Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens- Drosophila Syncytial Embryonen

Ziel dieses Experiments ist es, die Visualisierung der in vivo Proteindynamik und Lokalisationsmuster in lebenden Drosophila-Embryonen mittels konfokaler Zeitraffermikroskopie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus gepflegten Drosophila-Beständen entnommen werden. Als nächstes übertragen Sie die Embryonen auf einen Objektträger und entfernen dann manuell die Coons von den Embryonen in beschichtete Embryonen.

Ein anschließend in organisierter Weise auf zuvor vorbereitete Objektträger montiert und je nach Experiment mit geeigneten Spindel-Checkpoint-induzierenden Reagenzien mikroinjiziert werden. Der letzte Schritt in diesem Verfahren ist die Durchführung einer Zeitraffer-Bildgebung von Embryonen mittels konfokaler Mikroskopie. Letztendlich wird Zeitraffer- und Fokalmikroskopie verwendet, um das Spindel-Checkpoint-Protein, das Kolokalisations-Chromosomenverhalten und die Wirkung von Checkpoint-induzierenden Wirkstoffen in Checkpoint-verwandten transgenen Oph-Linien zu zeigen.

Die Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der ME-Regulation zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen der Mutationen oder Depletionen des Spindel-Checkpoint-Proteins durch die Verwendung der genetischen Linien auf die Kolokalisation der anderen Checkpoint-Komponenten und die Auswirkungen darauf auf die Fähigkeit des Spindelassemblierungs-Checkpoints, effizient zu funktionieren. Transgene Fliegen werden bei 25 Grad Celsius in Plastikfläschchen gehalten, die Fliegenfutter enthalten, und mit zusätzlichem Trockenhefepulver auf der Oberseite. Das Fläschchen wird routinemäßig alle zwei bis drei Wochen ausgetauscht, abhängig von den Wachstumsbedingungen.

Zur Zubereitung von Fliegenfutter eine angemessene Menge der Fliegenfuttermischung unter ständigem Rühren erhitzen, um die Bestandteile mit einer Schlauchpumpe aufzulösen, acht bis 10 Milliliter dieses Mediums als Gülle in jedes Kunststofffläschchen verteilen. Wenn die Lebensmittelaufschlämmung ausgehärtet und die Trockentemperatur aufgerufen hat, verschließen Sie jedes Fläschchen mit einem Wattestäbchenschaumstopfen. Legen Sie diese Lebensmittelfläschchen in eine Schale, verschließen Sie sie in einer Plastiktüte und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius für eine kleine Eizellentnahme.

Übertragen Sie etwa 50 Paare von zwei bis drei Tage alten erwachsenen Fliegen in ein frisches Fliegenfutterfläschchen, das mit zusätzlichem Trockenhefepulver auf der Oberfläche geliefert wird, um Embryonen zu legen. Inkubieren Sie bei 25 Grad Celsius, was in diesem Fall die Temperatur ist, die von der Klimaanlage aufrechterhalten wird. Übertragen Sie die Fliegen für den Raum stündlich in eine frische Datei und lassen Sie die Embryonen 30 Minuten lang stehen.

Um sicherzustellen, dass einige der gesammelten Embryonen um den Kernteilungszyklus acht bis zehn wüteten. Die Entnahme in der ersten Stunde wird normalerweise verworfen, da sie oft gealterte Embryonen enthält, die im weiblichen Körper zurückgehalten wurden, als die Bedingungen für die Ablage nicht geeignet waren. Daher werden nur Embryonen ab dem Transfer ab der zweiten Stunde in diesen Experimenten verwendet.

Für dieses Verfahren werden Objektträger und 50 x 22 Millimeter große Deckgläser verwendet. Beginnen Sie damit, einen Deckzettel zu nehmen und mit einem feuchten, feinen Stiftpinsel die vier Ecken auf einer Seite leicht mit einer sehr kleinen Menge Wasser zu befeuchten. Legen Sie den Deckglas auf einen Objektträger.

Die durch den dünnen Flüssigkeitsfilm verursachte kapillare Oberflächenspannung soll verhindern, dass sich der Deckschieber bewegt. Tragen Sie einen dünnen Streifen Heptankleber auf die Mitte des Deckglases auf. Das Heptan sollte in Sekundenschnelle verdampfen und den Kleber auf dem Deckglas zurücklassen.

Schneiden Sie anschließend mit einem Diamantstift ein weiteres Deckglas in kleine Quadrate von etwa 1,5 Millimetern im Quadrat. Nimm ein Quadrat und lege es auf ein Ende des Klebestreifens. Dies wird verwendet, um die Nadelspitze zu öffnen, wenn eine Mikroinjektion erforderlich ist.

Nehmen Sie einen weiteren Objektträger, kleben Sie ein zwei Zentimeter langes Stück doppelseitiges Klebeband darauf und ziehen Sie das Abdeckpapier ab, um mit dem Verfahren zum Beschichten von Embryonen zu beginnen. Übertragen Sie die Fliegen mit einem feuchten und feinen Stiftpinsel in ein Fläschchen mit frischen Lebensmitteln. Übertragen Sie ca. 50 Eier auf das doppelseitige Klebeband auf dem vorbereiteten Objektträger.

Verwenden Sie eine angemessene Menge Flüssigkeit, damit sich die Eier verteilen können. Wenn die Flüssigkeit verdunstet ist, kleben die Eier unter einem Präpariermikroskop am Klebeband. Berühre die Eier mehrmals vorsichtig entlang ihrer Längsachse mit der Außenseite einer halben Pinzette, bis der Corian gebrochen und offen ist.

Lassen Sie den Embryo in der Corian-Schale, um eine schnelle Austrocknung zu verhindern. Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis 10 bis 20 der Eizellen behandelt wurden. Nehmen Sie dann die Embryonen auf, entfernen Sie sie nacheinander aus der Corian-Schale und platzieren Sie die Embryonen vorsichtig in einem vertikalen Streifen.

Auf dem Klebestreifen. Richten Sie die Embryonen so aus, dass die lange Seite antiparallel zur langen Seite des Klebestreifens verläuft. Legen Sie die Embryonen für drei bis acht Minuten in eine Austrocknungskammer.

Bedecken Sie die Embryonen schließlich mit einer angemessenen Menge Volter Left Tennisöl, um eine übermäßige Dehydrierung vor der Mikroinjektion zu verhindern. Die Mikroeinnahme ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um die Mikroeinnahme so einfach und effizient wie möglich zu gestalten, sollte das spezifische Protokoll für eine leichte Vorbereitung befolgt werden.

Die Embryonen müssen sorgfältig vorbereitet werden, damit sie sich in einem optimalen Zustand für die Mikroaufnahme befinden. Die Nadeln für die Mikroinjektion von Embryonen werden vorher vorbereitet. Füllen Sie eine Nadel mit einer feinen Ladespitze mit ein bis zwei Mikrolitern einer geeigneten Konzentration des Reagenzes im Injektionspuffer auf.

Montieren Sie die Nadel in den Nadelhalter an einem Leica TCSP zwei inversen Konfokalmikroskopen, wobei das Druckrohr mit dem Injektionskontrollsystem verbunden ist. Finden Sie einen Embryo unter dem 40-fachen Ziel. Suchen Sie als Nächstes den Nadelschatten, ohne die Fokusebene zu ändern.

Dies wird erreicht, indem die Nadel in die Mitte des Gesichtsfeldes bewegt und allmählich in die rechte Brennebene abgesenkt wird. Bewegen Sie den Mikroskoptisch sehr vorsichtig, um das kleine Quadrat des Deckglases zu finden, das an einem Ende des Klebestreifens angebracht ist. Bewegen Sie die Nadelspitze sehr vorsichtig, bis sie auf den Rand des kleinen quadratischen Deckblatts trifft und sanft aufbricht.

Verschieben Sie das Stadium so, dass die Embryonen wieder ins Blickfeld kommen, und wählen Sie einen Embryo im richtigen Alter für die Injektion aus. Bewegen Sie den Embryo vorsichtig in die Nähe der Nadel und stellen Sie die Brennebene sowohl für den Embryo als auch für die Nadel neu ein. Schieben Sie den Embryo in die Nadel.

Injizieren Sie einen Tropfen Reagenz in die Seite des Embryos und bewegen Sie den Embryo dann weg. Zeitraffer- oder Einzelbilder von lebenden Embryonen werden mit einem Leica TCSS SP mit zwei inversen konfokalen Mikroskopiesystemen mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen. Bei der Abbildung mehrerer Fluorophore, die überlappende Spektren aufweisen und im selben Embryo koexprimiert werden, wird jede fluoreszierende Proteinemissionswellenlänge nacheinander erfasst.

Die Bilder entstanden später, als die Zeitrahmen für die Zeitrafferaufnahmen eingerichtet wurden. Diese Faktoren müssen berücksichtigt werden. Ein einzelnes Bild wird in der Regel als Durchschnitt von zwei Scanzeilen erhalten.

Bei durchschnittlich zwei Frame-Scans dauert es mindestens 6,3 Sekunden, um ein Bild mit fünf 12 x fünf 12 Pixeln im Simultan-Scan-Modus zu scannen, und 15,44 Sekunden für einen sequenziellen Scan-Modus, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. Die Lochblende ist normalerweise auf ein bis zwei Au oder luftige Einheiten eingestellt und die Laserleistung wird auf das niedrigstmögliche Niveau eingestellt, um ein signifikantes Photobleaching zu vermeiden. Dieser repräsentative Zeitrafferfilm zeigt die dynamische kinetische Kernrekrutierung von CDC 20 und die Chromosomenbewegung in lebenden Ophs in zialen Embryonen.

Zeitrafferbilder wurden von einem transgenen ersten Embryo coex aufgenommen, der G-F-P-C-D-C 20 exprimiert, dargestellt in grün und RFP sein Stein zwei B in rot. Während der nuklearen Teilungszyklen wurden alle 10 Sekunden sieben bis acht Bilder aufgenommen, und das Bild mit den Zellen, die sich bereits in der Prophase befinden, wird als Nullpunkt behandelt. Diese Abbildung zeigt, dass die Bilder aus dem Zeitrafferfilm G fp CDC 20 leicht auf Prophase und Prometaphase Kinetico beobachtet werden können, wie durch die weißen Pfeile in den Bildern drei und vier angedeutet, und auf dem Metaphase- und Anaphase-Kinetta-Verlauf bestehen bleiben, wie in den Bildern fünf bzw. sechs zu sehen ist.

G-F-P-C-D-C 20 wird aus dem Grenzflächenkern ausgeschlossen, der durch die weiße Pfeilspitze in Bild eins angezeigt wird, und tritt in der frühen Prophase in den Zellkern ein, wie in Bild zwei gezeigt. In den Bildern wurden acht bis 14 Chromatinmorphologien unter Verwendung von co-exprimiertem RFP-Histon bestimmt, wobei zwei B als Marker verschmolzen waren. Die Bilder werden in der unteren Reihe angezeigt.

Mit Hilfe dieses Protokolls können Spindelanordnungs-, Checkpoint- oder SAC-Funktionen untersucht werden, indem die Embryonen durch Mikroinjektion von Antikörpern, fluoreszenzmarkierten Proteinen oder chemischen Verbindungen, die möglicherweise die SAC auslösen, manipuliert werden. In diesem Beispiel werden die Embryonen mit Colchicin behandelt, um die Mikrotubuli zu depolymerisieren, wodurch das SACG FP CDC 20 oder GFP MAD provoziert wird. Zwei kinetische Kernsignale wurden als Marker für die Zellzyklusprogression verwendet.

Im oberen Bereich zeigen die ARES die verhafteten ESCI in den Bildern zwei bis sechs an. Der durch einen Pfeil markierte Bereich in Bild eins zeigt an, dass G-F-P-C-D-C 20 vor der Colchicin-Behandlung aus dem Nucleus late interface ausgeschlossen ist. Die Bilder in der mittleren Tafel zeigen, dass in Abwesenheit von endogener MAD zwei G-F-P-C-D-C 20, die durch Pfeile in sieben bis 12 angezeigt werden, weiterhin in den Zellkern hinein und aus ihm heraus oszillieren und den kinetischen Verlauf ein- und ausschalten.

Obwohl die Zytokinese defekt zu sein scheint, deutet dies auf eine fehlgeschlagene SAC-Funktion beim Stillstand von Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Colchicin hin. Ein Beispiel für eine fehlgeschlagene Trennung des Tochterkerns ist in Bild 10 zu sehen. Schließlich sind in der unteren Tafel die Pfeilspitzen in den Bildern 14 bis 18 des Indikators ruhende kinetische Kerne mit akkumulierten GFP MA zwei Fusionsproteinen zu sehen, was darauf hindeutet, dass das funktionelle GFP MA zwei den Sackdefekt-Phänotyp im MA zwei mutierten Embryo rettet.

Die Pfeilspitze in Bild 13 zeigt die Akkumulation von GFP MAD zwei in einem späten Grenzflächenkern. Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die beiden Software-Embryonen aus der Pflege der Stängel, die manuelle De-Koordination der Embryonen vor der Vorbereitung der Objektträger für die Mikroaufnahme in vivo-Zeit und die linke Bildgebung mit konfokaler Mikroskopie erhalten.