Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry
21. November 2012
Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, den umgekehrten Transport von Dopamin in einem Neuron zu messen, das mit Hilfe von gleichzeitiger Patch-Klemmung und Pyrometrie an die Spannung geklemmt wird, um die DAT-vermittelte D-Freisetzung zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Integrität der pyrometrischen Elektrode mit Dopamin getestet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die pyrometrische Elektrode in der Nähe der Zelle zu platzieren und mit einer Patch-Pipette ein ganzes Zellpflaster des Neurons zu erhalten.
Als nächstes wird die Spannung der Zelle mit der Patch-Pipette geregelt und das von der Zelle freigesetzte DAT-vermittelte Dopamin gleichzeitig mit einer pyrometrischen Elektrode aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, den DAT-Blocker hinzuzufügen und die gesamten Zell- und Pyrometrieströme erneut aufzuzeichnen, damit der durch den Dopamintransporter spezifisch vermittelte Strom abgezogen werden kann. Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Möglichkeit, den umgekehrten Transport von Dopamin über den Dopamintransporter zu messen und gleichzeitig die Spannung des dopaminergen Neurons zu steuern.
Das simultane Patch-Clamp- und Barometrie-Aufzeichnungssystem erfordert ein inverses Mikroskop mit hervorragender DIC-Optik und einer Linse mit großem Arbeitsabstand, um eine Gleichstromlichtquelle für das System zu erzeugen. Schließen Sie den Leuchtturm des Mikroskops bei geringem elektrischen Rauschen an eine Autobatterie an. Die hydraulischen Mikromanipulatoren werden verwendet, da sie in unserer Konfiguration nicht nennenswert zum Geräuschpegel beitragen.
Ein Rechtshänder-Manipulator wird für die Spannungsklemme, die Ganzzellenaufzeichnung und der Linkshänder-Manipulator für die Pyrometrie verwendet. Um die Elektrode für die Großhandelsaufzeichnung vorzubereiten, ziehen Sie eine Quarzpipette mit einem P 2000-Abzieher. Typischerweise verwenden wir eine Pipette mit einem Widerstand von drei bis vier Megaohm.
Füllen Sie anschließend die Elektrode mit der Pipettenlösung, die ein Millimolar Dopamin enthält. Montieren Sie es dann an der Pipettenhalterung am rechten Manipulator. Achten Sie darauf, den Behälter, in dem sich die Dopamin-haltige Pipettenlösung befindet, mit Alufolie einzuwickeln und auf Eis zu legen, wenn er nicht verwendet wird.
Da Dopamin oxidierbar ist, verringert sich die Oxidationsrate, wenn die Lösung auf Eis und vor Licht geschützt aufbewahrt wird. Fädeln Sie den Silberdraht in den Elektrodenhalter ein und schrauben Sie dann den am parametric Adapter auf den Elektrodenhalter. Füllen Sie als Nächstes die Trica-Elektrode mit genügend Quecksilber, um den Silberdraht zu kontaktieren.
Wenn die Elektrode am Adapter montiert ist, überprüfen Sie unbedingt die rauscharme Kohlefaser und die parametrische Elektrode pro CFE unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Spitze sauber und intakt ist. Achten Sie darauf, das hintere Ende der Kohlefaser festzuhalten, um die Spitze der Kohlefaser vor Beschädigungen zu schützen. Montieren Sie dann die pro CFE Tric Elektrode.
Montieren Sie anschließend die montierte Elektrode auf dem linken hydraulischen Manipulator, um die Unversehrtheit der Triq-Elektrode zu überprüfen. Senken Sie es in eine Petrischale mit Glasboden, in der sich die äußere Lösung befindet. Notieren Sie den Ausgangsstrom in Abwesenheit von Dopamin.
Geben Sie dann 10 Mikroliter einer einmillimolaren Dopaminlösung in das Gericht. Eine gute emper metrische Elektrode sollte einen Anstieg des oxidativen Stroms erfassen. Achten Sie darauf, die Unversehrtheit der empermetrischen Elektrode vor und nach den Experimenten zu überprüfen.
Bei diesem Verfahren werden die Dopamin-Neuronen oder -Zellen aus dem Inkubator entnommen, die so verändert wurden, dass sie den Dopamintransporter exprimieren, der in der Petrischale mit Glasboden platziert ist. Waschen Sie die Zellen oder Dopamin-Neuronen dreimal vorsichtig mit warmer externer Lösung. Um die Zellen zu visualisieren und das Experiment durchzuführen, montieren Sie die Petrischale mit Glasboden auf den Mikroskoptisch und finden Sie den richtigen Brennpunkt, um die Zellen klar zu visualisieren.
Üben Sie anschließend einen positiven Druck auf die Patch-Elektrode aus. Führen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze beide Elektroden vorsichtig in die Lösung ein und verschließen Sie die Zelle mit den Mikromanipulatoren. Positionieren Sie dann die emper metrische Elektrode auf der linken Seite der Zelle und die Patch-Elektrode auf der rechten Seite.
Wenn die Patch-Elektrode die Zelle berührt. Wenden Sie einen leichten Sog mit dem Mund oder der Spritze an, um eine Giga-Versiegelung auf der Zelle zu bilden. Danach brechen Sie die Versiegelung mit einem Sog, um eine Ganzzellkonfiguration zu erreichen, und lassen Sie fünf bis acht Minuten für die Dialyse der dopaminhaltigen internen Lösung in die Zelle warten.
Zeichnen Sie dann DAT-vermittelte Ströme auf, indem Sie die Zellmembranspannung zwischen minus 60 und plus 100 Millivolt von einem Haltepotential von minus 40 Millivolt durch die Pipette stufen. Um das spezifische DAT-vermittelte Dopamin flx zu bestimmen, zeichnen Sie die empermetrischen Ströme in Abwesenheit und Anwesenheit eines DAT-Antagonisten auf. Der spezifische DAT-vermittelte triche Strom wird dann bestimmt, indem die in Gegenwart eines DAT-Antagonisten aufgezeichneten Spuren von den ohne den Antagonisten aufgezeichneten Emper-Spuren subtrahiert werden.
Eine Ablenkung der triziellen Ströme nach oben entspricht einem hier gezeigten Fluss von Dopamin nach außen. Ein DAT vermittelte die aufgezeichneten Ströme, indem er die Membranspannung um 20 Millivolt zwischen minus 60 und plus 100 Millivolt von einem Haltepotential von minus vier C Millivolt erhöhte, wobei die Pipette im Ganzzell-Patching-Modus zwei millimolare Dopamin enthielt. Hier ist der metrische Emper-Strom, der gleichzeitig mit dem Strom der gesamten Zelle erfasst wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den umgekehrten Transport von Dopamin über den Dopamintransporter in einem spannungsgeklemmten Neuron misst. Denken Sie daran, die Integrität der parametrischen Elektrode vor und nach den Experimenten zu überprüfen, und vergessen Sie nicht, die Spuren, die in Gegenwart dieses Antagonisten aufgezeichnet wurden, von den ohne den Antagonisten aufgezeichneten Verlaufsspuren zu subtrahieren.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Messung des reversen Transports von Dopamin in Neuronen unter Verwendung simultaner Patch-Clamp- und Pyrometrie. Die Methode ermöglicht die Beurteilung der Dopamintransporter (DAT) vermittelten Freisetzung bei gleichzeitiger Kontrolle der Neuronenspannung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neurotransmitter-Dynamik
Hintergrund
- Dopamin ist ein kritischer Neurotransmitter, der an verschiedenen Gehirnfunktionen beteiligt ist.
- Der Dopamintransporter spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Dopaminspiegel.
- Das Verständnis der reversen Transportmechanismen ist wesentlich für Einblicke in die dopaminerge Signalübertragung.
- Diese Technik kombiniert Spannungsclamping mit amperometrischen Messungen für erhöhte Genauigkeit.
Zweck der Studie
- Um den reversen Transport von Dopamin in spannungsgeklampten Neuronen zu messen.
- Um die Beziehung zwischen DAT-Aktivität und Dopaminfreisetzung zu untersuchen.
- Um eine Methode für die Untersuchung der dopaminergischen Neuronenfunktion in Echtzeit bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Testen der Integrität der pyrometrischen Elektrode mit Dopamin.
- Erreichen eines Whole-Cell-Patches des Neurons mit einer Patch-Pipette.
- Kontrolle der Zellspannung mit der Patch-Pipette.
- Aufnahme der DAT-vermittelten Dopaminfreisetzung mittels der pyrometrischen Elektrode.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung der Dopaminfreisetzung während des Spannungsclampings.
- Nachgewiesene Wirkung von DAT-Blockern auf den Dopamintransport.
- Einblicke in die regulatorischen Mechanismen des Dopamintransports.
- Validierung der Methode zur Untersuchung der neuronalen Dopamindynamik.
Schlussfolgerungen
- Die Technik misst effektiv den reversen Transport von Dopamin.
- Die gleichzeitige Kontrolle der Spannung verbessert das Verständnis der DAT-Funktion.
- Diese Methode kann auf weitere Studien zur dopaminergen Signalübertragung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of dopamine efflux via the dopamine transporter under voltage control, providing mechanistic insight into transporter function relevant to neuropsychiatric drug discovery. By isolating DAT-mediated release in real time, it supports target validation and de-risks hypotheses about dopaminergic signaling in disease models. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking transporter activity to neurotransmitter dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the dopamine transporter's efflux mechanism to validate functional target engagement in live neurons.
- Operational Value: Enables simultaneous electrophysiological and amperometric recording to correlate membrane potential with transporter-mediated dopamine flux.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved oxidative current readouts that reflect DAT-dependent dopamine release under controlled voltage steps.
- Operational Value: Establishes a reproducible assay format for measuring transporter-mediated efflux, supporting compound screening for DAT modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links DAT efflux activity to extracellular dopamine homeostasis, informing disease models where transporter dysfunction is implicated.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system to assess genetic or pharmacological perturbations of dopamine transporter function.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling mechanistic de-risking of dopamine transporter targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transporter reversal mechanisms and pathway clarification in dopaminergic neurons.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound effects on DAT-mediated efflux.
- Analytics: Provides simultaneous whole-cell current and amperometric measurements to isolate DAT-specific signals via pharmacological subtraction.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling dopamine dysregulation in voltage-controlled neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing transporter function across multiple neuronal models or disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by directly measuring efflux-mediated dopamine release under physiological voltage control.
- Operational Value: Promotes assay standardization through synchronized patch clamp and amperometry, reducing variability in neurotransmitter flux measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying transporter mechanism of action, reducing late-stage attrition due to mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DAT-targeting compounds based on functional efflux modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, amperometry, and neuronal culture to maintain electrode integrity and signal fidelity.
- Depends on low-noise instrumentation including hydraulic manipulators, dual Axopatch 200B amplifiers, and carbon fiber electrodes for simultaneous recording.
- Necessitates cross-team standardization of voltage protocols and antagonist subtraction methods to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations for different neuronal models, particularly regarding dopamine transporter expression levels and membrane health.
- Includes practical limitations such as dopamine solution oxidation, requiring protective handling and baseline validation before and after experiments.
