Name: Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Explantatkultur von Haut-Stanzbiopsien zur Ableitung primärer humaner Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung von 15-20 Millionen Zellen mit niedriger Passagenummer innerhalb von 4-8 Wochen.

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Die Entwicklung dieses Protokoll wurde von der California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) und Parkinson Allianz finanziert.

Die Haut Stanzbiopsie unter Verwendung Standardverfahren 3 (zB mit 4mm lang Visipunch Instrument erhalten) sollten in komplettem DMEM 20% FBS Medien auf Eis gehalten werden. Nachdem die Probe im Labor angekommen, verarbeiten die Biopsie so schnell wie möglich. 1. Vorbereitung der Haut Stanzbiopsie STEPS 1,1-1,3 SIND IN EINEM Biosicherheitswerkbank DURCHZUFÜHRENDEN <ol><li> Bereiten Sie im Voraus: In 1 ml 0,1% Gelatine in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Stellen Sie den Teller beiseite für 30-60 min. Saugen Sie die Gelatine-Lösung und fügen Sie 800 ul komplette DMEM/20% FBS Medien in jede Vertiefung. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche des Bohrlochs mit Medien abgedeckt wird. </li><li> Kehren Sie die Deckel eines sterilen 10 cm Gewebekulturschale und fügen Sie 1,5 ml DMEM / 20% FBS Medien auf die Mitte des Deckels und breitete die Medien Tropfen mit der Spitze des serologischen Pipette. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette Platz ter Hautbiopsie Stück in den Medien auf dem Teller. </li></ol> 2. Dissektion der Haut Stanzbiopsie STEPS 9 2.1-2.2 SIND IN EINEM HORIZONTAL Laminarströmungshaube DURCHZUFÜHRENDEN <ol><li> Setzen Sie den unteren Teil 10 cm Schale auf umgekehrten Deckel, und übertragen Sie die Haut an den Binokular im Laminarströmungshaube Biopsie. </li><li> Präparieren Sie ein 4-mm rund Hautbiopsie in 12-15 gleich große Stücke mit scharfen Kanten durch Schneiden Stücke in gleiche Hälften mit einem Skalpell, um die Biopsie in Position zu halten und die zweite Skalpell mit einer rollenden Bewegung in eine Richtung geschnitten. Stücke mit ausgefranste Kanten tragen zur schlechten Befestigung / Zelle Auswuchs. </li></ol> 3. Übertragung von Dissected Hautbiopsie Pieces in Zellkulturplatten STEPS 3.1-3.6 SIND IN EINEM Biosicherheitswerkbank DURCHZUFÜHRENDEN <ol><li> Platzieren des Bodenabschnitts des 10 cm Zellkulturschalenauf der Oberseite der umgedrehten Deckel und Schüssel Transfer zurück in die Biosicherheitswerkbank. </li><li> Mit einem spitzen Pinzette, Platz 2-3 Biopsie Stücke in jede Vertiefung der vorbereiteten 6-Well-Platte mit 800 ul und nicht auf trockenen Brunnen. Verwenden Sie tippen oder gleitende Bewegung um die Stücke auf den Grund des Brunnens zu befestigen. Ein Skalpell ist nützlich, um keine Biopsie Stücke aus der Zange entfernen. </li><li> Legen Sie die 6-Well-Platte in der 37 ° C-Inkubator. Überwachen Sie täglich, um sicherzustellen, es ist ein Film von Medien Beschichtung der Boden der gut für die erste Woche, fügen ~ 200 ul alle 2 Tage, um alle verdampft Medien zu ersetzen. </li><li> Nach einer Woche erhöhen Anzahl der Medien bis 2 ml komplettem DMEM/20% FBS und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Sobald Fibroblasten sind in jeder Vertiefung konfluenten bis zu dem Punkt, wo die Fibroblasten Erreichen der Kanten der Bohrung, trypsinize und Kanal 6-Well-Platte in 2X T75-Flaschen (Kanal 1). Die Gewebestücke werden mit übertragen werden. Sie werden nicht an und gewaschen werden out bei der nächsten Änderung Medien. </li><li> Sobald Fibroblasten konfluent sind, übertragen Sie sie auf 3X T175-Flaschen (Durchgang 2), frieren in komplettem DMEM Medium plus 10% DMSO bei 1x10 6 Zellen / ml pro Fläschchen. </li></ol> 4. Charakterisierung der Fibroblasten durch Immunfärbung <ol><li> Kultur Fibroblasten in 8 gut Kammerobjektträgers mit Gelatine beschichtet. </li><li> Wenn die Zellen bei 80% Konfluenz sind, Saugen Sie das Medium aus jedem Well. </li><li> Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd für zehn Minuten bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 150 ul 0,3% Triton X-100 (in PBS) für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS. </li><li> Jeweils 200 ul Blockierungslösung (PBS + 5% normalem Ziegenserum (Vector, S-1000)) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:250 Anti-Rilit-1 (Anti-Kaninchen, mAB, Sigma, S5950-200 ul) in Blocking-Lösung. </li><li> Aspirate Blocking-Lösung, und fügen Sie 150 ul der 1:250 Verdünnung AntiSERPINH-1. Inkubation bei 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS. </li><li> Bereiten Sie eine 1:200 Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper (Alexa Fluor Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H + L), Invitrogen, A11008) in Blocking-Lösung. </li><li> In 150 ul 1:200 Ziege-Anti-Kaninchen monoklonaler Antikörper in jede Vertiefung. Inkubation für 1 h in der Dunkelheit bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Vertiefungen einmal mit 1xPBS. </li><li> Saugen Sie die PBS, und heben Sie die Kammern aus, um nur die Folie zu offenbaren. </li><li> Befestigen Sie die Folie mit einem 2-3 Tropfen Eindeckmedium enthält DAPI (Vector, H-1200). </li><li> Analysieren der Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit diesem Protokoll kann relativ reine Kulturen von Fibroblasten gewonnen werden. Die Fibroblasten weisen charakteristische morphologische Merkmale von langgestreckten, spindelförmigen Zellkörper, runde bis ovale Zellkerne und die Fibroblasten wachsen ausgerichtet und in Bündeln, wenn konfluent. Das Medium unterstützt das Wachstum von Fibroblasten während andere Zellpopulationen zB Keratinozyten benötigen Zusatzgebühren und Wachstumsfaktoren oder sind mitotisch weniger aktiv, ermöglicht dies eine relativ reine...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm große Petrischale für Zellkultur</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6-Loch-Zellkulturplatte </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Klingenskalpelle aus Edelstahl (2 Stück), Klinge Nr. 15, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>Sterile spitzen Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL-Konischgefäße</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2-mL-Serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_inhalt&quot;&gt;&lt;stark&gt;Tabelle A. Tabelle spezifischer Reagenzien und Geräte.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM: hoher Glucosespiegel</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20 % fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-Glutamin</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM nicht essentielle Aminosäuren </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_Schritt&quot;&gt;&lt;stark&gt;Tabelle B. Reagenzien.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

haut stanzbiopsie explantatkultur für die ableitung des primären humanen fibroblasten

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Geweben und Zelllinien von einem Individuum mit der Krankheit abgeleitet sind eine ideale Quelle zu krankheitsbedingten zellulären Phänotypen zu studieren. Patienten stammenden Fibroblasten in diesem Protokoll wurden erfolgreich in der Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu modellieren Krankheit 1 verwendet. Frühen Passagen dieser Fibroblasten können auch zellbasierten funktionellen Assays verwendet werden, um spezifische Krankheitsbahnen Mechanismen 2 und nachfolgende Wirkstoff-Screening-Ansätzen zu studieren. Der Vorteil der vorgestellten Protokoll über enzymatische Verfahren sind 1) die Reproduzierbarkeit der Technik von kleinen Mengen von Gewebe von älteren Patienten, zB Patienten mit Parkinson-Krankheit, 2 betroffen) der technisch einfachen Ansatz über schwierigere Methoden mittels enzymatischer Behandlungen abgeleitet und 3 ) die Zeit berücksichtigt: Dieses Protokoll dauert 15-20 min und kann sofort nach der Ankunft Biopsie durchgeführt werden. Enzymatische Behandlungen kann bis zu 4 Stunden und haben die Probleme deroverdigestion, Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen und die anschließende Befestigung der Zellen, wenn sie nicht richtig gehandhabt. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung einer 4-mm menschlichen Hautbiopsie zur Ableitung eines Fibroblasten-Kultur und hat eine sehr hohe Erfolgsquote, die wichtig ist, wenn man mit einem Patienten abgeleitete Gewebeproben. In dieser Kultur, Migration Keratinozyten aus der Biopsie Gewebe innerhalb der ersten Woche nach der Zubereitung. Fibroblasten erscheinen 7-10 Tage nach der ersten Folge von Keratinozyten. DMEM high glucose Medium mit 20% FBS begünstigt das Wachstum von Fibroblasten in Keratinozyten und Fibroblasten werden die Keratinozyten überwuchern. Nach 2 Passagen Keratinozyten wurden durchgeführt, was zu relativ homogenen Fibroblastenkulturen die die Fibroblasten-Marker SERPINH1 (HSP-47) drückt verdünnt. Mit diesem Ansatz können 15-20 Millionen Fibroblasten in 4-8 Wochen für die Zell-Banking abgeleitet werden. Die Haut Präparation dauert etwa 15-20 min werden die Zellen dann überwacht einmal täglichunter dem Mikroskop und Medien alle 2-3 Tage nach der Befestigung und Auswachsen der Zellen verändert.

Keratinozyten wachsen aus der Biopsie Stücke, sobald 48 Stunden nach der Sektion. Erste Fibroblasten Auswuchs kann etwa eine Woche nach der Verarbeitung zu beachten. Sobald die Brunnen Konfluenz erreicht haben, sind Fibroblasten für zwei weitere Passagen passagiert zu drei 150 cm Kolben (T150) zu erreichen und die Zellen werden kryokonserviert. Wir erzeugen mit dieser Methode 15-20 Millionen Zellen. Die Fibroblasten sind für anti-SERPINH1 (auch als HSP-47 bekannt) (Abbildung 1), die ein Kollagen-spezifi...

Die Fibroblasten Explantatkultur Protokoll aus der menschlichen Haut Stanzbiopsien ist eine technisch robuste und einfache Weise abzuleiten Hautzellen innerhalb von 4-8 Wochen für Banken von etwa 15-20 Millionen Zellen auf einem niedrigen Durchgang Nummer.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Gewebe und Zelllinien, die von einer erkrankten Person stammen, sind ideale Quellen zur Untersuchung krankheitsbedingter zellulärer Phänotypen. Von Patienten stammende Fibroblasten ...

Hallo. Willkommen zum Video-Tutorial zur Hautbiopsie-Aufbereitung. Beginnen Sie damit, dass Sie die benötigten Materialien in die Zellkulturwerkbank stellen. Alle Gegenstände, die die Werkbank betreten, müssen mit 70 %igem Ethanol besprüht und abgewischt werden. Beschriften Sie eine Platte mit der PI-Nummer, dem Datum, den Initialen und der Art des Kulturmediums. Geben Sie ein Milliliter von 0,1 % Gelatin in jede Wand, schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass der Boden mit Gelatin beschichtet ist.Lassen Sie die Platte vor der Verwendung eine Stunde lang stehen. Der erste Schritt besteht darin, die Biopsie aus dem Röhrchen in die Schneidenschale zu überführen. Eine Schneideschale ist ein Deckel einer 10 cm Petrischale, auf der die Biopsie präpariert wird.Geben Sie 1,5 Milliliter DMEM mit 20 % FBS in die Mitte der Schneideschale. Verteilen Sie das Medium von der Mitte ausgehend. Hier sehen Sie die Hautbiopsie.Der nächste Schritt besteht darin, die Biopsie aus dem Röhrchen in die Mitte der Schneideplatte zu überführen. Mit sterilen Pinzetten die Hautbiopsie in der Mitte platzieren. Dabei vorsichtig vorgehen, da es unbedingt erforderlich ist, die Sterilität aufrechtzuerhalten

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Fibroblasten von Patienten mit Mutationen in der Parkinson-Krankheit verursachenden Gene stellen ein leicht...

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Dieses Manuskript beschreibt ein zweistufiges Protokoll zur Erzeugung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten durch episomale Reprogrammierung in human-induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) und anschließende Differenzierung in Podozyten.

Generierung von patienteneigenen Podozyten aus Hautbiopsien

Erfahren Sie die Explantatkultur von Haut-Stanzbiopsien zur Ableitung primärer humaner Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung von 15-20 Millionen Zellen mit niedriger Passagenummer innerhalb von 4-8 Wochen.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

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