Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung humaner IPS-Zellen über retrovirusvermittelte Überexpression von OCT vier, SOX 2K, LF vier und M mit einem GFP-Reportersystem. Dies wird erreicht, indem zunächst die entsprechende Menge an einzelnen GFP-exprimierenden Retroviren hinzugefügt wird. Als nächstes werden die GFP-exprimierenden virusinfizierten Zellen in 0,1%ige gelatinebeschichtete Platten mit embryonalen Mausfibroblasten übertragen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Medium durch humanes embryonales Stammzellkulturmedium zu ersetzen. Schließlich werden GFP-stummgeschaltete IPS-Kolonien isoliert, die eine ähnliche Morphologie wie humane embryonale Stammzellen aufweisen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Expression endogener pluripotenter Marker durch Immunfluoreszenzfärbung und R-T-Q-P-C-R.

Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie der Lebensstilfärbung mit pluripotenten Oberflächenmarkern und der Beobachtung einer morphologischen Veränderung ist das wünschenswerte iPad. Zellkolonien können leicht isoliert werden, indem der Verlust der GFP-Expression als Marker für die pluripotenten Zellen verwendet wird, um mit der Kultur zu beginnen. Menschliche Fibroblasten in Fibroblasten Medium einen Tag vor der Infektion Platte einmal 10 bis die fünfte menschliche Fibroblasten in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte am nächsten Tag, aspirieren das Medium, um abgestorbene Zellen zu entfernen, und fügen zwei Milliliter frisches Fibroblastenmedium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Protaminsulfat hinzu.

Fügen Sie dann vorsichtig die entsprechende Menge jedes GFP-exprimierenden Virus hinzu, was einer Infektionsmehrheit von fünf entspricht. Inkubieren Sie die Zellen einen Tag nach der Infektion über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie den Virusüberstand und waschen Sie ihn dreimal mit zwei Millilitern PBS.

Fügen Sie dann drei Tage nach der Infektion zwei Milliliter Fibroblastenmedium hinzu. Überprüfen Sie die GFP-Fluoreszenz und füllen Sie die Vertiefung mit zwei Millilitern auf. Fibroblastenmedium am folgenden Tag Platte einmal 10 bis 10 Viertel pro Quadratzentimeter bestrahlte Maus-, embryonale Fibroblasten- oder Meth-Feederzellen in Fibroblastenmedium auf eine 10 Zentimeter große Petrischale, die mit 0,1% Gelatine beschichtet ist.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag lösen Sie die infizierten menschlichen Fibroblasten mit einem Milliliter 0,05%Tripsin EDTA für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius ab und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 G. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern Fibroblastenmedium und spielen Sie die Zellen auf vorbeschichteter 0,1%iger Gelatine mit mfs ab. 24 Stunden später.

Ersetzen Sie das Medium durch ein HESC-Kulturmedium und wechseln Sie das Medium täglich. ESC-ähnliche Kolonien beginnen 20 bis 27 Tage nach der Infektion nach dem Auftreten von ESC-ähnlichen Kolonien unter einem Fluoreszenzmikroskop zu erscheinen. Überprüfen Sie, ob in einer Kolonie, die eine ähnliche Morphologie wie HSCs aufweist, keine GFP-Fluoreszenz vorhanden ist.

Mit einer 10-Mikroliter-Pipette. Entnehmen Sie einzelne IPSC-Kolonien und geben Sie sie in eine Vertiefung einer mit Gelatine und Meth beschichteten 12-Well-Platte und ergänzen Sie sie mit HESC-Medium. Wechseln Sie das Medium täglich durch die Zellen, indem Sie die Platte mit einem Milliliter DMM F 12 waschen.

Dann 0,5 Milliliter Kollagenase hinzufügen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit DM A MF 12. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter frisches HESC-Medium hinzu.

Anschließend mit einem Zellheber die Kolonien in kleine Stücke aufbrechen und die restlichen Zellen von der Platte lösen. Übertragen Sie die resuspendierten Stücke der Bienenvölker in eine Vertiefung mit sechs mit Gelatine und MEF beschichteten Löchern. Gut anrichten, anrichten und zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Zur Überprüfung der Zellen durch Immunfluoreszenz. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und fixieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4%Paraldehyd. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit PBS und permeieren Sie sie 30 Minuten lang mit 0,2% Tritton X 100 in PBS.

Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Zellen zwei Stunden lang mit 3%BSA in PBS inkubieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit Primärantikörpern. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie mit Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Waschen Sie die Zellen während der letzten Wäsche dreimal mit PBS. Dappy dazugeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bilden Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop für quantitative Echtzeit ab.

PCR-Isolat der Gesamt-RNA aus humanen IPCs, die aus menschlichen Fibroblasten gewonnen wurden. Mit einem RNA-Isolationskit. Synthetisieren Sie die cDNA des ersten Strangs mit reverser Transkriptase.

Verwenden Sie es dann als Vorlage für QPCR, um Pluripotenzgene nachzuweisen. Humane Fibroblasten, BJ einer, der mit einem Cocktail von Retroviren infiziert wurde, die OCT vier, SOX zwei, KLF vier trugen, und Mick, hier gezeigt, sind die morphologischen Veränderungen, die während der Reprogrammierung ab dem fünften Tag beobachtet wurden. In den heutigen Jahren 10, 14 und 21 beginnen die Zellen nach 21 Tagen die HESC-ähnliche Morphologie zu zeigen, und die IPCs werden durch GFP-Fluoreszenz erkannt.

Pluripotente Stammzellen wie ESCs und IPCs exprimieren die molekulare Maschinerie zur Unterdrückung der proviralen Genexpression. Die hier verwendeten retroviralen Vektoren exprimieren jedoch GFP zusammen mit Reprogrammierungsgenen durch retrovirale LTR. Daher wird davon ausgegangen, dass Zellen, die kontinuierlich GFP exprimieren, Transgene ohne provirales Gen-Silencing exprimieren, wie hier getreu zu sehen ist, reprogrammierte IPSC-Kolonien, die das Pluripotency Molecular Network erwerben, zeigen das Fehlen von GFP-Expression.

Diese Abbildung zeigt die immunhistochemische Analyse von Kolonien, die von Detroit 5 51 Fibroblasten abstammen, mit Antikörpern gegen TRA 180 1, TRA eins 60 SSEA, vier T vier und Nano, wie erfolgreich zu sehen ist. Umprogrammierte IPCs exprimieren all diese Marker. Darüber hinaus wurde eine quantitative R-T-P-C-R durchgeführt, um die Genexpression zu analysieren, und zeigte, dass T vier SOX two, KLF vier M und nano im Vergleich zu den elterlichen Fibroblastenzellen signifikant erhöht waren, aber entsprechend denen von H neun HSCs.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Virus infizieren, die vollständig lippenprogrammierten IPA-Zellen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie identifizieren und aufnehmen können.