Ausdauertraining Protokoll und Längs-Performance-Assays für Drosophila melanogaster

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Dsof und Melanogaster mithilfe eines neuartigen Ausdauertrainingsprogramms zu trainieren und die Auswirkungen des Trainings zu untersuchen. Dies wird durch ein automatisiertes Gerät erreicht, das mehrere Fläschchen mit Fliegen wiederholt anhebt und fallen lässt, wodurch die instinktive Kletterreaktion der Fliegen aktiviert und ihnen so eine Trainingseinheit ermöglicht wird. Die Fliegen werden täglich nach einem gesteigerten Zeitplan über einen Zeitraum von drei Wochen hinweg zwei bis drei Stunden lang trainiert.

Anschließend werden die Fliegen verschiedenen Verhaltensanalysen unterzogen, um die Auswirkungen von Bewegung zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass trainierte Fliegen schneller klettern, gemessen mittels des rasch induzierten negativen Geotaxis- oder Ringassays. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ausdauertraining bei anderen Tieren ist die umfangreiche Sammlung an Werkzeugen, die für die gezielte Manipulation der Genetik von Drosophila zur Verfügung steht.

Bei der Untersuchung von Ausdauertraining hatten wir erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir zahlreiche einzelne Negativ-Geotaxis-Assays durchführten. Wir fragten uns, wie lange Fliegen weiterklettern könnten und ob man sie auf diese Weise ausdauertrainieren könnte. Der Power Tower wird auf einem rechteckigen Sperrholzstück errichtet, das an einem Tisch festgeklemmt ist.

Ein 4,5-Umdrehungen pro Minute. Der Getriebemotor ruht auf mehreren Platten und ist an eine Drehzahlregelung, eine Sicherung und einen Netzschalter angeschlossen. In einer Übergangsdose wird ein drei Zoll großer Lüfter, der in einem Metallrohr befestigt ist, zur Kühlung auf den Motor gerichtet.

Am Motor angeschlossen ist ein rotierender Arm mit einer Rolle. Am Ende drehen sich Motor und Arm und drücken eine Seite eines gebogenen Stabes nach unten, der mit der Sperrholzplatte verbunden ist. Auf der anderen Seite des Stabes ist ein Türscharnier angebracht, an dem ein Rad befestigt ist, sodass es sich an einer Plattform abrollen kann.

Während sich der Motor dreht, bewegt es sich auf und ab; die Leistung des Motors wird so eingestellt, dass eine vollständige Rotationsperiode 15 Sekunden dauert. Auf der Plattform sind Fläschchenhalterungen für Fliegenröhren mit Gummischnüren befestigt, und die in diese Halterungen eingesetzten Röhrchen werden mit einem Schirm gesichert, der ebenfalls an der Plattform befestigt ist. Mithilfe der Gummischnüre kann sich die Plattform entlang herkömmlicher Führungsschienen vertikal bewegen, und ein Polystyrolkissen dämpft den Aufprall beim Herunterfallen. Der Antriebsturm wird in einem temperaturgeregelten Raum betrieben, um die Zuchtbedingungen der Tiere nachzubilden.

Für ein Trainingsexperiment werden mindestens 240 altersgerechte männliche Fliegen für die longitudinale Überwachung der Ausdauer und der negativen Geotaxis oder Kletterfähigkeit benötigt. Halten Sie die Fliegen in Populationen von jeweils 20 pro Röhrchen. Teilen Sie die Röhrchen in zwei gleich große Gruppen auf, von denen die eine trainiert wird; die Röhrchen dieser Gruppe sollten mit Flugs verschlossen werden, während die Kontrollgruppe mit Schwammpfropfen verschlossen werden sollte.

Ein Schwamm wird zur Immobilisierung verwendet, da seine anpassungsfähige Größe eine einfache Platzierung nahe dem Boden des Gefäßes ermöglicht. Das weichere Schwammmaterial verringert außerdem Verletzungen, die durch die festeren Flugs entstehen können. Die Futtergefäße sollten vor dem Testen jeden zweiten Tag ausgetauscht werden.

Während des Trainings verbleiben die Fliegen in den Futtergefäßen, da bei Verwendung leerer Gefäße deutlich mehr Fliegen verletzt werden. Verletzungen im Zusammenhang mit dem Training. Beim Bestücken der Gefäße mit Kontrollfliegen auf dem Powerturm sollte der Schwammpfropfen etwa drei Millimeter über dem Niveau des Futters nach unten gedrückt werden, wodurch die Fliegen begrenzt werden.

Bewegung für konsistente Ergebnisse. Testen Sie beide Fliegengruppen fünf aufeinanderfolgende Tage pro Woche, wobei ein gestaffelter Zeitplan verwendet wird, der die Dauer pro Sitzung über einen Zeitraum von drei Wochen von zwei auf drei Stunden pro Tag erhöht. Natürlich kann jedes beliebige Regime angewendet werden.

Konsistenz in der Behandlung, Tageszeit und den Testmethoden über einen Zeitraum von drei Wochen ist entscheidend. Sorgfältige Planung und Übungsabläufe verringern die Fehler- und Ermüdungsgefahr. Die Tests können längs eines Zeitverlaufs an Fliegen vor, nach oder während des Trainingsprotokolls durchgeführt werden.

Es kann auch verwendet werden, um eine sicherere Reaktion auf eine Umweltvariable zu gewährleisten. Führen Sie den Ermüdungstest an einem Tag durch, an dem kein Training stattfindet. Laden Sie zu Beginn eines Tages beide Fliegen-Gruppen auf den Power Tower.

Aktivieren Sie das Gerät und beobachten Sie jedes Gefäß alle 10 Minuten einmal. Wenn bei vier aufeinanderfolgenden Tropfen fünf oder weniger Fliegen in einem Gefäß höher als zwei Zoll klettern, gilt diese Kohorte von Fliegen als ermüdet. Entfernen Sie die ermüdeten Fliegen vom Power Tower, während er noch in Betrieb ist, und notieren Sie den Zeitpunkt der Entfernung.

Beobachten Sie alle Vials bis zu 10 Stunden lang und erfassen Sie die Ergebnisse. Ein Assay zur Quantifizierung. Die Auswirkungen des Trainings werden durch eine tägliche Messung der Laufgeschwindigkeit erfasst, die während des gesamten Trainingsprotokolls und darüber hinaus durchgeführt werden kann.

Um die Langzeitwirkung des Trainings zu messen. Um die Klettergeschwindigkeit oder den Ringtest zu beginnen, überführen Sie die Fliegen zunächst in neue leere Röhrchen und stellen eine Reihe von sechs Röhrchen in einen Röhrchenhalter. Aufgerollte Klebestreifen dienen dazu, die Röhrchen am Halter zu befestigen.

Stellen Sie dann das Rack vor eine Lichtquelle, beispielsweise eine Röntgenbetrachterbox, die eine gleichmäßige Beleuchtung der Gefäße gewährleistet. Richten Sie nun eine Kamera ein, um das Rack zu fotografieren, sodass die Position jeder Fliege in jedem Gefäß sichtbar ist. Schlagen Sie anschließend die sechs Gefäße leicht an, um alle Fliegen auf den Boden der Gefäße zu befördern, und machen Sie eine zeitgesteuerte Aufnahme.

Zwei Sekunden, nachdem alle Fliegen betäubt sind. Falls der Blitz der Kamera verwendet wird, sollte dies konsequent durchgängig erfolgen. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal für jeden Satz von Vials, bevor Sie mit dem Power Tower fortfahren.

Um die Daten zu analysieren, bewerten Sie jedes Foto einzeln mithilfe einer Software, um die oberen und unteren Grenzen des Gefäßes zu ermitteln. Anschließend messen Sie die Kletterhöhe jeder Fliege. Danach kopieren Sie die Kletterhöhen in Excel.

Jeder Fliege in jedem Gefäß wird eine Punktzahl von null bis vier entsprechend der Höhe des Quadranten zugewiesen. Dabei entsprechen vier dem höchsten Quadranten und null dem völligen Ausbleiben des Kletterns. Für jedes Gefäß berechnen Sie die Punktzahl für jede der 20 Fliegen und ermitteln den durchschnittlichen Punktwert der Kohorte.

Dies wird als Kletterindex bezeichnet. Für die Datenanalyse wird der Durchschnitt der vier Kletterindizes jedes Kohortenmitglieds an diesem Tag verwendet. Falls keine Bildverarbeitungssoftware verfügbar ist, können Quadrantlinien auf die leeren Gefäße gezeichnet werden, und die Fliegen können manuell Quadrantenwerte zugewiesen bekommen, während Mutantenfliegen auf einen Ausdauer-Protokoll mit einer verminderten altersbedingten Abnahme der Kletterfähigkeit reagierten.

Dies blieb nach Beendigung des Trainings bestehen, wie aus Längsschnitt-Ring-Assays über einen Zeitraum von fünf Wochen Alter hervorgeht. Daher kann die durch das Power-Tower-Programm induzierte Bewegungsaktivität als verhaltensbezogener Input genutzt werden, und die Fähigkeit genetischer oder umweltbedingter Faktoren, diesen Effekt zu modulieren, kann bewertet werden. Umgekehrt kann der Power Tower auch als Output verwendet werden.

Beispielsweise wurde bei Fliegen, die eine Nahrung mit unterschiedlichem Saccharosegehalt erhielten, die Zeit bis zur Ermüdung gemessen. Ein höherer Saccharosegehalt korrelierte mit einer erhöhten Ausdauerleistungsfähigkeit. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass alle Fliegenkohorten altersgerecht übereinstimmen und dass die Methoden während des gesamten Experiments einheitlich durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Fliegen eines beliebigen Genotyps ausdauernd trainiert und bewertet werden können.