Ein vereinfachtes Verfahren für

Heute demonstrieren wir eine vereinfachte Technik zur Entnahme von Hornhaut- und Netzhautgewebe aus dem Augapfel menschlicher Spender nach dem Tod. Die hier beschriebene Methode wird helfen, Gewebe von guter Qualität für Transplantationen, chirurgische Eingriffe und Forschungszwecke zu gewinnen, ohne anderes Gewebe des Augapfels zu beschädigen. Mit 18 Jahren Erfahrung und Tausenden von jährlich transplantierten Hornhäuten haben wir durch die Entwicklung neuer Techniken und die ständige Verbesserung unserer Fähigkeiten einen hohen Standard in unserer Arbeit beibehalten.

Um dies zu erreichen, bearbeiten wir zuerst die Hornhaut, gefolgt von den Netzhaut-Präparaten. Die Hornhaut ist ein avaskuläres Gewebe, das die Durchlässigkeit von Licht zur Netzhaut ermöglicht und zu diesem Zweck stets einen guten Grad an Transparenz bewahren sollte. Die Hornhaut besteht aus fünf Schichten: Epithel, Bowman-Schicht, Stroma, Descemet-Membran und Endothel.

Wenn die Hornhaut beschädigt ist, kann sie mithilfe einer geeigneten Spenderhornhaut ersetzt werden. Die Aderhaut ist die mittlere Tunika zwischen Sklera und Netzhaut, die innen durch die Bruch-Membran begrenzt ist und für den Blutfluss im Auge verantwortlich ist. Eine geeignete Enukleation der Aderhaut ist ebenso wichtig wie die Entfernung der Netzhaut.

Die Netzhaut hilft dabei, das Licht von der Hornhaut und Linse aufzunehmen und in chemische Energie umzuwandeln, die schließlich über den Sehnerv an das Gehirn weitergeleitet wird. Da der Sehnerv transparent und empfindlich ist, sollte er systematisch entnommen werden, um eine Gewebeprobe von guter Qualität zu erhalten. Schalten Sie den laminaren Luftstromschrank ein.

Reinigen Sie die laminare Flusswerkbank mit 70 % Isopropanol. Legen Sie persönliche Schutzausrüstung an, wie zum Beispiel chirurgische Haube, sterile Handschuhe und Schürzenärmel. Richten Sie unter aseptischen Bedingungen den sterilen Bereich ein, indem Sie ein steriles Tuch und ein vosterilisiertes InstrumentenTablett platzieren.

Öffnen Sie aseptisch die sterile Instrumentenschale und kippen Sie sie auf das sterile Feld, wobei jegliche Kontamination vermieden werden muss. Positionieren Sie alle sterilen Materialien und Instrumente im sterilen Feld und stellen Sie die Augenbehälter mit den Augäpfeln so auf, dass sie nahe am Rand des sterilen Feldes stehen. Der besseren Handhabung halber beschriften Sie die Flaschen mit dem vorbereiteten Lagermedium und stellen Sie die Iod-Polyol-Pyro-Kappe auf Natriumthiosulfat sowie eine sterile Phosphatpuffer-Salzlösung bereit.

Außerhalb der sterilen Zufuhr lassen Sie das okulare Gewebe und die Lösungen auf normale Raumtemperatur ansteigen, da sie bei vier Grad Celsius in Kühlschränken aufbewahrt werden. Vermeiden Sie wiederholte Aufwärme- oder Abkühlzyklen. Entfernen Sie Tupfer und Schwämme mit sterilen Pinzetten aus dem Augenbehälter.

Legen Sie das Augapfel auf das Lid und entfernen Sie die zusätzlichen Verbände. Heben Sie das Augapfel vorsichtig mit dem Sehnerv auf und tauchen Sie das Augapfel in sterile. IPVP zur Desinfektion der Augäpfel in steriler IPVP für zwei Minuten.

Überführen Sie das Bulbusgewebe für eine Minute in sterilisiertes Natriumsulfat. Überführen Sie die Bulbi anschließend in sterile Phosphatpufferlösung und belassen Sie sie dort, bis sie weiterverarbeitet werden. Arbeiten Sie unterhalb der laminaren Luftströmungshaube, waschen Sie das okulare Bulbusgewebe aus der PBS-Lösung und legen Sie es in den sterilen Bereich.

Umwickeln Sie das Augapfelglobus mit Steroid, wobei die Hornhaut und etwa fünf Millimeter Sklera ab der Hornhaut freigelassen werden. Der Augapfel kann einfach in der Hand gehalten werden. Halten Sie den erforderlichen Druck mit sterilen Scheren aufrecht. Entfernen Sie alle eventuellen Reste der Bindehaut, ohne die Hornhaut zu beschädigen.

Verwenden Sie eine Einweg-Skalpellschneide, um einen skleralen Schnitt im Abstand von drei bis vier Millimetern zur Limbusregion durchzuführen. Erweitern Sie den Schnitt anschließend um 360 Grad, wobei darauf zu achten ist, das darunterliegende Uveagewebe nicht zu perforieren oder eine Deformation der normalen Krümmung der Hornhaut zu verursachen. Führen Sie vier große Schnitte aus, die vier kleine Lücken lassen, um eine Ausscheidung des Glaskörpers zu vermeiden.

Alle vier Lücken werden ausgeschnitten, wobei sichergestellt wird, dass kein anderes Gewebe entfernt wird. Das Vorhandensein kleiner skleraler Plaques kann das Schneiden erschweren; stellen Sie daher mithilfe von Mikrochirurgiescheren die vollständige sklerale Exzision sicher. Dieser Eingriff sollte durchgeführt werden, ohne die Aderhaut, Netzhaut und Glaskörper zu beschädigen.

Überprüfen Sie den Einschnitt, um sicherzustellen, dass er vollständig ist. Wenn der Einschnitt korrekt durchgeführt wurde, bleibt der korneosklerale Rand nur an der Stelle, die der Kornea entspricht, am Ziliarkörper haften. Legen Sie den Augapfel mit der Rippe nahe der Mitte der sterilen Unterlage ab. Entfernen Sie die Kornea vollständig mithilfe einer sterilen Pinzette.

Halten Sie den skleralen Rand stationär und excidieren Sie den Kornea-Sklera-Rand vom okularen Glühen weg. Lösen Sie vorsichtig alle verbleibenden angrenzenden Strukturen vom korneoskleralen Knopf. Ziehen Sie niemals am korneoskleralen Rand in einer Weise, die eine Querspannung über die Kornea verursachen könnte, und lassen Sie ihn niemals wieder in die vordere Augenkammer zurückfallen.

Die endotheliale Zelldichte der Hornhaut wird mithilfe einer hypotonen Lösung überprüft und die Zellsterblichkeit durch eine Färbung mit Trypanblau für etwa eine Minute nachgewiesen. Entfernen Sie die Trypanblau-Färbung auf einem sterilen Drahtsieb und waschen Sie die Hornhäute in steriler PBS-Lösung. Überführen Sie sie in eine sterile Petrischale, die mit einer Zuckeraufschlämmung gefüllt ist.

Diese Lösung hilft, ein hypotonisches Milieu zu erzeugen, und ermöglicht die visuelle Identifizierung der Zellen. Anschließend werden die Zellen unter einem optischen Mikroskop bei einer hundertfachen Vergrößerung gezählt und als Zellen pro Quadratmillimeter gemessen. Üblicherweise wird die Zelldichte hinsichtlich morphologischer Merkmale wie interzelluläre Grenzen, Polymorphismus, Degeneration, Dystrophie und Zellsterblichkeit untersucht.

Die Hornhautdicke ist neben einer guten Transparenz der exzidierten Hornhaut auch ein wichtiges Merkmal für die Transplantation. Ein steriles Hornhaut-CLO wird verwendet, um die Hornhaut am Skleralrand zu fixieren, das Hornhaut-CLO wird gebogen, um eine ausreichende Öffnung des Lochs sicherzustellen, um den Skleralrand zu verriegeln, anschließend wird der Hornhaut-Skleral-Rand mittels einer Hornhautpinzette in das zuvor vorbereitete, bei Raumtemperatur hergestellte Hornhautlagerungsmedium überführt. Die Hornhaut sollte danach während der vierwöchigen Lagerung bei 31 Grad SIU aufbewahrt werden.

Das Lagermedium wird mehreren mikrobiologischen Tests unterzogen, die mit einem B 9 2 4 0-Gerät durchgeführt werden. Während der Lagerung nimmt die Hornhaut an Dicke zu und überschreitet damit die für eine Transplantation erforderliche Normgröße. Augenbanken verwenden D-Schwellungsmittel, um die Dicke zu reduzieren. 6% Dextron T 500 wird verwendet, um die Hornhaut wieder auf ihre normale Größe zu bringen, und dient gleichzeitig als Transportmedium.

Reinigen Sie die sterilen Instrumente mit RNA-app, um eine RNase-freie Umgebung vor der Entfernung der Netzhaut zu schaffen. Bereiten Sie den sterilen Arbeitsbereich vor und vergewissern Sie sich, dass der Augapfel intakt ist und nur die Hornhaut sowie der sklerale Rand entfernt wurden. Wenn der Glaskörper Sekret bildet, wird es schwierig, das Netzhautgewebe zu entfernen.

Wenn der Spender unter 65 Jahren alt ist, wird die Sklera nach serologischer Testung aus Gründen der chirurgischen Verwendung in 70 %igem Alkohol konserviert. In solchen Fällen wird die Sklera nicht zerschnitten, lediglich der Glaskörper wird entfernt, und die gesamte Sklera wird zur Netzhautentfernung aufbewahrt. Beginnen Sie mit einem kleinen Schnitt oder einer Inzision nahe der Hornhautseite der Sklera und bewegen Sie sich mit sterilen Pinzetten und Scheren in Richtung Sehnerv.

Halten Sie den Teil der Sklera mit sterilen Pinzetten fest und schneiden Sie mit der Schere Stück für Stück gerade in Richtung des Sehnervs, wobei Sie eine Beschädigung des Glaskörpers vermeiden. Die Chorioidealstopfen sollten von der Sklera getrennt werden, da sie zusammenhängen. Schneiden Sie die gesamte Sklera auf, um das Chorioidealgewebe freizulegen. Was?

Nachdem die Sklera vollständig durchtrennt ist, trennen Sie die Sklera unter Schnittführung in der Nähe des Sehnervs von den verbleibenden Geweben; nun wird eine komplette Chorioidea-Schicht sichtbar, die den Glaskörper bedeckt. Füllen Sie diese sterilen, RNAsefreien Sammelröhrchen mit zwei ml RL, und verwenden Sie dazu zwei sterile Pinzetten. Entfernen Sie die Chorioidaschicht vorsichtig, indem Sie den Sehnerv mit einem Paar Pinzetten anheben und die Chorioida mit der anderen Pinzette abheben.

Trennen Sie die Aderhaut teilweise ab und schneiden Sie sie ein, um die Entfernung zu erleichtern. Die Aderhautschicht kann mit einer Schere geschnitten werden, wobei Schäden an der Retina vermieden werden sollten. Legen Sie die entfernte Aderhautschicht in die RNA later-Lösung und bewahren Sie sie 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf.

Entfernen Sie das gesamte zusätzliche Choroidea, um das Retinagewebe freizulegen. Sobald die gesamte Choroideaschicht entfernt ist, wird eine transparente Netzhautschicht sichtbar sein. Deutlich ist, dass die Choroideaschicht eine innere Bruch-Membran aufweist, die ebenfalls entfernt werden könnte, jedoch ist es schwierig, diese mit bloßem Auge zu identifizieren.

Entsprechend zwei Pinzetten verwenden, um die Netzhautschicht zu entfernen. Es ist einfach, eine große Menge Netzhaut zu isolieren, wenn nahe am Sehnerv ausgeschnitten wird. Alle Schichten des Auges sind nun sichtbar.

Legen Sie die exzidierte Retina in die RNA later-Lösung und lagern Sie sie 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Isopropanol. Die mit Trypanblau gefärbten endothelialen Zellen können unter 100-facher Vergrößerung eines invertierten Mikroskops betrachtet werden.

Eine geeignete Hornhaut mit mehr als 200 Zellen pro Quadratmillimeter wird gewöhnlich für die spätere Verwendung konserviert. Die Bewertung ihrer Qualität von mittelmäßig bis ausgezeichnet ist hilfreich für vergleichende Studien. Sobald die Hornhaut in der Regel für die Transplantation vorbereitet ist, werden Dicke und Transparenz erfasst, und eine geeignete Hornhaut wird für eine penetrierende Keratoplastik verwendet, bei der die gesamte Hornhaut transplantiert wird.

Die Zellsterblichkeit wird durch Beobachtung angefärbter blauer Zellen überprüft und in Prozent der abgestorbenen Zellen bewertet. Eine Gesamtzellsterblichkeit von mehr als 2 % gilt während der Konservierung als ungeeignet. Wenn die Zelldichte unter 2200 Zellen pro Quadratmillimeter liegt oder eine Schädigung aufgrund der Sterblichkeit vorliegt, könnte die Hornhaut für eine vordere laminare Keratoplastie verwendet werden.

Wenn die vordere Trauma beschädigt ist und die Hornhaut eine gute endotheliale Zelldichte aufweist, könnte die Hornhaut für eine hintere laminare Keratoplastik verwendet werden. Die Dicke der Hornhaut nimmt während der Organkultur normalerweise zu. Das Transportmedium hilft dabei, ihre normale Form und Struktur wiederherzustellen.

Außerdem unterstützt die Organkultur die Reepithelialisierung der Hornhaut und ermöglicht aufgrund ihrer langen Lagerfähigkeit eine geeignete Spenderauswahl. Mikrobiologische und serologische Untersuchungen können durchgeführt werden. Sie bietet ausreichend Zeit, um einen Eingriff zu planen, und hilft dabei, die endotheliale Zelldichte und -morphologie zu überprüfen, wenn dies aufgrund einer hohen postmortalen Zeit nicht möglich ist.

Daher können die Hornhäute, sofern das beschriebene Verfahren befolgt wird, ohne jegliche Schädigung anderer Gewebe ausgeschnitten werden. Falls die Hornhaut nicht für eine Transplantation geeignet ist, kann sie zu Forschungszwecken verwendet werden, um neue Kulturmedien und Konservierungsbedingungen zu entwickeln, um Augenoberflächenkrankheiten zu untersuchen, limbahale Stammzellen zu isolieren und die Wirkung von Arzneimitteln auf die Hornhaut zu erforschen. Bei der Netzhaut können wir eine Kreuzkontamination der RNA-Proben mit Zent-Geweben vermeiden und die RNA-Integrität bewahren, was von grundlegender Bedeutung ist.

Diese für Forschungszwecke unverzichtbaren Gewebe dienen der Charakterisierung des Transkriptoms der okularen Gewebe, der Isolierung von Stammzellen für Projekte der regenerativen Medizin sowie der Bewertung histologischer Unterschiede zwischen Geweben von gesunden oder betroffenen Probanden. Sobald das Netzhautgewebe entfernt wurde, kann es für verschiedene Zwecke verwendet werden, weshalb die nachfolgenden Schritte und Bedingungen für die Konservierung entsprechend variieren können. Beispielsweise kann das Netzhautgewebe in Röhrchen mit RNA-Stabilisierungsreagenzien wie R Nator oder Thisis-Puffer zur RNA- oder DNA-Extraktion, oder mit Dispase beziehungsweise Trypsin zur Zellisolierung aufbewahrt werden.

Fixierungslösungen, bevor Gewebe für die Immunhistochemie in Paraffin oder OCT eingebettet werden. Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihrer Forschung.