Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane iPS-Zellen durch eine retrovirale Überexpression von OCT4, SOX2, KLF4 und c-Myc unter Verwendung eines GFP-Reportersystems zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Menge an einzelnen retroviralen Vektoren, die GFP exprimieren, zugegeben wird. Anschließend werden die mit dem GFP-exprimierenden Virus infizierten Zellen in Platten transferiert, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet und mit embryonalen Mausfibroblasten bestückt sind.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Medium durch Kulturmedium für humane embryonale Stammzellen zu ersetzen. Schließlich werden GFP-silentierte iPS-Kolonien, die eine ähnliche Morphologie wie humane embryonale Stammzellen aufweisen, isoliert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Expression endogener pluripotenter Marker mittels immunfluoreszenzbasierter Färbung und R-T-Q-P-C-R.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Färbung lebender Zellen mit pluripotenten Oberflächenmarkern und der Beobachtung morphologischer Veränderungen ist das wünschenswerte iPad. Zellkolonien können leicht isoliert werden, indem der Verlust der GFP-Expression als Marker für pluripotente Zellen genutzt wird, um die Kultur zu beginnen. Menschliche Fibroblasten werden einen Tag vor der Infektion in Fibroblasten-Medium kultiviert; dazu werden 1 × 10⁵ menschliche Fibroblasten pro Bohrung in eine 6-Loch-Platte gegeben. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt, um tote Zellen zu entfernen, und mit zwei Millilitern frischem Fibroblasten-Medium ergänzt, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Protaminsulfat enthält.

Fügen Sie dann vorsichtig die entsprechende Menge jedes GFP-exprimierenden Virus hinzu, die einer Multiplizität der Infektion von fünf entspricht. Inkubieren Sie die Zellen einen Tag nach der Infektion über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das virale Überstandmedium und waschen Sie dreimal mit je zwei Milliliter PBS.

Dann fügen Sie zwei Milliliter Fibroblastenmedium drei Tage nach der Infektion hinzu. Überprüfen Sie die GFP-Fluoreszenz und ergänzen Sie die Vertiefung mit zwei Millilitern Fibroblastenmedium. Am folgenden Tag plattieren Sie ein Mal 10 hoch 4 pro Quadratzentimeter bestrahlte murine embryonale Fibroblasten oder Meth-Fütterungszellen in Fibroblastenmedium auf eine 10 Zentimeter große Petrischale, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet ist.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag lösen Sie die infizierten humanen Fibroblasten mit einem Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius ab und zentrifugieren fünf Minuten bei 200 ×g. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Fibroblastenmedium und säen Sie die Zellen erneut auf vorbeschichteten 0,1 %igen Gelatin mit mfs aus. 24 Stunden später.

Ersetzen Sie das Medium durch HESC-Kulturmedium und wechseln Sie das Medium täglich. ESC-ähnliche Kolonien werden 20 bis 27 Tage nach der Infektion nach dem Auftreten von ESC-ähnlichen Kolonien unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar. Überprüfen Sie das Fehlen von GFP-Fluoreszenz in einer Kolonie, die eine ähnliche Morphologie wie HSCs aufweist.

Unter Verwendung einer 10-Mikroliter-Pipette einzelne iPSC-Kolonien aufheben und in eine Vertiefung einer mit Gelatine und Meth beschichteten 12-Loch-Platte geben, die mit HESC-Medium ergänzt ist. Das Medium täglich wechseln und die Zellen durch Waschen der Platte mit einem Milliliter DMM F 12 passagieren.

Dann 0,5 Milliliter Kollagenase hinzufügen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen zweimal mit DM A MF 12 waschen. Anschließend zwei Milliliter frisches HESC-Medium hinzufügen.

Verwenden Sie dann einen Zellabheber, um die Kolonien in kleine Stücke zu zerlegen und die verbleibenden Zellen von der Platte zu lösen. Überführen Sie die resuspendierten Koloniestücke in eine Vertiefung einer mit Gelatine und MEF beschichteten sechswelligen Platte und inkubieren Sie zwei Tage bei 37 Grad Celsius.

Überprüfen Sie die Zellen mittels Immunfluoreszenz. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und fixieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 % Paraldehyd. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS und permeabilisieren Sie sie 30 Minuten lang mit 0,2 % Triton X-100 in PBS.

Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Zellen zwei Stunden lang mit 3 % BSA in PBS inkubieren. Anschließend inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper. Waschen Sie danach die Zellen dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit dem sekundären Antikörper.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS; fügen Sie während des letzten Waschschritts Dappy hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Bilden Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop für eine quantitative Echtzeitanalyse ab.

PCR zur Isolierung von Gesamt-RNA aus menschlichen IPCs, die aus menschlichen Fibroblasten stammen. Verwendung eines RNA-Isolationskits. Synthese des ersten cDNA-Strangs unter Verwendung von Reverse Transkriptase.

Verwenden Sie es anschließend als Vorlage für die QPCR, um Pluripotenzgene nachzuweisen. Menschliche Fibroblasten vom Typ BJ, die mit einem Cocktail von Retroviren infiziert wurden, die OCT4, SOX2, KLF4 und c-Myc tragen, zeigen hier die morphologischen Veränderungen, die während der Reprogrammierung ab Tag 5 beobachtet wurden. Am Tag 10, 14 und 21 beginnen die Zellen, eine HESC-ähnliche Morphologie aufzuweisen, und die iPSCs sind anhand der GFP-Fluoreszenz erkennbar.

Pluripotente Stammzellen wie ESCs und IPCs exprimieren die molekulare Ausrüstung, um die Expression proviraler Gene zu unterdrücken. Die hier verwendeten retroviralen Vektoren exprimieren jedoch GFP zusammen mit Reprogrammierungsgenen über retrovirale LTRs. Daher werden Zellen, die kontinuierlich GFP exprimieren, als solche betrachtet, die Transgene ohne provirale Gen-Silenzierung exprimieren, wie hier genau beobachtet. Reprogrammierte iPSC-Kolonien, die das molekulare Netzwerk der Pluripotenz erworben haben, zeigen das Fehlen der GFP-Expression.

Diese Abbildung zeigt die immunhistochemische Analyse von Kolonien, die aus Detroit 551-Fibroblasten stammen, mit Antikörpern gegen TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, T4 und Nanog, wie erfolgreich zu sehen ist. Umprogrammierte IPCs exprimieren alle diese Marker. Zusätzlich wurde eine quantitative RT-PCR durchgeführt, um die Genexpression zu analysieren, und ergab, dass T4, SOX2, KLF4M und Nanog im Vergleich zu den ursprünglichen Fibroblasten deutlich erhöht waren, jedoch auf einem Niveau lagen, das dem von H9-HSCs entspricht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Virus infiziert, die vollständig lip-programmierten IPA-Zellen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie identifiziert und isoliert.