in der Nadelspitzehalterung eines invertierten Leica TCSP-Zwei-Confocal-Mikroskops, wobei der Druckschlauch mit dem Injektionskontrollsystem verbunden ist. Suchen Sie unter dem 40-fachen Objektiv ein Embryo. Anschließend suchen Sie den Nadelschatten, ohne die Fokusebene zu verändern.

Dies wird erreicht, indem man die Nadel in die Mitte des Sichtfeldes bewegt und sie allmählich auf die richtige Fokusebene absenkt. Bewegen Sie den Mikroskoptisch sehr vorsichtig, um das kleine quadratische Deckglas zu finden, das vorab an einem Ende des Klebestreifens befestigt wurde. Bewegen Sie die Nadelspitze äußerst vorsichtig, bis sie an die Kante des kleinen quadratischen Deckglases stößt und dieses sanft aufbricht.

Bewegen Sie den Objekttisch, sodass die Embryonen wieder sichtbar werden, und wählen Sie einen Embryo im geeigneten Entwicklungsstadium für die Injektion aus. Bewegen Sie den Embryo vorsichtig nahe an die Nadel heran und stellen Sie die Fokusebene sowohl für den Embryo als auch für die Nadel erneut ein. Führen Sie den Embryo in die Nadel ein.

Geben Sie einen Tropfen Reagenz an der Seite des Embryos ab und bewegen Sie anschließend den Embryo weg. Zeitrafferaufnahmen oder Einzelbilder lebender Embryonen werden mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskopiesystem Leica TCSS SP2 und einer 40-fachen Öl-Immersion-Objektivlinse aufgenommen. Wenn mehrere Fluorophore mit überlappenden Spektren, die im selben Embryo koexprimiert sind, abgebildet werden, wird jede Emissionswellenlänge des fluoreszierenden Proteins nacheinander erfasst.

Die Bilder entstanden später beim Einrichten der Zeitfenster für die Zeitrafferaufnahmen. Diese Faktoren müssen berücksichtigt werden. Üblicherweise wird ein einzelnes Bild als Mittelwert aus zwei Scan-Zeilen gewonnen.

Bei einer durchschnittlichen Anzahl von zwei Frame-Scans dauert es mindestens 6,3 Sekunden, um ein Bild von fünf mal zwölf durch fünf mal zwölf Pixel im simultanen Scan-Modus zu erfassen, und 15,44 Sekunden im sequenziellen Scan-Modus, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Die Blende wird normalerweise auf ein bis zwei AE (Airy-Einheiten) eingestellt, und die Laserleistung wird auf das niedrigstmögliche Niveau justiert, um eine signifikante Photobleiche zu vermeiden. Dieser repräsentative Zeitrafferfilm zeigt die dynamische kinetische Rekrutierung des kinetischen Kerns von CDC 20 sowie die Chromosomenbewegung in lebenden Ophs in zialen Embryonen.

Zeitrafferaufnahmen wurden von einem transgenen Anfangsembryo aufgenommen, der G-F-P-C-D-C 20, dargestellt in Grün, und RFP-Histon zwei B, dargestellt in Rot, gleichzeitig exprimierte. Während der Kernteilungszyklen wurden sieben bis acht Bilder alle 10 Sekunden aufgenommen, wobei das Bild, in dem sich die Zellen bereits in der Prophase befinden, als Zeitpunkt null betrachtet wird. Diese Abbildung zeigt die Einzelbilder aus dem Zeitrafferfilm. Gfp-Cdc20 ist leicht auf den Kinetochoren in Prophase und Prometaphase zu erkennen, wie durch die weißen Pfeile in den Bildern drei und vier jeweils angegeben, und bleibt auf den Kinetochoren in Metaphase und Anaphase erhalten, wie in den Bildern fünf und sechs jeweils beobachtet.

G-F-P-C-D-C 20 ist aus dem durch den weißen Pfeilkopf in Bild eins markierten Schnittstellenkern ausgeschlossen und tritt in den Kern bereits in der frühen Prophase ein, wie in Bild zwei gezeigt. In den Bildern acht bis 14 wurden Chromatin-Morphologien unter Verwendung von coexprimiertem RFP-Histon 2B als Markern im Überlagerungsbild bestimmt. Die Bilder sind in der unteren Zeile dargestellt.

Mithilfe dieses Protokolls können die Funktionen des Spindel-Checkpoint (SAC) untersucht werden, indem die Embryonen durch Mikroinjektion von Antikörpern, fluoreszenzmarkierten Proteinen oder chemischen Verbindungen manipuliert werden, die möglicherweise den SAC aktivieren. In diesem Beispiel werden die Embryonen mit Colchicin behandelt, um die Mikrotubuli zu depolymerisieren und somit den SAC auszulösen, sowie mit GFP-CDC20 oder GFP-MAD. Zwei kinetische Kernsignale wurden als Marker für den Zellzyklusfortschritt verwendet.

Im oberen Panel zeigen die ARES die arrestierten ESCI in den Bildern zwei bis sechs an. Der durch einen Pfeil markierte Bereich in Bild eins zeigt den Zustand vor der Colchicinbehandlung, bei dem G-F-P-C-D-C 20 vom späten interfazialen Kern ausgeschlossen ist. Die Bilder im mittleren Panel zeigen, dass G-F-P-C-D-C 20 in Abwesenheit des endogenen MAD zwei – wie durch Pfeile in den Bildern sieben bis zwölf angegeben – weiterhin in den Kern hinein- und aus ihm heraus- sowie an die Kinetochoren hin- und herbewegt wird.

Obwohl die Zytokinese defekt erscheint, deutet dies auf eine fehlgeschlagene SAC-Funktion hin, Zellen als Reaktion auf eine Behandlung mit Colchicin anzuhalten. Ein Beispiel für eine fehlgeschlagene Trennung der Tochterkerne ist in Bild 10 zu sehen. Schließlich weisen die Pfeilspitzen im unteren Panel in den Bildern 14 bis 18 auf ruhende kinetische Kerne mit angereicherten GFP-MA-two-Fusionsproteinen hin, was darauf schließen lässt, dass das funktionelle GFP-MA-two das sac-Defekt-Phänotyp im MA-two-Mutanten-Embryo kompensiert.

Der Pfeil in Bild 13 zeigt die GFP-MAD2-Akkumulation in einem späten Interphasenkern. Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die zwei Software-Embryonen aus den Stielen gewinnt, die Embryonen manuell dekoordiniert und anschließend Präparate für die Mikroinjektion sowie die in-vivo-Zeitrafferaufnahme mittels konfokaler Mikroskopie vorbereitet.