Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, EAE konsistent und einfach in jeder Mauslinie zu induzieren, einschließlich solcher, die als resistent gegenüber der EAE-Induktion gelten. Dies wird erreicht, indem zunächst Spendermäuse mit myelinspezifischen Proteinen oder Peptidantigenen immunisiert werden, die in komplettem Freund-Adjuvans emulgiert sind. Zehn Tage später werden die Lymphknoten der Spendermäuse isoliert und die Lymphknotenzellen in vitro erneut stimuliert, indem sie vier bis fünf Tage lang mit demselben Antigen kultiviert werden.

Anschließend werden die Zellen adoptiv in naive Empfängermäuse übertragen. Empfängliche Mausstämme entwickeln innerhalb von acht bis 14 Tagen EAE, um EAE in einem resistenten Stamm auszulösen. 14 Tage nach der adoptiven Übertragung wurden die Empfängermäuse dann mit Antigen in CFA immunisiert.

Mithilfe dieser Methode kann EAE in resistenten Mausstämmen induziert werden. Der Hauptvorteil des adaptiven Transfer- und Challenge-Protokolls zur Induktion von EAE liegt darin, dass eine zuverlässige Erzeugung der Erkrankung ermöglicht wird. Selten beobachten wir eine klinische Erkrankung von weniger als 100 %.

Wir können das Protokoll an die Erzeugung der Krankheit und an empfängliche Mausstämme anpassen, aber noch wichtiger ist, dass wir mit diesem Protokoll EAE in vielen Mausstämmen induzieren können, die bisher als resistent gegenüber der Krankheit galten. Demonstration der Verfahren. Heute führt unsere leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin, Cha Ching.

Bereiten Sie zunächst eine Lösung von zwei Milligramm pro Milliliter MBP in PBS vor. Verwenden Sie eine Glas-Pistollen-Spritze mit Luer-Lock, um pro zu immunisierendem Maus 100 Mikroliter Antigenlösung aufzuziehen.

Mit einer separaten Spritze eine gleiche Menge kompletten Freundschen Adjuvans H 37 ra aufziehen. Anschließend mittels eines Dreiweghahns die beiden Spritzen miteinander verbinden und die Kolben hin und her bewegen, um das Antigen und das Adjuvans so lange zu mischen, bis eine Emulsion entsteht. Um dies zu überprüfen, die Lösung in eine der Spritzen überführen und die leere Spritze abtrennen.

Ziehen Sie den Kolben der leeren Spritzen leicht zurück und geben Sie einen Tropfen der restlichen Mischung in ein Becherglas mit sauberem Wasser bei Raumtemperatur ab. Wenn sich der Tropfen verteilt, verbinden Sie die Spritzen erneut und setzen Sie das Mischen fort. Wiederholen Sie den Test, falls der Tropfen intakt bleibt und eine Emulsion gebildet wurde, um die Emulsion zu sammeln.

Zum Immunisieren. Verbinden Sie eine plastische Ein-Milliliter-Spritze mit der Glas-Spritze, deren Kolben entfernt wurde. Überführen Sie die Lösung vorsichtig in die Plastikspritze und füllen Sie sie bis zum Rand.

Danach den Kunststoffkolben einsetzen und etwas Emulsion herausspritzen, sodass genau 1,2 Milliliter verbleiben. Es sollten keine Luftblasen in der Spritze eingeschlossen sein. Wenn dieses Verfahren korrekt durchgeführt wird.

Trennen Sie die Plastikspritze ab. Setzen Sie eine 26-Gauge-Nadel auf und füllen Sie das Totvolumen der Nadel, indem Sie den Kolben bis zur Markierung von einem Milliliter vorschieben. Greifen Sie das Mausfell im Nacken fest an und halten Sie den Schwanz zwischen Ringfinger und kleinem Finger zurück, sodass Thorax und Abdomen leicht zugänglich sind. Subkutan.

Injizieren Sie 50 Mikroliter Emulsion in den Thorax direkt über der rechten Achselhöhle. Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, ist eine kleine weiße Schwellung an der Injektionsstelle sichtbar. Wiederholen Sie den Vorgang über der linken Achselhöhle, lassen Sie dann den Schwanz los und greifen Sie den rechten Fuß, um die rechte Flanke der Maus freizulegen.

Injizieren Sie 50 Mikroliter der Lösung direkt unterhalb des Rippenbogens. Lassen Sie die rechte Pfote los. Drehen Sie die Maus um und wiederholen Sie die Injektion auf der linken Seite.

Sieben bis 10 Tage nach der Immunisierung. Gewinnen Sie die Lymphknoten aus euthanasierten Tieren. Legen Sie die Maus zuerst auf den Rücken, strecken Sie die Gliedmaßen aus und befestigen Sie sie mit Nadeln am Präparationsbrett.

Besprühen Sie die Maus mit Ethanol. Anschließend mit sterilen Instrumenten einen Längsschnitt in der Haut der Maus vom Unterbauch bis zum Kinn durchführen.

Führen Sie einen weiteren Schnitt vom Bauch entlang eines Beins und anschließend entlang des anderen Beins durch. Lösen Sie die Haut vom Körper der Maus ab und heften Sie sie auf das Präparationsbrett.

Schneiden Sie außerdem die Haut entlang der vier Gliedmaßen ein. Heben Sie anschließend den oberen Teil der Hautlappen an und befestigen Sie ihn mit Nadeln auf beiden Seiten. Die inguinalen und axillären Lymphknoten, die normalerweise in der Nähe der Leiste oder der Achselhöhlen liegen, sollten als kleine, undurchsichtige Massen direkt unter der Haut sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig mit zwei feinen Pinzetten das Bindegewebe über dem ersten Lymphknoten.

Dabei darauf achten, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Sobald das Bindegewebe entfernt ist, eine Pinzette unter den Lymphknoten legen und diesen vom Körper abziehen. Den Lymphknoten in eine 35-Millimeter-Petri-Schale mit steriler PBS überführen und die anderen drei Lymphknoten auf die gleiche Weise gewinnen.

Nachdem alle Lymphknoten gewonnen wurden, überführen Sie die Petrischale in eine Sicherheitswerkbank. Zerreiben Sie die Lymphknoten mit dem Kolben eines sterilen Spritzenzylinders, um die Zellen freizusetzen. Um die Rückstände zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension durch ein Nylon-Netz in ein kegelförmiges Reagenzglas.

Anschließend das Volumen mit steriler PBS auf 50 Milliliter einstellen und die Zellen 10 Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Zellen in einem kleinen Volumen vorgewärmten Zellkulturmedium resuspendieren und die lebensfähigen Zellen zählen. Die Konzentration auf viermal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter einstellen.

Anschießend die Zellen in einer 24-Loch-Platte mit je zwei Milliliter pro Loch ansäen. MVP-Antigen zu jedem Loch hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Sobald das Antigen hinzugefügt wurde.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius. Nach der erneuten Stimulierung der Zellen werden diese durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren geerntet und in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 1000 U/min und resuspendieren Sie das Pellet in einem kleinen Volumen steriler PBS.

Anschließend die Zellen zählen und die lebensfähige Zellkonzentration mit PBS auf 2,5 × 10⁸ Zellen pro Milliliter einstellen. Die Zellen in eine Spritze aufziehen und mit einer 26-Gauge-Nadel bestücken, um die adoptive Übertragung durchzuführen. Jeweils 0,2 Milliliter Zellen intravenös in den Schwanz jedes Mäuses injizieren, um resistente Mäuse wochenlang nach der adoptiven Übertragung zu testen.

Spritzen Sie die Tiere mit 200 Mikrogramm Antigen in einem Volumen von 200 Mikrolitern Emulsion, genauso wie die Immunisierung der Spendermäuse durchgeführt wurde. Sieben bis 10 Tage nach der Herausforderung entwickelt sich eine paralytische Erkrankung, deren Fortschreiten überwacht werden kann. Die Erkrankung beginnt mit einer Schwäche im Schwanz.

Wenn der Schwanz schlaff ist, wird die Erkrankung mit Grad eins bewertet. Zwei, wenn die Maus eine Lähmung eines Hinterbeins entwickelt, und drei, wenn beide Hinterbeine gelähmt sind. Grad vier liegt vor, wenn beide Vorderbeine gelähmt sind.

Grad fünf: Die Maus ist zahlreicher vorhanden. Und Grad sechs: Die Maus ist tot. Wie hier gezeigt, entwickeln die Mäuse sieben bis 14 Tage nach der Herausforderung eine monophasische paralytische Erkrankung, die anhand der klassischen EAE-Kriterien eingestuft werden kann.

Während die Mäuse sich möglicherweise erholen, treten keine spontanen Rückfälle auf. Die Induktion der Erkrankung erfordert eine antigenspezifische Herausforderung. Eine Herausforderung mit CFA allein oder mit einem irrelevante Antigen führt nicht zur Erkrankung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der adoptiven Übertragung und der Herausforderungsmethode zur Induktion von EAE haben. Durch die Kombination der adaptiven Übertragung antigenspezifischer Lymphknotenzellen mit einer boosterartigen antigenen Herausforderung kann man einfach EAE in jeder Mauslinie induzieren. Diese Methode ermöglicht es uns, die in einigen Mauslinien inhärenten Resistenzmechanismen zu überwinden und somit die Krankheitsresistenz zu untersuchen. Auch.

Diese Technik sollte leicht anpassbar sein, um jeden autoimmunen Krankheitsprozess zu untersuchen.