Name: Ein vereinfachtes Verfahren für In-situ Exzision der Hornhaut und der Netzhaut Ausweiden von Gewebe aus menschlichen Augapfel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Lernen Sie ein vereinfachtes Verfahren zur Hornhaut-Exzision und Netzhaut-Ausweidung aus menschlichen Augäpfeln. Diese Methode bewahrt Gewebequalität für Transplantation und Forschung.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 und Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009) unterstützt. Die Autoren danken Dr. C. Griffoni für die 2009/2010 zusammengefasste Daten über die Verwendung von menschlichen Auges Globen.

1. In-situ-Exzision der Hornhaut von Ocular Globes <ol><li> Schalten Sie die laminare Luftströmung Schrank ca. 15 Minuten vor dem Gebrauch. Reinigen Sie die Sterilbank mit 70% Isopropylalkohol. Setzen Sie auf persönliche Schutzkleidung wie OP-Mütze und Maske. Schrubben Sie Hände und Unterarme und trocknen Sie mit einem sterilen Tuch. Trage sterile Handschuhe und Kittel oder Hülsen unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Richten Sie den sterilen Bereich, indem ein steriles Instrument Tablett aseptisch. Stellen Sie sicher, dass die Instrumente steril sind. Öffnen Sie die sterile Instrumente und Flip-Pack auf den sterilen Bereich Vermeidung jeglicher Kontamination. </li><li> Positionieren Sie alle sterilen Materialien und Instrumente (Tabelle 2) zusammen mit Flaschen (Auge Gläser) mit Auge Globen, so dass sie neben dem Rand des sterilen Feldes für Benutzerfreundlichkeit sind. </li><li> Beschriften Sie die Flaschen mit vorher vorbereitete Konservierung / Speichermedium wie in Tabelle 3 angegeben und legen Sie diem auf der Oberfläche des laminaren Luftstrom Haube gemeinsam mit I-PVP (Polyvinylpyrrolidon Iod-), Natriumthiosulfat und einer sterilen Kochsalzlösung PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung). </li><li> Lassen Sie die Augengewebe und Lösungen in den normalen Raumtemperatur erreichen, wie sie in Kühlschränken bei 4 ° C aufbewahrt werden Vermeiden Sie wiederholte Erwärmung / Abkühlung Zyklen. Halten die Deckel der Lösung und das Auge Gläser mit inneren Seite nach oben neben dem entsprechenden Gefäßen. </li><li> Entfernen Gaze und Schwämme aus dem Auge Glas mit einer sterilen Pinzette. Tauchen Sie den Globus in sterilen I-PVP 0,5% für 2 Minuten auf die Augen-Globen zu dekontaminieren. Platzieren Sie die beiden Zangen am Deckel des sterilen Behälter, außerhalb des sterilen Feldes. Übertragen Sie die Welt in Natriumthiosulfat 0,1% für 1 Minute mit einem anderen Paar sterilen Pinzette. Mit den gleichen Zangen, überweisen Sie den Globus, um die Flasche mit steriler Kochsalzlösung (PBS) und lassen Sie ihn, bis er betrieben wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den anderen Augapfel von ter demselben Spender. </li><li> Arbeiten unter dem Laminar Air Flow Kapuze, wickeln Sie den Globus mit steriler Gaze (Bandagen) Verlassen der Hornhaut und Lederhaut ca. 5 mm von der Hornhaut freigelegt. Das Auge Glühbirne könnte einfach in der Hand Aufrechterhaltung des angemessenen Druck gehalten werden. Das Gewebe sollte feucht gehalten werden während der gesamten Operation. </li><li> Zangen sind zusammen mit einer Schere benutzt, um alle eventuellen Resten der Bindehaut zu entfernen. Halten Sie die Instrumente für die obige Operation getrennt von anderen Instrumenten eingesetzt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen skleralen Einschnitt von 3-4 mm vom Limbus Region durchzuführen, dann verlängern die Schnitt um 360 °, die Vermeidung, die zugrunde liegende Uvea perforieren oder zu keiner Verformung der Hornhaut des normalen Krümmung. Schneiden Sie vier große Einschnitte Verlassen vier kleine Lücken zu vermeiden die Sekretion des Glaskörpers. Alle vier Lücken geschnitten Gewährleistung keine Entfernung von jedem anderen Gewebe. </li><li> Vorhandensein von kleinen Sklera-Plaques kann das Schneiden behindern, so stellen Sie sicher, compLete die Sklera Exzision mit mikrochirurgischen Schere. Dieser Vorgang sollte ohne Beschädigung der Aderhaut, Netzhaut und des Glaskörpers durchgeführt werden. </li><li> Untersuchen Sie den Einschnitt, um sicherzustellen, es ist vollständig. Wenn der Schnitt ist richtig der Corneo-Sklera-Felge haftet an den Ziliarkörper nur an dem Punkt, in Korrespondenz mit der Hornhaut durchgeführt. </li><li> Stellen Sie den Augapfel nach unten eingewickelt in der Nähe der Mitte des sterilen Feldes. Füllen Sie das Hornhaut-Entfernung mit einer Pinzette, um die Sklerarand stationäre und die Hand zur Exzision verwendet, um den Ziliarkörper-Aderhaut nach unten und weg von der Hornhaut-Sklera-Taste ziehen zu halten. </li><li> Vorsichtig trennen Sie alle verbleibenden Verwachsungen von der Hornhaut-Sklera-Taste. Weder ziehen die Hornhaut-Sklera-Felge in einer Weise, die Cross-Hornhaut Spannungen führen könnten, und vermeiden Sie fallen wieder nach unten auf die vordere Kammer. </li><li> Die Endothelzelldichte der Hornhaut wird anhand eine hypotonische Lösung und die Zellmortalität wird anhand einer Trypsinein Blau-Färbung für etwa 1 min und die Zellen werden dann unter einem optischen Mikroskop gezählt und gemessen, wie Zellen / mm 2. Die Vorderkammer sollte nach den Deckel während der hintere den Boden der Petrischale stellen sollte. Die Endothelzelldichte könnte manuell gezählt werden mit einem Gitter in dem Ziel von 100-facher Vergrößerung. Die mindestens benötigte Zellzahl für die Transplantation in Italien ist 2200 Endothelzellen / mm 2. </li><li> Übertragen der Cornea-Sklerarand Verwendung einer Hornhaut Klaue zuvor hergestellten Hornhaut Speichermedium bei RT (Raumtemperatur), wie in Tabelle 3 gezeigt erhalten. </li><li> Untersuchen Sie die hintere Kammer für einen natürlichen Linse. Wenn die Lederhaut ist bereit, entfernen Sie alle Rückstände von Uvea und Glaskörper aus der ganzen Welt. Vorsichtig auspacken und zurück den verbleibenden hinteren Segment ihrer jeweiligen Auges Glas, unter aseptischen Bedingungen. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Welt mit neuen Instrumenten. Befestigen Sie die Hornhaut Witzh Hornhaut Klaue und bewahren unter den Speichermedien (Organkultur) bei 31 ° C Das herausgeschnittene Hornhaut, wie in Abbildung 1a dargestellt ist, kann dann für Keratoplastik oder Forschung verwendet werden. </li><li> Entsorgen Sie die nicht benötigten Materialien und Bio-gefährlicher Abfälle in geeignete Abfallbehälter. Reinigen Sie den Arbeitsbereich, sobald die Arbeit abgeschlossen ist mit 70% Isopropylalkohol Spray. </li><li> Wenn nach 28 Tagen die Hornhaut behält alle Bewertungsparameter [wie Morphologie, Zellzahl, Transparenz, Dicke und mikrobiologische Tests - Bakterien und Pilzen mit BACTEC 9240 Instrument (Becton Dickinson, Mailand, Italien)], kann es dann zu transportierenden die Krankenhäuser mit dem Transportmedium in Tabelle 4 gezeigt. Die Hornhaut sollte entfernt und platziert aus dem Speicher zu Medium unter Laminar Air Flow Schrank zu transportieren. </li><li> Da während der Lagerung, die Hornhaut dicker als seine übliche Größe für eine Transplantation erforderlich wird, verwenden Auge Banken de-Quellmittel, um Dicke zu reduzieren. Wirnutzen 6% Dextran T500, um die Hornhaut wieder zu seiner normalen Größe in Transportmedium. Obwohl 4-8% Dextran T500 verwendet werden könnte, hat 6% für uns am besten gedient. Dies macht es einfacher für die Chirurgen, um die Hornhaut, sobald sie es empfangen zu transplantieren. </li></ol> 2. Das Ausweiden der Netzhaut von der Augapfel nach dem Herausschneiden der Hornhaut <ol><li> Nach der Exzision wird die Hornhaut für die Transplantation oder Forschung auf der Grundlage seiner Morphologie und Endothelzelldichte ausgewählt ist und in der Aufnahme bzw. Konservierung Medium bei 31 platziert ° C Die verbleibenden des Augapfels wird dann zur weiteren Verwendung wie Sklera Isolierung für chirurgische Zwecke verarbeitet, Netzhaut der Forschung usw. </li><li> Vor der Netzhaut Exzision, stellen Sie sicher, dass der Augapfel intakt und nur die Hornhaut mit einem Teil der Lederhaut entfernt ist. Wenn die gelatinöse Glaskörper absondert heraus, dass es schwierig wird, ein Netzhaut-Gewebe zu entfernen. </li><li> Wenn der Spender ist unter 65 Jahre alt, ist die Lederhauterhalten unter sterilen PBS für chirurgische Zwecke nach serologische Untersuchungen. In diesem Fall wird die Sklera geschnitten, nur die Glaskörper entfernt und die gesamte Sklera erhalten. </li><li> Für retinalen Exzision, mit einem kleinen Schnitt oder Schnitt von der Seite der Hornhaut-Sklera Weg zu den Sehnerv mit einer sterilen Pinzette und Schere zu starten. Halten Sie den Teil der Lederhaut mit einer Pinzette und schneiden mit der Schere direkt in Richtung des Sehnervs Schneiden Teil für Teil Vermeidung von Schäden in den Glaskörper. </li><li> Choroidales Plaques sollten aus der Lederhaut getrennt werden, wie sie aneinander haften. Schneiden Sie die gesamte Lederhaut, die Aderhaut Gewebe freizulegen. Sobald der Lederhaut ganz abgeschnitten ist, trennen Sie die Lederhaut mit dem verbleibenden des Glaskörpers durch Schneiden in der Nähe des Sehnervs. Ein ganzes Knäuel Glaskörper mit Aderhaut gedeckt wird sichtbar, wie in Abbildung 2a dargestellt. </li><li> Mit zwei sterilen Pinzette entfernen Sie die Aderhaut sanft, indem man es mit einemZange und Entfernen mit dem anderen. Alternativ kann die Aderhaut mit einer Schere entfernt werden, aber dies sollte idealerweise vermieden werden, da Schäden an der Netzhaut verursacht werden kann. Entfernen Sie die Aderhaut teilweise und schneiden Sie es, um das Entfernen zu erleichtern. </li><li> Sobald der Aderhaut entfernt wird, wird eine transparente Schicht der Netzhaut deutlich gesehen, wie in Abbildung 2b gezeigt werden. Die Aderhaut eine innere Bruch-Membran, die auch entfernt werden konnten, aber es ist schwierig, sie mit dem bloßen Auge zu erkennen. </li><li> In ähnlicher Weise, verwenden Sie zwei Zangen, um die Netzhaut zu entfernen, wie in Abbildung 2c gezeigt. Es ist einfach, eine hohe Menge von Retina, wenn in der Nähe des Sehnervs ausgeschnitten zu isolieren. Alle Schichten des Auges kann nun zu sehen ist, wie in 2d gezeigt. </li><li> Sobald der retinalen Gewebe entfernt wurde, könnte es für verschiedene Zwecke verwendet werden und daher die nachfolgenden Schritte und Bedingungen für die Konservierung verwendet werden, können entsprechend abweichen. Zum Beispiel,Das Retinagewebe in Röhrchen, die RNA-Stabilisierung Reagenzien (z. B. RNAlater) oder Lyse-Puffer (RNA oder DNA-Extraktion), Dispase / Trypsin (für die Isolierung von Zellen), Fixierlösungen (vor Gewebe in Paraffin eingebettet oder ÜLG gebracht werden Immunhistochemie). </li><li> Alle löschen den Arbeitsbereich und reinigen Sie den Bereich mit 70% Isopropylalkohol Spray. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Die Hornhaut-Sklera-Felge, wie in Abbildung 1a zu sehen ist ein richtig ausgeschnitten Hornhaut mit erforderliche Menge an Sklerarand und endotheliale Morphologie, diese Art der Hornhaut wird in der Regel für Keratoplastik verwendet. Wenn die vordere Stroma der Hornhaut mit ausgeschnitten Gegenwart von Opazität beschädigt ist, kann die Hornhaut für Endothel Keratoplastik / posterioren lamellären Keratoplastik (Endothel mit einem Teil des Stroma) verwendet werden. Für den Fall der Endothel-Schicht beschädigt ist oder wenn die Endothelzelldichte ist &lt;2200 Zellen / mm 2 (Esalian Standard), könnte die Hornhaut für die vorderen lamellären Keratoplastik (Epithel mit einem Teil des vorderen Stroma) verwendet werden. Wenn die endotheliale Zellen kleiner ist als der Bedarf könnten die Hornhaut für die anteriore lamelläre Keratoplastik oder Forschung verwendet werden, während, wenn die Cornea vollständig beschädigt ist, in der Forschung verwendet werden könnte, wie in 1b, 3b und 3c gezeigt, oder verworfen. Der Schaden könnte eine Ursache für ordnungsgemäßen Umgang mit dem Gewebe sein, vor Kataraktoperationen, die zu Stroma-oder Endothelzellen Descemet Narben, die Entwicklung von Verletzungen während das Leben des Patienten usw. Daher wird es notwendig, jedes Gewebe mit Spaltlampe und überprüfen Sie dann unter dem optischen Mikroskop für feine Narben / Falten / Abteilungen. Die Hornhaut ist in der Regel unter zwei verschiedenen Bedingungen wie Organkultur (ca. 31 ° C) in der Regel in den europäischen Ländern oder Hypothermie verwendet (etwa 4 ° C) in der Regel in den USA verwendet. Erhalten Wir verwenden Organkultur, wie es um den Damm zu regenerieren hilftim Alter von Epithelzellen, neu zu beleben Endothelzellen Scheck mit einer hohen post mortem Zeit, gibt eine Lagerzeit von 4 Wochen, die ausreicht, Fenster gibt für die Planung einer Operation, ausreichend Zeit für die mikrobiologische (Bakterien und Pilze) und serologische Untersuchungen der Hornhaut usw. können auch im Transportmedium für 7 Tage aufbewahrt werden. Die Sklera konnten Stück für Stück eine schonende Entfernung aller choroidalen Plaques geschnitten werden. Der Glaskörper Flüssigkeit ausscheiden kann, wenn der Sehnerv, Netzhaut oder Aderhaut ist scharf wie in Abbildung 4 dargestellt geschnitten. Netzhäute, wenn für die RNA-Analyse ausgeschnitten sollte in RNAlater erhalten, sobald die Gewebe herausgeschnitten sind. In der Regel 1x1 cm der Aderhaut und Netzhaut wird ausgeschnitten und nach halten sie in RNAlater für 24 Stunden bei 4 ° C unter -80 ° C konserviert in frischen Eppendorf-Röhrchen (Safe-Lock Reaktionsgefäße, 2 ml) bis zur Verwendung oder Auslieferung mit einem trockenen Eis. Die Netzhautgewebe sollten exzidiert mit zwei Pinzetten in der Nähe des Sehnervs weg von Iris werdenoder Ciliarrande um eine Kontamination mit anderen pigmentierte Strukturen zu vermeiden und sollte auf die Erhaltung Behälter überführt werden sofort als RNA instabil wird beim Abrufen der Netzhaut. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1: Vergleich zwischen einer guten und einer schlechten Qualität Hornhaut:. A) Ein richtig ausgeschnitten Hornhaut. Eine solche Hornhaut ist in der Regel unter Organkultur 4 Wochen lang aufbewahrt. Mikrobiologische (BACTEC 9240 mit Instrument) und morphologischen (Färbung der Zellen mit Trypanblau für Zellmortalität Bestimmung und Beobachtung von Zellen unter einem optischen Mikroskop mit 100facher Vergrößerung) Prüfung wird vor dem Transport ins Krankenhaus (Abbildung 3a) durchgeführt, b) eine gebogene Hornhaut , die schließlich führt zu Abstoßungsreaktionen durch hohe Descemet-Falten und hohe Endothelzellschäden unter Verwendung eines Spaltlampenmikroskop. Eine solche Hornhaut ist in der Regel für res verwendetcrystal oder verworfen wird. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Methode verwendet, um eine genaue Exzision des retinalen Gewebes sicherzustellen. A) Grundlagen zur Lederhaut aus dem Augapfel mit 24mm Klinge mit 95 mm gebogen oder stumpfen Ende einer sterilen Schere und 100 mm 11x2 von 0,70 mm Zähne sterilen Pinzette regiert. Die Sklera sollte, indem die eine Seite mit der Pinzette Schneiden Sie ihn gerade zum Sehnerv hin mit Hilfe der Schere geschnitten werden. Die Aderhaut wird nun leicht gesehen werden, b) Verwendung von zwei 100 mm 11x2 von 0,70 mm Zähne sterilen Pinzette ausgeschlossen, Aderhaut wird durch Abreißen entfernt, das zeigt die zugrunde liegenden transparenten Schicht der Netzhaut, c) Transparente Schicht der Netzhaut wird sehr sorgfältig in der Nähe exzidiert der Sehnerv ohne Ausscheidung von Glaskörperfluid mit den gleichen Zange. Sowohl die Zange halten sollte jede Seite der Netzhaut, und das Gewebe sollte vorsichtig entfernt werden starting in der Nähe des Sehnervs Weg zu der Hornhaut, um eine gute Menge von Netzhaut-Gewebe zu erhalten. Das Gewebe könnte in verschiedenen Größen geschnitten werden und für die Analyse Versuche, d) verschiedene Schichten des Auges nach Entfernen der Hornhaut kann in dieser Figur gesehen werden. Die Choroidea Körper entfernten ersten gefolgt von Retina ohne Beschädigung der anderen Teile des Auges. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> 3. Vergleich der verschiedenen Zelltypen Dichte und Morphologie unter 100-facher Vergrößerung eines optischen Mikroskop betrachtet. A) Gute Endothelzelldichte (&gt; 2200 Zellen / mm 2) und Morphologie (weniger Polymorphismus niedrigen Degeneration, keine Dystrophie und 0% Mortalität) in einer Hornhaut, die für eine Transplantation geeignet ist, b) Mangelhaft Endothelzellen Dichte (etwa 1200 bis 1400 Zellen / mm 2) und Morphologie (sehr hohen Polymorphismus und DegenerationZusammenarbeit von Zellen) zusammen mit etwa 30-40% Gesamtmortalität Nach Trypanblau-Färbung beobachtet, c) Ein Teil der endothelialen Zellen geschädigt werden durch Lösen eines Endothelzellen Folie beim Abrufen der Hornhaut von Augapfel. Dies wird durch Beobachtung der Mortalität der Zellen in der Region durch Trypanblau gefärbt bestätigt, d) die Descemetsche Falten aufgrund falscher Handhabung der Hornhaut durch Biegen, wodurch Querschnitt Hornhaut Spannung unter Verwendung von Instrumenten stark usw. an die Exzision ausgebildet. Die Abbildung zeigt die dicke entwickelten iatrogene Falten zwischen Peripherie und optischen Zone der Hornhaut gefunden. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Schäden an der Aderhaut und Netzhaut-Gewebe während Exzision der Hornhaut führt schließlich zu einer Ausscheidung von Glaskörperfluid. Die Netzhaut wird im Glaskörper verwickelt macht es schwierig, eine gute Qualität Verbrauchsteuern Gewebe wiThout Kontamination. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der Reihe von Aktivitäten durchgeführt, unter Verwendung von humanen okulären Globen Jahren 2009 und 2010 der Fondazione Banca degli Occhi (Venezia, Italien). Etwa 60% der Gewebe wurden zur Transplantation verwendet, womit eine hohe Anzahl von Augen-Kugeln (ca. 40%) für wissenschaftliche und medizinische Forschung. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="Ergänzende Abbildung 1" /> Ergänzende Abbildung 1. Anatomie des menschlichen Auges 5. Verschiedene Teile des menschlichen Auges in dieser Figur gezeigt ist, verwendet, um die genaue Position der Gewebe folgen.

<ol><li>Fay, A. Diseases of the visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFay%2C+A+%22Cecil+Medicine%22">Cecil Medicine</a>. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).</li>
<li>Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+in+Limbal+Stem+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents in Limbal Stem Cell Biology.</a> Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).</li>
<li>Pharm, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eye%3A+The+physiology+of+human+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Britannica+educational+publishing%22%5BJournal%5D)">The Eye: The physiology of human perception.</a> Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).</li>
<li>Lang, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLang%2C+G+%22Ophthalmology%3A+A+pocket+textbook+atlas%22">Ophthalmology: A pocket textbook atlas</a>. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.</li>
<li>Liesbeth, P. els <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Culture%3A+The+method+of+choice+for+preservation+of+human+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).</li>
<li>Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).</li>
<li>Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+Mouse+Vitreous+and+Retina+for+Proteomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses.</a> J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Sowohl richtige Exzision und Haltbarmachung von Hornhaut und Netzhaut-Gewebe sind kritisch, da kleinere Mängel wie endotheliale Schäden oder hohe Anzahl von Descemet-Falten können Transplantatversagen der Hornhaut während Temperaturänderungen oder falscher Handhabung kann die Integrität der retinalen Gewebe Kompromittierung führen. Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, wie Hornhaut und Netzhaut-Gewebe optimal isoliert werden kann, ohne Schäden oder Veränderungen zu induzieren, die ihre Verwendung zur Transplantation ...

Materialien für die Exzision der Hornhaut und Netzhaut. <table border="1"><tbody><tr><td> Produktbeschreibung </td><td> Größe </td><td> Unternehmen / Institut </td></tr><tr><td> Bewachter Einweg-Skalpell </td><td> Blade-Größe 15 </td><td> Swann-Morton </td></tr><tr><td> Sterile Bandagen </td><td> 5 cm x 5 cm, 8 geschichteten, 5 Stück </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> Sterile medizinische Einwegprodukte Handtuch </td><td> 35 x 50 cm </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> Einer sterilen Schere </td><td> Klingen 24 mm / Gesamtlänge. 95 mm gebogen, stumpf </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Einer sterilen Pinzette </td><td> Edelstahl -100 mm 11 x 2 von 0,70 mm Zähne ausgeschlossen </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Hornhaut-Kralle - medizinische Einwegprodukte </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> Die Vorbereitungen </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 100 ml PBS [10x] in 900 ml D / W (destilliertes Wasser) </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Na-Thiosulfat </td><td> 1 g Na-Thiosulfat in 1 Liter PBS [1x] </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 5 g I-PVP in 1-Liter D / W </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die Tabelle beschreibt die Materialien für die Exzision der Hornhaut und der Netzhaut und die Firma erhielt sie aus verwendet werden. Materialien für Speichermedium (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Komponenten </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td></tr><tr><td> MEM(1X) Flüssigkeit </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 ml </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Antibiotikum / Antimykotikum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5955-20ML </td><td> 10 ml / l </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Serum von neugeborenen Kälbern </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Materialien für Speichermedium. Herstellung von Speichermedium Alle Zutaten mit den spezifischen Konzentrationen wie oben in ein Glas gegeben und gut mischen. Filtern siemit Porengröße von 0,2 Mikron-Filter (Millipore, Mailand, Italien) mit Hilfe einer Schlauchpumpe. Bewahren Sie das Medium in den Flaschen bei RT. Materialien für die Transportmittel (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Komponenten </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td></tr><tr><td> MEM (1X) Flüssigkeit </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 ml </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> Serum von neugeborenen Kälbern </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td&gt; <td> 40 ml </td></tr><tr><td> Dextran T500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 g / l) </td><td> 120 g / l </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Material für Transportmedium. Vorbereitung der Transportmedium Fügen Sie Dextran 6% in ~ 1,5 Liter MEM und lassen es über Nacht. Fügen Sie die restlichen Zutaten in den Medien und Filter mit 0,2-Mikrometer-Filter (Millipore, Mailand, Italien) mit einer Vakuumpumpe. Bewahren Sie das Medium in den Flaschen bei RT.

ein vereinfachtes verfahren für<em&gt; in-situ</em&gt; exzision der hornhaut und der netzhaut ausweiden von gewebe aus menschlichen augapfel

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enukleation ist der Prozess, das Abrufen des Augapfels aus einer Leichenspender Verlassen der Rest der Welt ungestört. Exzision bezieht sich auf den Abruf von Augengewebe, insbesondere Hornhaut, indem er getrennt von dem Augapfel. Ausweiden ist der Prozess des Entfernens der inneren Organe hier genannten Netzhaut. Der Augapfel besteht aus der Hornhaut, der Lederhaut, den Glaskörper, die Linse, der Iris, der Netzhaut, der Aderhaut, Muskeln etc. (Suppl. Abbildung 1). Wenn ein Patient aus Hornhautschäden leiden, muss die Hornhaut entfernt werden und ein gesundes muss man durch keratoplastischer Operationen transplantiert werden. Genetische Störungen oder Defekte in der Netzhaut-Funktion kann beeinträchtigt Vision. Menschliche Auge Globen kann für verschiedene chirurgische Verfahren wie Augen-Banking, Transplantation menschlicher Hornhaut oder Lederhaut und Forschung auf Augengeweben verwendet werden. Allerdings gibt es wenig Informationen über die menschliche Hornhaut und Netzhaut-Exzision, wahrscheinlich aufgrund der limited Zugang zu menschlichen Geweben. Die meisten Studien beschreiben ähnliche Verfahren an Tiermodellen durchgeführt. Forscher verlassen sich auf die Verfügbarkeit von gut präpariert und gut erhaltenen Augengeweben um das Wissen über menschliche Auge Entwicklung, Homöostase und Funktion zu verlängern. Da wir hohe Menge an okularen Globen, aus denen ca. 40% erhalten (Tabelle 1) von ihnen zu Forschungszwecken verwendet werden, sind wir in der Lage, sehr große Menge von Experimenten an diesen Geweben führen, definieren Techniken, um Verbrauchsteuern und bewahren Sie sie regelmäßig. Die Hornhaut ist eine avaskuläre Gewebe, das die Übertragung von Licht auf die Netzhaut ermöglicht und zu diesem Zweck sollte immer ein gutes Maß an Transparenz. Innerhalb der Hornhaut, hilft der Limbus Region, die ein Reservoir der Stammzellen ist, den Wiederaufbau von Epithelzellen und beschränkt die Wucherung der Bindehaut Aufrechterhaltung Hornhaut Transparenz und Klarheit. Die Größe und th<html> ickness der Hornhaut sind entscheidend für die klare Vision, wie Änderungen in einer von ihnen ablenken, unklare Vision führen könnte. Die Hornhaut besteht aus 5 Schichten: a) Epithel, b) Bowman-Schicht, c) Stroma, d) Descemetschen Membran und e) Endothel. Alle Schichten sollten einwandfrei funktionieren, um sicherzustellen, klare Vision 4,5,6. Die Aderhaut ist die Zwischenschicht zwischen der Tunika Sklera und der Retina, auf der Innenseite durch die Bruch-Membran begrenzt und ist verantwortlich für den Blutfluss in die Augen. Die Choroidea hilft auch, um die Temperatur und liefert Nahrung zu den äußeren Schichten der Netzhaut 5,6 zu regeln. Die Retina ist eine Schicht von Nervengewebe, das die Rückseite des Augapfels (Suppl. 1) umfasst und besteht aus zwei Teilen: einem lichtempfindlichen Teil und einen nicht-empfänglichen Teil. Die Netzhaut hilft, das Licht von der Hornhaut und der Linse zu erhalten und wandelt sie in der chemischen Energie schließlich an das Gehirn mit Hilfe des Sehnervs 5,6 übertragen. ove_content &quot;&gt; Das Ziel dieses Papiers ist es, ein Protokoll für die Präparation des Hornhaut-und Netzhaut-Gewebe aus menschlichen Auges Globen stellen. Vermeidung von Kreuzkontaminationen in das umgebende Gewebe und die Erhaltung RNA-Integrität ist von fundamentaler Bedeutung als solche Gewebe zu Forschungszwecken ausgerichtet sind unverzichtbar an (i) die Charakterisierung der Transkriptom der Augengewebe, (ii) Isolierung von Stammzellen für die regenerative Medizin-Projekte, und (iii) Bewertung der histologischen Unterschiede zwischen den Geweben von normal / den betroffenen Fächern. In diesem Beitrag beschreiben wir die Technik, die wir derzeit zur Entfernung Die Hornhaut, die Aderhaut und Netzhaut-Gewebe aus einem Augapfel. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Sezieren des menschlichen Augapfels und der Entfernung der Hornhaut und Netzhaut-Gewebe. Das dazugehörige Video wird den Forschern helfen, eine geeignete Technik für den Abruf lernen von kostbaren menschlichen Geweben, die schwer zu finden sind regelmäßig.

Das Papier beschreibt ein vereinfachtes Verfahren zur Hornhaut-und Verbrauchssteuern zu retinalen Gewebe aus dem Augapfel von menschlichen Leichen Spendern auszuhöhlen. Die hier beschriebene Technik wird verbrauchsteuerpflichtige guter Qualität zu Geweben zur Transplantation oder chirurgische Zwecke oder Forschungszwecke ohne Beschädigung anderer Gewebe des Augapfels verwendet werden zu helfen.

Ein vereinfachtes Verfahren für<em&gt; In-situ</em&gt; Exzision der Hornhaut und der Netzhaut Ausweiden von Gewebe aus menschlichen Augapfel

Die Enukleation ist das Verfahren zur Entnahme des Augapfels von einem Leichenspender, bei dem die übrigen Strukturen des Auges ungestört bleiben. Die Exzision bezieht sich auf die ...

Heute demonstrieren wir eine vereinfachte Technik zur Entnahme von Hornhaut- und Netzhautgewebe aus dem Augapfel menschlicher Spender nach dem Tod. Die hier beschriebene Methode wird helfen, Gewebe von guter Qualität für Transplantationen, chirurgische Eingriffe und Forschungszwecke zu gewinnen, ohne anderes Gewebe des Augapfels zu beschädigen. Mit 18 Jahren Erfahrung und Tausenden von jährlich transplantierten Hornhäuten haben wir durch die Entwicklung neuer Techniken und die ständige Verbesserung unserer Fähigkeiten einen hohen Standard in unserer Arbeit beibehalten.Um dies zu erreichen, bearbeiten wir zuerst die Hornhaut, gefolgt von den Netzhaut-Präparaten. Die Hornhaut ist ein avaskuläres Gewebe, das die Durchlässigkeit von Licht zur Netzhaut ermöglicht und zu diesem Zweck stets einen guten Grad an Transparenz bewahren sollte. Die Hornhaut besteht aus fünf Schichten: Epithel, Bowman-Schicht, Stroma, Descemet-Membran und Endothel.Wenn die Hornhaut beschädigt ist, kann sie mithilfe einer geeigneten Spenderhornhaut ersetzt werden. Die Aderhaut ist die mittlere Tunika zwischen Sklera und Netzhaut, die innen durch die Bruch-Membran begrenzt ist und für den Blutfluss im Auge verantwortlich ist. Eine geeignete Enukleation der Aderhaut ist ebenso wichtig wie die Entfernung der Netzhaut.Die Netzhaut hilft dabei, das Licht von der Hornhaut und Linse aufzunehmen und in chemische Energie umzuwandeln, die schließlich über den Sehnerv an das Gehirn weitergeleitet wird. Da der Sehnerv transparent und empfindlich ist, sollte er systematisch entnommen werden, um eine Gewebeprobe von guter Qualität zu erhalten. Schalten Sie den laminaren Luftstromschrank ein.Reinigen Sie die laminare Flusswerkbank mit 70 % Isopropanol. Legen Sie persönliche Schutzausrüstung an, wie zum Beispiel chirurgische Haube, sterile Handschuhe und Schürzenärmel. Richten Sie unter aseptischen Bedingungen den sterilen Bereich ein, indem Sie ein steriles Tuch und ein vosterilisiertes InstrumentenTablett platzieren.Öffnen Sie aseptisch die sterile Instrumentenschale und kippen Sie sie auf das sterile Feld, wobei jegliche Kontamination vermieden werden muss. Positionieren Sie alle sterilen Materialien und Instrumente im sterilen Feld und stellen Sie die Augenbehälter mit den Augäpfeln so auf, dass sie nahe am Rand des sterilen Feldes stehen. Der besseren Handhabung halber beschriften Sie die Flaschen mit dem vorbereiteten Lagermedium und stellen Sie die Iod-Polyol-Pyro-Kappe auf Natriumthiosulfat sowie eine sterile Phosphatpuffer-Salzlösung bereit.Außerhalb der sterilen Zufuhr lassen Sie das okulare Gewebe und die Lösungen auf normale Raumtemperatur ansteigen, da sie bei vier Grad Celsius in Kühlschränken aufbewahrt werden. Vermeiden Sie wiederholte Aufwärme- oder Abkühlzyklen. Entfernen Sie Tupfer und Schwämme mit sterilen Pinzetten aus dem Augenbehälter.Legen Sie das Augapfel auf das Lid und entfernen Sie die zusätzlichen Verbände. Heben Sie das Augapfel vorsichtig mit dem Sehnerv auf und tauchen Sie das Augapfel in sterile. IPVP zur Desinfektion der Augäpfel in steriler IPVP für zwei Minuten.Überführen Sie das Bulbusgewebe für eine Minute in sterilisiertes Natriumsulfat. Überführen Sie die Bulbi anschließend in sterile Phosphatpufferlösung und belassen Sie sie dort, bis sie weiterverarbeitet werden. Arbeiten Sie unterhalb der laminaren Luftströmungshaube, waschen Sie das okulare Bulbusgewebe aus der PBS-Lösung und legen Sie es in den sterilen Bereich.Umwickeln Sie das Augapfelglobus mit Steroid, wobei die Hornhaut und etwa fünf Millimeter Sklera ab der Hornhaut freigelassen werden. Der Augapfel kann einfach in der Hand gehalten werden. Halten Sie den erforderlichen Druck mit sterilen Scheren aufrecht. Entfernen Sie alle eventuellen Reste der Bindehaut, ohne die Hornhaut zu beschädigen.Verwenden Sie eine Einweg-Skalpellschneide, um einen skleralen Schnitt im Abstand von drei bis vier Millimetern zur Limbusregion durchzuführen. Erweitern Sie den Schnitt anschließend um 360 Grad, wobei darauf zu achten ist, das darunterliegende Uveagewebe nicht zu perforieren oder eine Deformation der normalen Krümmung der Hornhaut zu verursachen. Führen Sie vier große Schnitte aus, die vier kleine Lücken lassen, um eine Ausscheidung des Glaskörpers zu vermeiden.Alle vier Lücken werden ausgeschnitten, wobei sichergestellt wird, dass kein anderes Gewebe entfernt wird. Das Vorhandensein kleiner skleraler Plaques kann das Schneiden erschweren; stellen Sie daher mithilfe von Mikrochirurgiescheren die vollständige sklerale Exzision sicher. Dieser Eingriff sollte durchgeführt werden, ohne die Aderhaut, Netzhaut und Glaskörper zu beschädigen.Überprüfen Sie den Einschnitt, um sicherzustellen, dass er vollständig ist. Wenn der Einschnitt korrekt durchgeführt wurde, bleibt der korneosklerale Rand nur an der Stelle, die der Kornea entspricht, am Ziliarkörper haften. Legen Sie den Augapfel mit der Rippe nahe der Mitte der sterilen Unterlage ab. Entfernen Sie die Kornea vollständig mithilfe einer sterilen Pinzette. Halten Sie den skleralen Rand stationär und excidieren Sie den Kornea-Sklera-Rand vom okularen Glühen weg. Lösen Sie vorsichtig alle verbleibenden angrenzenden Strukturen vom korneoskleralen Knopf. Ziehen Sie niemals am korneoskleralen Rand in einer Weise, die eine Querspannung über die Kornea verursachen könnte, und lassen Sie ihn niemals wieder in die vordere Augenkammer zurückfallen.Die endotheliale Zelldichte der Hornhaut wird mithilfe einer hypotonen Lösung überprüft und die Zellsterblichkeit durch eine Färbung mit Trypanblau für etwa eine Minute nachgewiesen. Entfernen Sie die Trypanblau-Färbung auf einem sterilen Drahtsieb und waschen Sie die Hornhäute in steriler PBS-Lösung. Überführen Sie sie in eine sterile Petrischale, die mit einer Zuckeraufschlämmung gefüllt ist.Diese Lösung hilft, ein hypotonisches Milieu zu erzeugen, und ermöglicht die visuelle Identifizierung der Zellen. Anschließend werden die Zellen unter einem optischen Mikroskop bei einer hundertfachen Vergrößerung gezählt und als Zellen pro Quadratmillimeter gemessen. Üblicherweise wird die Zelldichte hinsichtlich morphologischer Merkmale wie interzelluläre Grenzen, Polymorphismus, Degeneration, Dystrophie und Zellsterblichkeit untersucht.Die Hornhautdicke ist neben einer guten Transparenz der exzidierten Hornhaut auch ein wichtiges Merkmal für die Transplantation. Ein steriles Hornhaut-CLO wird verwendet, um die Hornhaut am Skleralrand zu fixieren, das Hornhaut-CLO wird gebogen, um eine ausreichende Öffnung des Lochs sicherzustellen, um den Skleralrand zu verriegeln, anschließend wird der Hornhaut-Skleral-Rand mittels einer Hornhautpinzette in das zuvor vorbereitete, bei Raumtemperatur hergestellte Hornhautlagerungsmedium überführt. Die Hornhaut sollte danach während der vierwöchigen Lagerung bei 31 Grad SIU aufbewahrt werden.Das Lagermedium wird mehreren mikrobiologischen Tests unterzogen, die mit einem B 9 2 4 0-Gerät durchgeführt werden. Während der Lagerung nimmt die Hornhaut an Dicke zu und überschreitet damit die für eine Transplantation erforderliche Normgröße. Augenbanken verwenden D-Schwellungsmittel, um die Dicke zu reduzieren. 6% Dextron T 500 wird verwendet, um die Hornhaut wieder auf ihre normale Größe zu bringen, und dient gleichzeitig als Transportmedium.Reinigen Sie die sterilen Instrumente mit RNA-app, um eine RNase-freie Umgebung vor der Entfernung der Netzhaut zu schaffen. Bereiten Sie den sterilen Arbeitsbereich vor und vergewissern Sie sich, dass der Augapfel intakt ist und nur die Hornhaut sowie der sklerale Rand entfernt wurden. Wenn der Glaskörper Sekret bildet, wird es schwierig, das Netzhautgewebe zu entfernen.Wenn der Spender unter 65 Jahren alt ist, wird die Sklera nach serologischer Testung aus Gründen der chirurgischen Verwendung in 70 %igem Alkohol konserviert. In solchen Fällen wird die Sklera nicht zerschnitten, lediglich der Glaskörper wird entfernt, und die gesamte Sklera wird zur Netzhautentfernung aufbewahrt. Beginnen Sie mit einem kleinen Schnitt oder einer Inzision nahe der Hornhautseite der Sklera und bewegen Sie sich mit sterilen Pinzetten und Scheren in Richtung Sehnerv.Halten Sie den Teil der Sklera mit sterilen Pinzetten fest und schneiden Sie mit der Schere Stück für Stück gerade in Richtung des Sehnervs, wobei Sie eine Beschädigung des Glaskörpers vermeiden. Die Chorioidealstopfen sollten von der Sklera getrennt werden, da sie zusammenhängen. Schneiden Sie die gesamte Sklera auf, um das Chorioidealgewebe freizulegen. Was?Nachdem die Sklera vollständig durchtrennt ist, trennen Sie die Sklera unter Schnittführung in der Nähe des Sehnervs von den verbleibenden Geweben; nun wird eine komplette Chorioidea-Schicht sichtbar, die den Glaskörper bedeckt. Füllen Sie diese sterilen, RNAsefreien Sammelröhrchen mit zwei ml RL, und verwenden Sie dazu zwei sterile Pinzetten. Entfernen Sie die Chorioidaschicht vorsichtig, indem Sie den Sehnerv mit einem Paar Pinzetten anheben und die Chorioida mit der anderen Pinzette abheben.Trennen Sie die Aderhaut teilweise ab und schneiden Sie sie ein, um die Entfernung zu erleichtern. Die Aderhautschicht kann mit einer Schere geschnitten werden, wobei Schäden an der Retina vermieden werden sollten. Legen Sie die entfernte Aderhautschicht in die RNA later-Lösung und bewahren Sie sie 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf.Entfernen Sie das gesamte zusätzliche Choroidea, um das Retinagewebe freizulegen. Sobald die gesamte Choroideaschicht entfernt ist, wird eine transparente Netzhautschicht sichtbar sein. Deutlich ist, dass die Choroideaschicht eine innere Bruch-Membran aufweist, die ebenfalls entfernt werden könnte, jedoch ist es schwierig, diese mit bloßem Auge zu identifizieren.Entsprechend zwei Pinzetten verwenden, um die Netzhautschicht zu entfernen. Es ist einfach, eine große Menge Netzhaut zu isolieren, wenn nahe am Sehnerv ausgeschnitten wird. Alle Schichten des Auges sind nun sichtbar.Legen Sie die exzidierte Retina in die RNA later-Lösung und lagern Sie sie 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Isopropanol. Die mit Trypanblau gefärbten endothelialen Zellen können unter 100-facher Vergrößerung eines invertierten Mikroskops betrachtet werden.Eine geeignete Hornhaut mit mehr als 200 Zellen pro Quadratmillimeter wird gewöhnlich für die spätere Verwendung konserviert. Die Bewertung ihrer Qualität von mittelmäßig bis ausgezeichnet ist hilfreich für vergleichende Studien. Sobald die Hornhaut in der Regel für die Transplantation vorbereitet ist, werden Dicke und Transparenz erfasst, und eine geeignete Hornhaut wird für eine penetrierende Keratoplastik verwendet, bei der die gesamte Hornhaut transplantiert wird.Die Zellsterblichkeit wird durch Beobachtung angefärbter blauer Zellen überprüft und in Prozent der abgestorbenen Zellen bewertet. Eine Gesamtzellsterblichkeit von mehr als 2 % gilt während der Konservierung als ungeeignet. Wenn die Zelldichte unter 2200 Zellen pro Quadratmillimeter liegt oder eine Schädigung aufgrund der Sterblichkeit vorliegt, könnte die Hornhaut für eine vordere laminare Keratoplastie verwendet werden.Wenn die vordere Trauma beschädigt ist und die Hornhaut eine gute endotheliale Zelldichte aufweist, könnte die Hornhaut für eine hintere laminare Keratoplastik verwendet werden. Die Dicke der Hornhaut nimmt während der Organkultur normalerweise zu. Das Transportmedium hilft dabei, ihre normale Form und Struktur wiederherzustellen.Außerdem unterstützt die Organkultur die Reepithelialisierung der Hornhaut und ermöglicht aufgrund ihrer langen Lagerfähigkeit eine geeignete Spenderauswahl. Mikrobiologische und serologische Untersuchungen können durchgeführt werden. Sie bietet ausreichend Zeit, um einen Eingriff zu planen, und hilft dabei, die endotheliale Zelldichte und -morphologie zu überprüfen, wenn dies aufgrund einer hohen postmortalen Zeit nicht möglich ist.Daher können die Hornhäute, sofern das beschriebene Verfahren befolgt wird, ohne jegliche Schädigung anderer Gewebe ausgeschnitten werden. Falls die Hornhaut nicht für eine Transplantation geeignet ist, kann sie zu Forschungszwecken verwendet werden, um neue Kulturmedien und Konservierungsbedingungen zu entwickeln, um Augenoberflächenkrankheiten zu untersuchen, limbahale Stammzellen zu isolieren und die Wirkung von Arzneimitteln auf die Hornhaut zu erforschen. Bei der Netzhaut können wir eine Kreuzkontamination der RNA-Proben mit Zent-Geweben vermeiden und die RNA-Integrität bewahren, was von grundlegender Bedeutung ist.Diese für Forschungszwecke unverzichtbaren Gewebe dienen der Charakterisierung des Transkriptoms der okularen Gewebe, der Isolierung von Stammzellen für Projekte der regenerativen Medizin sowie der Bewertung histologischer Unterschiede zwischen Geweben von gesunden oder betroffenen Probanden. Sobald das Netzhautgewebe entfernt wurde, kann es für verschiedene Zwecke verwendet werden, weshalb die nachfolgenden Schritte und Bedingungen für die Konservierung entsprechend variieren können. Beispielsweise kann das Netzhautgewebe in Röhrchen mit RNA-Stabilisierungsreagenzien wie R Nator oder Thisis-Puffer zur RNA- oder DNA-Extraktion, oder mit Dispase beziehungsweise Trypsin zur Zellisolierung aufbewahrt werden.Fixierungslösungen, bevor Gewebe für die Immunhistochemie in Paraffin oder OCT eingebettet werden. Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihrer Forschung.

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