GC-basierte Erkennung von Aldononitrile Acetat Derivatisierte Glucosamin und Muraminsäure für Mikrobielle Rückstandsbestimmung im Boden

Das übergeordnete Ziel dieses Videos besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der GC-basierten Analyse der Aldonitrilacetat-Derivate von Glucosamin und Mucinsäure bereitzustellen, die aus Böden extrahiert wurden. Der Prozess beginnt mit der Säureverdauung, bei der organische Polymere abgebaut und Glucosamin sowie Mucinsäure freigesetzt werden. Anschließend werden die Monomere Aminozucker aus der Gemischtlösung isoliert und gereinigt.

Anschließend erfolgt die Derivatisierung, um jene Aminozucker in flüchtige Aldonitrilacetate umzuwandeln, die einer gaschromatographischen Analyse unterzogen werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Flüssig-Flüssig-Extraktion und die GC-Bestimmung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion eine Baselineseparation der Aldonitrilacetat-Aminozucker zeigen, die zwischen den myo- und Acetol- sowie Methylglutamin-Standards eluieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden liegt darin, dass sie Präzision, Empfindlichkeit, Einfachheit, eine gute chromatographische Trennung und Stabilität bei der Probenlagerung optimal miteinander verbindet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des globalen Kohlenstoffkreislaufs zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag SSE-Mikroorganismen zu stabilen Bodenkohlenstoffpools leisten. Obwohl diese Methode Einblicke in die Anreicherung mikrobiellen Detritus in Böden ermöglicht, kann sie auch in anderen Matrizes angewendet werden, wie beispielsweise in marinen Systemen, biologischen Geweben und sogar in extraterrestrischen Proben.

Um mit diesem Protokoll zu beginnen, gefriertrocknen Sie die Bodenproben nach der Probennahme im Feld, mahlen und homogenisieren Sie die Bodenproben mithilfe einer Kugelmühle oder eines Mörser und Stößels. Wiegen Sie die gemahlenen Bodenproben in 25-Milliliter-Hydrolysekolben ab. Geben Sie 10 Milliliter sechsmolare Salzsäure in jeden Hydrolysekolben und füllen Sie ihn vor dem festem Verschließen mit Stickstoffgas.

Hydrolysieren Sie acht Stunden lang bei 105 Grad Celsius in einem Inkubator. Entfernen Sie die Kolben mithilfe eines automatischen Zeitschalters aus dem Inkubator und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab.

Fügen Sie 100 Mikroliter interner Standard myo-Acetol zu jedem Kolben hinzu. Mischen Sie durch Schwenken; richten Sie Plastiktrichter ein, die in 200-Milliliter-Flaschenkolben mit birnenförmigem Querschnitt abfließen. Verwenden Sie Standardkegel mit 24/40-Schliffverbindungen, die zur Stabilisierung auf Plastikbechern stehen.

Falten Sie Watman-Filterpapier Nummer zwei in Viertel und legen Sie sie in die Trichter. Schwenken Sie jeden Hydrolysekolben und gießen Sie die Suspension in den Trichter. Um jede Probe zu filtrieren, trocknen Sie das Filtrat unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei etwa 45 Grad Celsius unter Anwendung von Vakuumreduktion.

Suspendieren Sie den getrockneten Rückstand aus jedem Paar-Fläschchen mit drei bis fünf Milliliter Wasser und geben Sie die Suspension in eine 40-Milliliter-Teflon-Röhrchen. Spülen Sie jedes Fläschchen mit einem weiteren Anteil Wasser nach. Stellen Sie den pH-Wert der Proben mit einer einmolaren Kaliumhydroxidlösung auf 6,6 bis 6,8 ein, um Metallionen und andere organische Moleküle auszufällen. Entfernen Sie anschließend die ausgefallenen Niederschläge durch Zentrifugation bei 2000 × g für 10 Minuten.

Geben Sie die Überstände in 40-Milliliter-Glasröhrchen und bedecken Sie die Öffnungen der Röhrchen mit Parafilm. Gefrieren Sie die Überstände und stechen Sie anschließend Löcher in den Parafilm. Trocknen Sie die gefrorenen Überstände im Gefriertrockner, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Sobald die Überstände getrocknet sind, lösen Sie den Rückstand mit drei Milliliter trockenem Methanol auf.

Gründlich verwirbeln, die Röhrchen verschließen und dann 10 Minuten bei 2000 × g zentrifugieren. Um Salze auszufällen, die Überstände in kegelförmige Reaktionsgefäße mit drei Milliliter Volumen überführen und unter Verwendung einer schnellen VA-Maschine bei 45 °C oder unter einem sanften Strom trockenen Stickstoffgases bis zur Trockene einengen. Nach dem Eindampfen jeweils 100 µL Wiederfindungsstandard und Methylglutamin sowie ein Milliliter Wasser zu jedem Gefäß hinzufügen.

Dann frieren Sie die Proben ein, bevor Sie mit der Derivatisierung beginnen. Bereiten Sie die Standards gemäß der schriftlichen Anleitung vor und lyophilisieren Sie anschließend sowohl die Proben als auch die Standards. Bereiten Sie das Derivatisierungsreagenz mit 32 Milligramm pro Milliliter Hydroxylaminhydrochlorid und 40 Milligramm pro Milliliter vor.

Vier Dimethylaminopurin in Purinmethanol. Geben Sie 300 Mikroliter des Derivatisierungreagenz zu jedem der reaktiven Gefäße hinzu, verschließen Sie diese fest und wirbeln Sie gründlich. Stellen Sie die verschlossenen Gefäße 35 Minuten lang in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 75 bis 80 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Vials aus dem Wasserbad und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab. Geben Sie dann je ein Milliliter Essigsäureanhydrid zu jedem der drei Milliliter-Reaktionsvials hinzu, verschließen Sie diese fest und wirbeln Sie gründlich. Anschließend erfolgt eine zweite Inkubation in einem Wasserbad bei 75 bis 80 Grad Celsius für 25 Minuten.

Entfernen Sie die Vials aus dem Wasserbad und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab. Geben Sie zur Durchführung der Trennung und Messung 1,5 Milliliter Dichlormethan zu jedem Röhrchen hinzu und vortexen Sie anschließend. Nach Zugabe von einem Milliliter einer einmolarigen Salzsäure zu jedem Vial und gründlichem Vortexen lassen Sie die Lösungen ungestört stehen, bis sich die beiden Phasen getrennt haben.

Aspirieren und verwerfen Sie die obere wässrige Phase. Extrahieren Sie die organische Phase dreimal auf die gleiche Weise mit einem 1000-Mikroliter-Pipettiergerät, wobei im letzten Waschschritt ein Milliliter Wasser verwendet wird. Achten Sie besonders darauf, dass die gesamte obere wässrige Phase vollständig entfernt wurde.

Trocknen Sie die endgültige Lösung mittels eines schnellen VAP bei 45 Grad Celsius oder mit einem Strom aus Stickstoffgas, lösen Sie jede Probe in 300 Mikrolitern Ethylacetat-Hexan auf und überführen Sie sie in zwei-Milliliter-bernsteingefärbte Schraubkolben mit einem kleinen Volumeneinsatz und verschließen Sie diese fest zur Quantifizierung, die mittels Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektor unter Verwendung einer geschmolzenen Kieselgarn-Normalkapillarsäule wie DB fünf gemäß der schriftlichen Anleitung durchgeführt wird. Passen Sie nach Standardlauf und Analyse die Durchflussgeschwindigkeit des Trägergases so an, dass die Acetol-Glucosamin- und Muaminsäurederivate bei 250 Grad Celsius eluieren und das endständige Methylglutamin bei 270 Grad Celsius eluiert.

Führen Sie eine einmikroliterige 30-zu-1-Teilinjektion durch, wobei der GC-Einlass auf 250 Grad Celsius eingestellt ist, unter Verwendung eines Autosamplers nach dem Gaschromatographielauf. Und als letzter Schritt dieses Verfahrens erfolgt die Validierung der Derivate mithilfe der in der schriftlichen Anleitung beschriebenen Chromatographie- und Spektrometriemethoden. Beispiele der Analyse von Glucosamin und urämischer Säure aus Standardlösungen und einer Bodenprobe werden hier gezeigt; neben Glucosamin und mukischer Säure können auch zwei Isomere, Glucosaminosain und Galactosamin, gleichzeitig bestimmt werden, und zwar basierend auf der genauen Menge der eingesetzten Standards und den Antwortfaktoren der jeweils zwei internen Standards.

Die Menge dieser Biomarker in den Bodenproben kann bestimmt werden. Der Wiederfindungsstandard wurde ebenfalls zur qualitativen Überwachung des Derivatisierungsprozesses verwendet. Die Schema für die Bildung von Aldonitrilacetat, derivatisiertem Glucosamin und Weinsäure sind hier dargestellt.

Nummer eins steht für die Nitrilreaktion und Nummer zwei für die Acetylierung. Die vorgeschlagenen Strukturen der bei der Elektronenionisation gebildeten Ionenfragmente wurden durch Vergleich der Ionspektren der mit verschiedenen Isotopenmarkierungen hergestellten Proben untersucht. Hier wird die Massenverschiebung des dominierenden Ions des Aldonitril-Acetat-Derivats Glucosamin in verschiedenen Szenarien dargestellt.

In diesem Beispiel wurde es mit nicht markierten Reagenzien sowie mit isotopisch markiertem Essigsäureanhydrid und isotopisch markiertem Glucosamin hergestellt. Der Stern in der chemischen Struktur steht für das schwere Isotopatom oder die Isotopgruppe. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, streng wasserfreie Bedingungen während der Derivatisierung aufrechtzuerhalten.

Sowohl die organischen Lösungsmittel als auch das Glaswerk müssen in diesem Schritt trocken sein. Während viele Anbieter wasserfreie Lösungsmittel verkaufen, können vorrätige Lösungsmittel getrocknet werden, indem sie durch Säulen geleitet werden, die Trockenmitteln wie Magnesiumsulfat enthalten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Verhältnis-Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Makroorganismen reagieren, Kohlenstoff oder Stickstoff in Böden umgesetzt und angereichert werden, indem lebende und tote Makroorganismen nach ihrer Entwicklung unterschieden werden.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf den Gebieten der Makroökologie sowie der Bodenbiologie und -chemie, um den Beitrag von Makroorganismen zur Bodenorganik und Kohlenstoffspeicherung in natürlichen oder bewirtschafteten terrestrischen Systemen zu untersuchen.