Name: Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu iPS-Zellen mittels retroviraler Vektoren mit GFP-Reporter. Diese Methode ermöglicht die einfache Identifizierung pluripotenter Kolonien durch GFP-Silencing und unterstützt Forschung in der Stammzellbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von der Yale School of Medicine and Child Health Research Award von Charles Hood Foundation finanziert.

1. Reprogrammierung von Retrovirus Reprogrammierungsfaktoren <ol><li> Humane Fibroblasten in Fibroblasten-Medium (10% FBS in DMEM mit Pen / Strep) kultiviert. </li><li> Einen Tag vor der Infektion, Platte 1x10 5 humane Fibroblasten in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li><li> Saugen Sie Medium, um tote Zellen zu entfernen und 2 ml frisches Medium Fibroblasten. In Protaminsulfat in einer Endkonzentration von 5 pg / ml. </li><li> Vorsichtig die geeignete Menge jedes GFP-exprimierenden Virus entsprechend einer Multiplizität der Infektion (MOI) 5 5. </li><li> Einen Tag nach der Infektion, entfernen Sie den Virus-Überstand, waschen, dreimal mit 2 ml PBS, dann 2 ml Fibroblasten-Medium. </li><li> Drei Tage nach der Infektion, überprüfen Sie die GFP-Fluoreszenz und füllt die gut mit 2 ml Fibroblasten-Medium. </li><li> Vier Tage nach der Infektion Platte 1x10 4 / cm 2 bestrahlt embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) Fibroblasten-Feeder-Zellen in Medium auf eine10-cm-Petrischale mit 0,1% Gelatine beschichtet. Bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Fünf Tage nach der Infektion lösen infizierten menschlichen Fibroblasten mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° C, und für 5 Minuten bei 200 g. Saugen Sie das Medium, und Zellen mit 10 ml Fibroblasten-Medium. Übertragen der Zellen in eine Pre-beschichteten 10-cm-Platte. </li><li> Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit hES-Kulturmedium (20% Knock-Out Serumersatz, DMEM/F12, 0,1 ml nicht-essentielle Aminosäuren, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol). Ändern Sie das Medium täglich. ESC-ähnliche Kolonien beginnt, am Tag 20-27 nach der Infektion auftreten. </li></ol> 2. Isolierung und Expansion von IPSCs <ol><li> Unter einem Fluoreszenzmikroskop, das Fehlen der GFP-Fluoreszenz in einer Kolonie, die eine ähnliche Morphologie zeigt, HES zu überprüfen. </li><li> Mit einem 10 ul Pipette, Pick einzelnen iPSC Kolonien und legen Sie sie in eine Vertiefung einer Gelatine-und MEF-CoATed 12-Well-Platte und ergänzt mit hES-Medium. Ändern Medium täglich. </li><li> Für die Passage, waschen Sie die Platte mit 1 ml DMEM/F12, dann fügen Sie 0,5 ml Kollagenase, und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 ° C </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit DMEM/F12. </li><li> 2 ml frisches Medium hESC. Die Verwendung eines Handys Heber, brechen die Kolonien in kleine Stücke und lösen verbleibenden Zellen von der Platte. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Stücke von Kolonien in eine Vertiefung einer Gelatine-und MEF-beschichteten 6-Well-Platte. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz-Analyse von pluripotenten Marker <ol><li> Die Zellen werden dreimal mit PBS und mit 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Danach weitere Reinigung die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 30 min. Permeabilisieren </li><li> Sperren nicht-spezifische Bindung durch Inkubation von Zellen mit 3% BSA in PBS für zwei Stunden. </li><li> Inkubieren der Zellen mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C </li> &lt;li&gt; Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Inkubation der Zellen mit spezifischen sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur, Fernhalten von Licht. </li><li> Die Zellen werden dreimal mit PBS und merken DAPI beim letzten Spülgang durch Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Ermitteln Sie die Färbung mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. </li></ol> 4. Quantitative Real-time PCR Assay für den pluripotenten Marker <ol><li> Isolieren der Gesamt-RNA aus den menschlichen IPSCs aus humanen Fibroblasten mit Qiagen RNeasy-Kit abgeleitet. </li><li> Synthetisieren der Erststrang-cDNA unter Verwendung von SuperScript II Reverse Transkriptase. </li><li> Führen qPCR zu Pluripotenz-Gene unter Verwendung der Primer bereits berichtet erkennen. 6 </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Morphologische Veränderung während der Umprogrammierung Wir infizierten menschlichen Fibroblasten BJ1 und Detroit 551 mit einem Cocktail von Retroviren tragen Oct4, Sox2, Klf4 und MYC,und konnten morphologische Veränderungen während des Programmierens (1) zu erfassen. Einundzwanzig Tage nach der Infektion, erkennen wir kleine iPSC Kolonien durch ihre hES-ähnliche Morphologie. Darüber hinaus erkennen wir IPSCs durch die GFP-Fluoreszenz. Pluripotenten Stammzellen, wie WSR und IPSCs, drücken die molekulare Maschinerie zur Unterdrückung der proviralen Genexpression 09.07. Unsere einzigartige retroviralen Vektors exprimiert GFP zusammen mit Umprogrammierung Gene durch retrovirale LTR. Somit werden Zellen, die GFP exprimieren kontinuierlich als Transgene ohne provirale Gen-Silencing auszudrücken. Getreu umprogrammiert iPSC Kolonien, die die Pluripotenz molekularen Netzwerk zu erwerben zeigen die Abwesenheit von GFP-Expression (Abbildung 2) 10. </li><li> Charakterisierung von Pluripotenz menschlicher IPSCs Wir analysierten Kolonien von Detroit-551 Fibroblasten via Immunhistochemie abgeleitet mit TRA-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 und NANOG Antikörper ( <strong&gt; Tabelle 2). Erfolgreich umprogrammiert IPSCs exprimieren alle dieser Marker (3A). Wir haben auch analysiert Genexpression über quantitative RT-PCR-Analyse. Wir haben beobachtet, dass die Expression von Oct4, Sox2, Klf4, MYC und NANOG signifikant war im Vergleich zu den parentalen Fibroblasten-Zellen erhöht, aber angemessen mit der H9 hESCs (3B). </li></ol><img alt="1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Abbildung 1. Morphologischen Veränderungen der Retrovirus-infizierten menschlichen Fibroblasten. (AD) Progressive morphologische Veränderung in Kolonien von Detroit-551 Fibroblasten mit Umprogrammierung Faktoren infiziert. Tag 5 (A), Tag 10 (B), Tag 14 (C), Tag 21 (D). Die Zellen zeigen den hES-ähnliche Morphologie nach 21 Tagen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter fluoreszierende GFP-Expression in Zellen, die eine Neuprogrammierung. </strong&gt; BJ und Detroit 551 Fibroblasten wurden mit Retrovirus vier Umprogrammierung Faktoren 4 infiziert und inkubiert in hES-Medium für vier Wochen. BJ-Fibroblasten (A, B) und Detroit 551 (C, D) zeigen ähnliche morphologische. Vom ersten Tag 21, beginnen GFP-negative Kolonien zu bilden, aus denen die bona fide IPSCs 10. (E, F) zeigen, verwandelt Detroit 551 Zellen, die nicht ordnungsgemäße Umprogrammierung unterzogen wurden. (A, C, E) Kolonien unter Phasenkontrast-Ansicht. (B, D) richtig Zellen, die das GFP-Silencing zeigen umprogrammiert. (F) helle GFP-Expression von transformierten Kolonie. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Charakterisierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen. (A) Menschliche iPS-551-K1 Zellkolonien auszudrücken Marker gemeinsam pluripotenten Zellen. DAPI-Färbung zeigt die gesamte Zellgehalt pro Feld. (B) Quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) für die Expression von Oct4, Sox2, Klf4, MYC im elterlichen fibroblast, 551-iPS-K1 IPSCs, H9 und humanen embryonalen Stammzellen (hES). Die Daten wurden gegen β-Actin Housekeeping-Gen normalisiert und aufgetragen relativ zu der Expression in den parentalen Zellen 4 Fibroblasten.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Wir haben nichts zu offenbaren.</p

Die Expression von vier Transkriptionsfaktoren umprogrammiert menschlichen Fibroblasten zu IPSCs. Viele Versuche wurden unternommen, um Menschen mit IPSCs nicht integrierenden oder nicht-genetische Ansätze zu einer klinisch sicheren IPSCs generieren generieren. Bisher zeigen diese Methoden extrem niedrigen Wirkungsgrad und erfordern eine weitere Optimierung, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern 14.11. Retro-oder lentiviralen Methoden werden verwendet, um ohne weiteres abzuleiten und anzuwenden IPSCs für de...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80 %</td></tr><tr><td>Knockout-Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20 %</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nebenwichtige Aminosäuren (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol (14,3 M) oder MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90 %</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1 %</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle 1. Kulturmedium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatine, porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0,1 %</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,2 %</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4 %</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3 %</td></tr><tr><td>MEF-Fütterungszellen</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Zellabheber</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskopie: umgekehrtes Mikroskop mit GFP-Filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle 2. Reagenzien und Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

reprogrammierung menschlichen körperzellen in induzierte pluripotente stammzellen (ipscs) mit retroviralen vektoren mit gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Menschliche embryonale Stammzellen (HES) sind pluripotent und einen unschätzbaren zellulären Quellen für In-vitro-Krankheit Modellierung und der regenerativen Medizin ein. Es wurde zuvor gezeigt, dass die somatischen Zellen Pluripotenz kann im Vergleich zur Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und Myc) umprogrammiert werden und werden induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) 2-4. Wie hESCs, sind menschliche pluripotente IPSCs und eine potentielle Quelle für autologe Zellen. Hier beschreiben wir das Protokoll für die menschliche Fibroblasten-Zellen mit den vier Umprogrammierung Faktoren in GFP-haltigen retroviralen Backbone 4 geklont umzuprogrammieren. Mit dem folgenden Protokoll, erzeugen wir Menschen IPSCs in 3-4 Wochen unter die menschliche Kultur ESC Zustand. Menschliche iPSC Kolonien ähneln HES in der Morphologie und zeigt den Verlust der GFP-Fluoreszenz als Ergebnis von retroviralen Transgen-. iPSC Kolonien mechanisch unter einem Fluoreszenz-Mikroskopie isoliertEW verhalten sich ähnlich wie HES. In diesen Zellen erkennen wir die Expression mehrerer Gene und Pluripotenz Oberflächenmarker.

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Humane embryonale Stammzellen (hESCs) sind pluripotent und stellen eine unschätzbare zelluläre Quelle für die In-vitro-Krankheitsmodellierung sowie die regenerative Medizin dar1. Es wurde ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane iPS-Zellen durch eine retrovirale Überexpression von OCT4, SOX2, KLF4 und c-Myc unter Verwendung eines GFP-Reportersystems zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Menge an einzelnen retroviralen Vektoren, die GFP exprimieren, zugegeben wird. Anschließend werden die mit dem GFP-exprimierenden Virus infizierten Zellen in Platten transferiert, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet und mit embryonalen Mausfibroblasten bestückt sind.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Medium durch Kulturmedium für humane embryonale Stammzellen zu ersetzen. Schließlich werden GFP-silentierte iPS-Kolonien, die eine ähnliche Morphologie wie humane embryonale Stammzellen aufweisen, isoliert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Expression endogener pluripotenter Marker mittels immunfluoreszenzbasierter Färbung und R-T-Q-P-C-R.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Färbung lebender Zellen mit pluripotenten Oberflächenmarkern und der Beobachtung morphologischer Veränderungen ist das wünschenswerte iPad. Zellkolonien können leicht isoliert werden, indem der Verlust der GFP-

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

TALEN-vermittelte Geneditierung am Safe-Harbor-AAVS1-Locus ermöglicht eine hocheffiziente Transgen-Addition in humanen iPSCs. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Vorbereitung von iPSCs für die TALEN- und Donorvektorverabreichung, zur Transfektion von iPSCs und zur Auswahl und Isolierung von iPSC-Klonen, um eine gezielte Integration eines GFP-Gens zur Erzeugung von Reporterlinien zu erreichen.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Erfahren Sie die Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu iPS-Zellen mittels retroviraler Vektoren mit GFP-Reporter. Diese Methode ermöglicht die einfache Identifizierung pluripotenter Kolonien durch GFP-Silencing und unterstützt Forschung in der Stammzellbiologie.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Weitere Videos entdecken