Name: Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Erfahren Sie eine phänotypische Screening-Methode zur Isolierung von Toxoplasma gondii-Mutanten mit temperatursensiblen Egress-Phänotypen. Diese Technik ermöglicht die effiziente Anreicherung von Mutanten mit Defekten beim Verlassen der Wirtszelle.

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Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N und National Institutes of Health Research Grant AI081220 finanziert. BIC wird von einem Tempelritter Eye Foundation Forschungsstipendium unterstützt.

Überblick Protokolle sind vorgesehen, um zunächst den Dosierung des Mutagen was zu einer 70% igen Abtötung der Parasiten (Protokoll 1). Im nächsten Verfahren wird bereitgestellt, um die induzierten Mutanten Austritt aus einer mutagenisierten Parasit Pool (Protokoll 2, Abbildung 2) zu bereichern. Dies wird durch ein Protokoll, um die Inzidenz von Austritts-Mutanten, die in dem angereicherten Pool zu testen, oder um den Austritt Phänotyp in den einzelnen Mutanten (Protokoll 3) validieren gefolgt. Schließlich wird ein Protokoll vorgesehen, um einzelne Klone aus Parasiten angereichert Populationen zu erzeugen durch limitierende Verdünnung (Protokoll 4). 1. Titration von Mutagen Seien Sie besonders vorsichtig, wie zB doppelte Handschuhe, beim Umgang mit hoch mutagene Verbindungen und Flüssigkeiten. Sammeln flüssiger Abfälle getrennt für die ordnungsgemäße Entsorgung. <ol><li> Inokulieren T25 Zellkulturflaschen konfluent mit humaner Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen mit 1 ml frisch lysiert Tachyzoiten und wachsen 18-25 h bei 37 °; C unter 5% CO 2 in Ed1 Medium (D-MEM mit 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, 0,2 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 0,25 mg / ml Amphotericin B ergänzt ). Siehe Roos et al. für das allgemeine Wachstum und Medien der HFF-Zellen und Parasiten 21. </li><li> Ersetzen-Medium mit 10 ml 0,1% fötalem Rinderserum Medium (verdünnte Ed1 1:10 in D-MEM) und verlassen in angefeuchteter 37 ° C Inkubator unter 5% CO 2 (genannt &quot;37 ° C Inkubator&quot; Von hier an) für 10 min . </li><li> Fügen Sie 0, 12,5, 25, 50 oder 100 ul ENU (1 M Stammlösung in DMSO) oder EMS (1 M Stammlösung in DMSO) pro Flasche (Mutagen Arbeitsverdünnungen wird sein 1,25, 2,5, 5 und 10 mM). In DMSO zu 100 ul für jede Flasche. Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C-Inkubator. </li><li> Waschen dreimal für 10 Sekunden bei Raumtemperatur durch Spülen der Monoschicht mit 10 ml kaltem PBS (bei 4 ° C vorgekühlt). </li><li> 5 ml PBS, kratzen die lose Monolayer mit einer Gummi-Polizist (SCR-Zelleaper), passieren die Zellen durch eine geschabt 26,5 g Nadel physisch zu entfernen, den Parasiten aus den Fibroblasten (Clip von der Welle außerhalb der Nadel mit schweren Schere Setzen Sie die Nadel) und Filter mit 3,0 um Polycarbonat-Filter. Mehrere Nadelpassagen wird die Effizienz der Freigabe Parasiten aus der Wirtszelle. </li><li> Zählen Sie die Parasit-Konzentration unter Verwendung eines Hämocytometers. Lassen Sie sich die Parasiten für 5 min in der hemocytomer regeln, bevor das Zählen. </li><li> Verdünnen Parasiten zu 10.000 Parasiten pro 3 ml in Ed1 (10 ml für 33.333 Parasiten benötigt werden). </li><li> Beimpfen einer Mulde in einer 6-Well-Platte mit 3 ml der verdünnten Parasiten (mit 10.000 Parasiten). Serienmäßig verdünnen die Parasiten 10-fach über 3 Brunnen in einer 6-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen mit 2,7 ml Ed1 durch die Übertragung von 300 ul aus dem ersten gut. Lassen Platten ungestört in der 37 ° C Inkubator für 7 Tage. </li><li> Saugen Sie Medium, beheben 15 min mit 3 ml / Well 100% Ethanol, Fleckmit 3 ml / well Kristallviolett-Lösung (12,5 g Kristallviolett in 125 ml Ethanol mit 500 ml 1% Ammoniumoxalat gemischt) für 15 min, mit 3 ml spülen / Vertiefung PBS (1 Minute) und an der Luft trocknen. Alle bei Raumtemperatur. </li><li> Count-Plaques und wählen Konzentration von Mutagen benötigt, um das Überleben von 30% der Parasiten ausgesetzt (70% Töten Dosierung: siehe Abbildung 1) zu erreichen. Eine Dosierung von 70% Abtötung wurde historisch verwendet 14 und induziert weniger als 100 Punktmutationen pro Genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript eingereicht). </li></ol> 2. Anreicherung von Austritts-Mutanten (2) <ol><li> Führen Mutagenese, wie oben mit einem Mutagen Dosierung induziert 70% Tötung beschrieben. Aufwachsen, die mutagenisierten Population für eine Passage in einem neuen Kolben von Wirtszellen. </li><li> Infect eine T25, HFF konfluenten Zellkulturflasche mit 120.000 frisch lysiert Parasiten aus einer mutagenisierten Population in 10 ml Ed1. Inkubieren Sie für 2 Stunden in einem 35 ° C Inkubator unter 5% CO2 und befeuchtet (von hier an als &quot;35 ° C Inkubator&quot;). </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 Medium mit 25 mg / ml Dextransulfat (DS) 13 ergänzt. Inkubieren Sie für 26 Stunden in einem 40 ° C Inkubator unter 5% CO 2 und befeuchtet (von hier an als &quot;40 ° C Inkubator&quot;). </li><li> Bereiten funktionierende Lösung des Ausgangs-Enhancer. Verdünnen Sie die Ausgangs-Induktor der Wahl am Arbeitsplatz-Konzentration in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml HBSSc mit 25 mg / ml DS ergänzt. Pre-warm die Verdünnungen für 30 min in einem 37 ° C im Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Arbeit Konzentrationen. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Parasiten infizierte Flaschen und fügen vorgewärmten Egress Induktor Lösung. Inkubieren in der 37 ° C-Inkubator für die Zeiten in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 mit 25 mg / ml DS und 50 uM Pyrrolidindithiocarbamat ergänzt (PDTC: add 5 ul 100 mM PDTC Lager in PBS) 13. Inkubieren 5 Stunden in einem 35 ° C Inkubator. </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden einmal mit 10 ml PBS (Raumtemperatur) und fügen Sie dann 10 ml Ed1 Medium. Setzen Flaschen zurück in die 35 ° C Inkubator bis Parasiten zerstören die Monoschicht: Schüttelkolben täglich. Diese Erholung dauert ca. 7 Tage. </li></ol> 3. Validierung der Mutante durch Austritts-Assays Nach der Durchführung der Bereicherung Bildschirm und das Erwachsenwerden der angereicherten Population für eine Passage in HFF-Zellen müssen die Phänotypen von einem Austritt Assay 11,13 bestätigt werden. Dieser Test sollte auch verwendet, um einzelne Klone nach dem Protokoll Nr. 4 zu bestätigen. <ol><li> Inokulieren 20.000 Parasiten pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen auf Deckgläsern (1 ml Medium pro Vertiefung Ed1) gezüchtet. Inkubieren 8 Stunden in einem 35 ° C Inkubator übertragen Sie dann in eine 40 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Waschen mit 1 ml / Vertiefung PBS (10 Sekunden bei Raumtemperatur). 1 ml Ausgangs-Induktoren (DMSO eine einzige negative Kontrolle), vorgewärmt und verdünnt in HBSSc und inkubieren Sie für die Zeiten, in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Saugen Sie mittel-und fixieren mit 1 ml / Well 100% Methanol für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn Eltern Parasiten Expression eines autofluoreszierendes Protein für die Mutagenese verwendet wurden, fahren Sie mit Schritt 13 fort # 3.5. Wenn nicht-fluoreszierendes Protein exprimierende Parasiten als Elternteil Linie verwendet wurden, färben die feste Deckgläser mit Diff-Quick für 1 min bei Raumtemperatur 11 beflecken. </li><li> Waschen 5 min mit 1 ml / Vertiefung PBS in der 24-Well-Platte bei Raumtemperatur. </li><li> Für fluoreszierende Protein exprimierende Parasiten: schnell spülen Sie das Deckglas in ddH 2 O (Eintauchen) und montieren Sie auf Objektträger unter gelmount um das Fluoreszenzsignal zu schützen. Für Diff-Quick gefärbten Parasiten, waschen 10 Sekunden in 100% Ethanol und lassen Luft trocknen, bevor die Montage auf Folie. </li><li> Unter Verwendung eines (Fluoreszenz) mit einem Mikroskop40-60x objektive zählen der Anteil der Vakuolen egressed gegen den Vakuolen, die intrazelluläre blieb (siehe Abbildung 4). </li></ol> 4. Klonen Austritts-Mutanten durch limitierende Verdünnung Nach der Validierung der Phänotyp des angereicherten Egress Mutantenpopulation Verwendung des Protokolls Nr. 3, muss der polyklonalen Population zu geklont, um einzelne Parasiten Klone zu erhalten. <ol><li> Anzahl Parasitenpopulation in einem Hämozytometer und verdünnt auf eine Konzentration von 500 Parasiten pro ml in Ed1 Medium. </li><li> In einem 384-Well-Platte mit einem konfluenten Monolayer von HFF-Zellen, ersetzen Sie das Medium mit 40 ul / Vertiefung Ed1 Medium unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette. Wie in 5 gezeigt, können vier polyklonale Populationen pro Platte wie folgt kloniert werden: Pipette 40 ul / Vertiefung der verdünnten Mutante 1 in Vertiefungen C3-C12, Mutante 2 in Vertiefungen C13-C22, Mutante 3 in Vertiefungen H3-H12 und mutante 4 in Brunnen H13-H22 (Endvolumen in Brunnen ist jetzt 80 ul). Mit einer Multi-Kanal-Pipette, pipet das Solution auf und ab 5 mal, dann Transfer 40 ul auf die Zeile unter der Startreihe (aus Zeile C nach D oder Zeile H bis I). Fahren Sie diese 2-fach serielle Verdünnungen durch Reihe G (Mutanten 1 und 2) oder Zeile N (Mutanten 3 und 4). Entsorgen Sie die zusätzlichen 40 pl aus der letzten Reihe. Inkubieren in einem 35 ° C Inkubator für 7-10 Tage, ohne die Platte. </li><li> Überprüfen Sie die Brunnen auf einem inversen Mikroskop mit einem 10-20x-Objektiv für das Vorhandensein von einzelnen Plaques sichtbar als &quot;Löcher&quot; in der Monoschicht. </li><li> Pick 4 Vertiefungen pro Mutante mit einem einzelnen Plaque und übertragen die Parasiten in eine Zellkulturflasche mit konfluenten HFF-Zellen und gefüllt mit Ed1 Medium. Wachsen die Parasiten in einem 35 ° C Inkubator, schütteln die Flaschen täglich um die extrazellulären Parasiten zerstreuen. Dies dauert in der Regel 7 Tage. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Mutagene ENU und EMS sind nicht stabil, wenn sie über lange Zeiträume gelagert. Daher Testen des mutagenen Machtdie Bestände ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Typische Titrationsergebnisse und Tötung Kurven sowohl für ENU und EMS sind in Abbildung 1 dargestellt. Es wird jedoch empfohlen, Plaque-Assays für jede Mutagenese-Experiment zu vergewissern, dass die geeignete Dosis verwendet wurde durchführen. Um die Vielfalt in der mutagenisierten Parasit Bevölkerung zu erhalten, ist es wichtig, mit dem Austritts-Mutante Bildschirm so schnell wie möglich vorzugehen. Typischerweise wird eine Passage der Parasiten in einen neuen Kolben durchgeführt, damit die überlebenden Parasiten, bevor er nach vorne mit dem Bildschirm wiederherzustellen. Es sollte bedacht werden, dass dies gelingt, werden in der Division der Mutanten führen. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass mehrere klonale Mutanten nach Abschluss des gesamten Verfahrens isoliert genau das gleiche Erbgut enthalten sein. Um zu vermeiden, Isolieren der gleichen Mutante mehrfach empfohlen, nur eine einzige Austritts-Mutante pro Mutagenese zu isolieren ist, sofern sich die Phänotypen (zB differentielle Austritts-Induktor Empfindlichkeiten) sindsehr verschieden voneinander. Auf der anderen Seite, nicht alle Bildschirm führt zur Isolierung von Mutanten mit dem gewünschten Phänotyp. Vor allem die Ca 2 +-Ionophor A23187 resistenten Phänotyp ist selten und erfordert mehrere Bildschirme und Mutagenese-Experimente, um eine einzelne Austritt mutierten zu isolieren. Deshalb ist es empfehlenswert, um 10.05 Mutagenese und Bildschirm Experimenten parallel durchführen. Die Anreicherung Leistung des Bildschirms wurde durch Mischen einer bekannten Austritts-Mutante mit Wildtyp-Parasiten in unterschiedlichen Verhältnissen getestet. Diese Mischungen wurden auf dem Bildschirm unterworfen, und die Häufigkeit des mutanten Phänotyps in der angereicherten Population wurde bewertet. Durch die Verwendung von Wildtyp-Parasiten auszudrücken zytoplasmatische RFP und eine mutierte Linie, die zytoplasmatische YFP die Inzidenzen konnte schnell mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3) 13 eingerichtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Mutantenphänotypen routinemäßig zu 80% Reinheit werden durch die mit 1 beginnt Egress mutierten Parasiten pro 10.000 Wildtyp-p angereichertarasites 13. Wenn jedoch die Austritts-Mutante: Wildtyp-Parasiten Start Verhältnis 1:100.000 Parasiten, ist die isolierte Population nur 1-2% (1:100) Austritts-Mutanten. Deshalb ist die Bereicherung Macht des Bildschirms befindet sich das 1000-fache. Da der Bildschirm beginnt mit Impfung von 120.000 Parasiten, von denen typischerweise 70% lebensfähig sind wir in der Regel führen zwei Runden der Anreicherung. Die isolierten Parasiten werden zwischen den Runden Bereicherung gewachsen. Dieses Verfahren führt zu einer 100%-Mutante Bevölkerung auch beim Anfahren mit 1:1.000.000 Egress Mutante: Wildtyp-Parasiten. Der Austritt Assay zu validieren und zu charakterisieren, die Phänotypen erfordert eine Vielzahl von Wirtszelle Infektion, die Differenzierung der einzelnen Vakuolen erlaubt. Dies ist besonders kritisch bei der Analyse der Bedingungen mit einem hohen Anteil von Austritts wie die einzelnen Parasiten finden sich überall. Wie in 4 gezeigt, wenn egressed Populationen nicht gut getrennt sind, ist es einfach, den Anteil zu unterschätzendes Ausgangs durch Zählen zwei egressed Vakuolen als eine Vakuole. Seit Egress und Invasion verbundenen Prozesse sind, und einige temperaturempfindliche Phänotypen zeigen einen milden Phänotyp bei der niedrigeren Temperatur, werden nicht alle Mutanten haben ähnliche Invasion Wirkungsgrade. Solche Mutanten ist daher an das Mehrfache Dosen inokuliert werden, um eine ausreichend hohe Dichte Vakuole für eine genaue Bewertung der Austritts-Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus haben einige Austritts-Induktoren nicht effizient stimulieren Austritt von Vakuolen, die vier oder weniger Parasiten. Als solches ist es wichtig, dass Vakuolen acht Parasiten oder mehr enthalten beim Starten des Austritts-Assay. In unserem Labor haben wir Mutanten-Bildschirm mit einer bestimmten Ausgangs-Enhancer gegen andere Ausgangs-Enhancer isoliert. Durch die Profilierung ihrer Kreuzreaktivität können die Mutanten in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Schließlich werden nicht alle Egress Mutanten sein temperaturempfindlich. Insbesondere Mutanten mit Induktoren Egress Auslösung Schritte vor der Veröffentlichung von intracellula isoliertr Ca 2 + sind anfällig für nicht-temperaturempfindliche Phänotypen. Dies liegt an den Bahnen, die parallel zu führen austreten, bevor das Signal konvergiert auf die Freisetzung von intrazellulären Ca 2 + kann. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chemischen Mutagen Dosistitration. A. Plaque-Assays in einer 6-Well-Platte unter Verwendung verschiedener Konzentrationen und EMS verschiedene Anzahlen von Parasiten pro sowie angegeben durchgeführt. Die weißen Flecken sind Parasiten Plaques in der HFF Monoschicht gebildet. B, C. Die Überlebenskurven von Parasiten bei Bestrahlung mit verschiedenen Dosierungen von EMS (B) und ENU (C). Das Überleben wurde durch Plaque-Assays beurteilt. Eine Dosierung induziert 70% Töten ist für Mutagenese-Experimente ausgewählt. Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten + / - Standardabweichung dargestellt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung der Austritts-Mutante Anreicherung Bildschirm. Die Temperatur wird auf der Y-Achse dargestellt, während zeitlichen Verlauf durch das x-Achse dargestellt ist. Grüne Parasiten widerspiegeln Egress mutierten Parasiten, rot Parasiten widerspiegeln Wildtyp-Parasiten. Der Zeitpunkt der Änderungen in den Bedingungen und Stimulation durch Austritt Induktor werden oben angezeigt und sind durch Pfeile auf der blauen Linie reflektiert das Temperaturprofil markiert. Angenommen von Eidell et al. 13. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Abbildung 3. Typische Anreicherung von Austritts-Phänotypen. Anreicherung Ergebnisse eines Austritts-Mutante in Wildtyp-Parasiten in verschiedenen Verhältnissen (x-Achse) versetzt. Der Anteil der Austritts-Phänotypen in der Bevölkerung bis nach dem Bildschirm aufgewachsen auf der y-Achse aufgetragen und wurde durch Durchflusszytometrie (Austritts-Mutante Parasiten exprimiert cytoplasmatischen YFP beurteilt, ausgedrückt Wildtyp-Parasiten cytoplasmic RFP). Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind durch rote, blaue und grüne Datenpunkte dargestellt. Angenommen von Eidell et al. 13. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Abbildung 4. Typische Ergebnisse eines Austritts-Assay. A. Pfeile kennzeichnen vier verschiedenen intakt enthaltenden Vakuolen 4-8 Parasiten. B. Pfeile kennzeichnen vier Gruppen von verstreuten Parasiten widerspiegeln vier unabhängige egressed Vakuolen. Egress wurde durch A23187 (B) oder DMSO als negative Kontrolle (A) induziert. Parasiten exprimieren zytoplasmatische YFP 22. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Abbildung 5. Verdünnungsstufe zur klonalen Linien Parasiten. Vier polyklonale Populationen (rot, blau, gelb, grün) seriell in einem einzigen 384-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen verdünnt. Row C und I erhalten 10 Parasiten pro Vertiefung undsind 2-fach verdünnter (40 + 40 ul ul) bis H und N Reihen, jeweils. Der Grauton zeigt die sinkende Zahl der Parasiten pro Vertiefung. In der Regel werden einzelne Klone in Reihen DF und JL gefunden. <table border="1"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td> Lager </td><td> Arbeitskonzentration </td><td> ul für T25 (10 ml) erforderlich </td><td> Inkubationszeit (min) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M in DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nigericin * </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin nicht in der Anreicherung verwendet werdenment-Bildschirm, wie die Parasiten nicht überleben Nigericin Stimulation; nur Nigericin bei der Validierung von Egress Mutanten. Tabelle 1. Egress-Induktoren in Verfahren verwendet werden. Verdünnen Sie in 10 ml HBBSc mit 25 mg / ml DS für den Bildschirm, oder gar keine DS-Mutante für die Validierung (Ausgangs-Assay). Alle Verbindungen von Sigma-Aldrich.

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<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

<html> Die beschriebene Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Toxoplasma Mutanten mit einer Austritts-Defekt zu isolieren. Wir haben erfolgreich Mutanten auf verschiedenen Stufen des Austritts Bahn, von denen einige eine doppelte Invasion Phänotyp 13 haben isoliert. Mögliche Auswirkungen auf die Invasion kann mit Hilfe der sogenannten Rot-Grün-Assay, die aus Nicht-Parasiten eingedrungen durch Differential-Antikörper-Färbung differenziert 23,24 überfallen werden. Für beide Invasion un...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M Stammlösung in DMSO, Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M Stammlösung in DMSO, Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Dextransulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM Stock in PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Filterhalter </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um Polycarbonat-Filter </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-Inkubatoren </td><td> Verschiedene Hersteller </td><td></td><td> Befeuchteten 5% CO 2, 35, 37 und 40 ° C </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Verschiedene Hersteller </td><td></td><td> Idealerweise invertiert, wide-field mit 63x oder 100x Öl-Objektiv </td></tr></tbody></table> HBSSc (nach Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone Katalognummer SH30588) </li><li> 100 ul 1 M MgCl 2 (100 mM Ende) </li><li> 100 ul 1 M CaCl 2 (100 mM Ende) </li><li> 2,0 ml 1 M Hepes pH 7,3 (20 mM Ende) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mm Ende) </li></ul>

ein genetischer screen zu isolieren toxoplasma gondii host-zelle egress mutanten

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Die weit verbreitete, obligat intrazelluläre, einzelligen Parasiten Toxoplasma gondii verursacht opportunistische Erkrankung bei immungeschwächten Patienten und verursacht Missbildungen bei kongenitaler Infektion. 1: Die lytischen Replikationszyklus wird durch drei Phasen gekennzeichnet. aktive Invasion eines kernhaltigen Wirtszelle; 2. Replikation in der Wirtszelle; 3. aktive Austritt aus der Wirtszelle. Der Mechanismus des Austritts wird zunehmend als eine einzigartige, stark regulierten Prozess, der immer noch schlecht ist auf molekularer Ebene zu verstehen, zu schätzen. Die zugrunde liegenden Ausgangs-Signalwege sind durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf verschiedene Aspekte der Wege 1-5 gekennzeichnet. Als solches, mehrere unabhängige Auslöser Austritts identifiziert worden, die alle auf die Freisetzung von intrazellulärem Ca 2 + konvergieren, ein Signal, das ebenfalls kritisch ist für die Host-Invasion 6-8. Diese Einsicht teilte ein Kandidatengen-Ansatz, der auf die identi geführtFIZIERUNG der Pflanze wie Kalzium abhängige Proteinkinase (CDPK) in Egress 9 beteiligt. Darüber hinaus haben mehrere neuere Durchbrüche im Verständnis Egress gemacht worden mit (chemischen) genetische Ansätze 12.10. Um die Fülle an Informationen pharmakologische mit der zunehmenden Verfügbarkeit von genetischen Toxoplasma kombinieren wir vor kurzem ein Bildschirm erlaubt die Anreicherung für Parasiten Mutanten mit einem Defekt in der Wirtszelle Egress 13. Obwohl chemische Mutagenese mit N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) wird seit Jahrzehnten in der Studie von Toxoplasma Biologie 11,14,15 verwendet worden, erst vor kurzem hat genetische Kartierung von Mutationen zugrunde liegen, die Phänotypen zur Routine geworden 16 -18. Ferner kann durch Erzeugen temperaturempfindlichen Mutanten können essentielle Verfahren präpariert und die zugrunde liegenden Genen direkt identifiziert. Diese Mutanten verhalten, als Wild-Typ unter der permissiven Temperatur (35 ° C), aber nicht zu proliferate bei der restriktiven Temperatur (40 ° C) als Ergebnis der Mutation in Frage. Hier zeigen eine neue phänotypische Screening-Verfahren, um Mutanten mit einem temperaturempfindlichen Austritts-Phänotyp 13 zu isolieren. Die Herausforderung für die Ausgangs-Bildschirmen ist es, aus Nicht-egressed Parasiten, die durch schnelle Re-Invasion und die allgemeine Klebrigkeit der Parasiten zu Wirtszellen kompliziert ist egressed trennen. Ein vorher festgelegten Ausstieg Bildschirm wurde auf einer Reihe von umständlichen Biotinylierung Schritte zur Trennung von extrazellulären Parasiten 11 intrazellulären basiert. Auch diese Methode nicht erzeugen bedingte Mutanten was zu schwachen Phänotypen. Das hier beschriebene Verfahren überwindet die starke Bindung von Parasiten austritt, indem ein Glykan Konkurrenten, Dextransulfat (DS), die Parasiten verhindert das Anhaften von dem Host-Zelle 19. Darüber hinaus sind extrazelluläre Parasiten speziell durch Pyrrolidin (PDTC), die intrazelluläre Parasiten verlässt getötet20 unverletzt. Deshalb mit einem neuen phänotypischen Bildschirm, um gezielt zu isolieren Parasit Mutanten mit Defekten in induzierter Egress, kann die Kraft der Genetik nun voll eingesetzt werden, um die molekularen Mechanismen der Wirtszelle Egress entwirren.

Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie entwirren<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Austritt aus der Wirtszelle. Protokolle werden bereitgestellt, um chemisch mutagenisieren Parasiten, bereichern nach Mutanten mit Defekten in der induzierten Egress und Validierung der Phänotyp der Mutanten geklont.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

Der weit verbreitete, obligat intrazelluläre protozoische Parasit Toxoplasma gondii verursacht opportunistische Erkrankungen bei immungeschwächten Patienten sowie Geburts...

Dieses Video veranschaulicht eine neue phänotypische Screening-Methode, um Mutanten mit einem temperatursensitiven Ausschleusungsphänotyp zu isolieren. Mutagen und Parasiten werden auf Kulturen von mit Toxoplasma infizierten menschlichen Hautoberhaut-Fibroblasten aufgetragen. Zwei Stunden lang werden die nicht eindringenden Parasiten entfernt, und der Kolben wird zur Induktion der Phänotypentwicklung auf 40 Grad Celsius übertragen.Nach 26 Stunden enthalten die Vacuolen acht bis 16 Parasiten. Anschließend werden die Zellen mit egress-induzierenden Verbindungen stimuliert. Mutante Parasiten mit einem Egress-Defekt verbleiben intrazellulär, während Wildtyp-Parasiten in das Medium austreten.Die Wildtyp-Parasiten werden durch Waschen entfernt, und die verbleibenden Zellen erneut bei 35 Grad Celsius inkubiert, um die Mutantenpopulation anzureichern. Schließlich wird das Mutantenphänotyp überprüft und einzelne Parasitenklone durch limitierende Verdünnung aus der angereicherten Population isoliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bio-Inhalationsmethode, liegt darin, dass die gezielte Anreicherung von Egress-Mutanten weitaus effizienter ist.Wir erhielten erstmals die ID für diese Methode, als wir einen Auswanderungsmutanten aus einer Gruppe von Mutanten mit Wachstumsdefekten identifizierten. Mithilfe dieses Mutanten optimierten wir das Screening-Verfahren, indem wir ihn in verschiedenen Verhältnissen mit Wildtyp-Parasiten vermischten. Die Durchführung der Methode wird Bradley Coleman demonstrieren, ein Postdoktorand aus meinem Labor.Dieses Verfahren verwendet stark mutagene Verbindungen und Flüssigkeiten sowie den infektiösen Parasiten. Toxoplasma Gandhi ist der Einsatz geeigneter Schutzausrüstung, einschließlich eines Laborkittels, doppelter Handschuhe und einer生物sicherheitswerkbank unerlässlich. Alle anfallenden flüssigen Abfälle sollten separat gesammelt werden, um fachgerecht entsorgt zu werden.Beginnen Sie damit, konfluente humane Fibroblasten der Vorklappen oder HFF-Zellen mit einem Milliliter frisch lysierten Tachy Lloyds in ed einem Medium zu infizieren. Danach stellen Sie den Kolben in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 für 18 bis 25 Stunden. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch 10 Milliliter Medium mit 0,1 % fetalem Kälberserum und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Nach der Inkubation null, 12,5, 25, 50 oder 100 Mikroliter ENU-Mutagen pro Kolben hinzufügen. Die Arbeitsverdünnungen betragen entsprechend 1,25, 2,5, 5 und 10 Millimolar. Bis zu 100 Mikroliter DMSO zu jedem Kolben hinzufügen.4 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellschicht 3-mal mit je 10 Milliliter kalter PBS jeweils 10 Sekunden lang spülen. 5 Milliliter PBS hinzufügen und mit einem Zellabstreifer die Zellschicht lösen.Danach mit einer robusten Schere die Spitze der Nadelkappe abschneiden, sodass die Nadel nicht freiliegt. Anschließend die Zellen in eine Spritze überführen und mehrmals durch eine Nadel mit 26,5 Gauge führen. Um den Parasiten physikalisch von den Fibroblasten zu lösen, erhöht eine mehrfache Passage durch die Nadel die Effizienz der Freisetzung der Parasiten aus der Wirtszelle.Befestigen Sie einen 3,0-Mikrometer-Polycarbonat-Filter an einer Spritze. Füllen Sie die nadelpassierten Zellen in die Spritze und drücken Sie sie durch den Filter in ein Reagenzglas, um die Parasiten auf einem Hemo-Zytometer zur Zählung aufzubringen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, Parasiten von Partikeln zu unterscheiden.Um den Erfolg sicherzustellen, ist es wichtig, die Parasiten vor der Zählung sedimentieren zu lassen. Nachdem Sie die Parasiten fünf Minuten lang sedimentieren ließen, zählen Sie sie. Sobald die Konzentration von Toxoplasma bestimmt wurde, verdünnen Sie sie auf 3.333 Parasiten pro Milliliter in ED eins auf insgesamt 10 Milliliter.Es werden 33.333 Parasiten benötigt. Geben Sie drei Milliliter in die erste Vertiefung einer Sechs-Vertiefungs-Platte mit HFF-Zellen, um diese mit 10.000 Parasiten zu infizieren. Verdünnen Sie die Parasiten anschließend durch zehnfache serielle Verdünnung in den nächsten drei Vertiefungen, indem Sie jeweils 300 Mikroliter von einer Vertiefung in die nächste übertragen.Lassen Sie die Platten sieben Tage lang ungestört im 37-Grad-Celsius-Inkubator. Nach Ablauf einer Woche saugen Sie das Medium ab und fixieren die Zellen, indem Sie drei Milliliter 100 %igem Ethanol je Vertiefung 15 Minuten lang zugeben. Nach dem Entfernen des Ethanol färben Sie die Zellen, indem Sie drei Milliliter Kristallviolett-Lösung je Vertiefung 15 Minuten lang zugeben.Spülen Sie schließlich jede Vertiefung mit drei Milliliter PBS für eine Minute. Zählen Sie die Plaques, sobald die Platte trocken ist, und wählen Sie die Konzentration des Mutagens, die erforderlich ist, um eine Überlebensrate von 30 % der exponierten Parasiten zu erreichen. Eine Dosis mit 70 % Abtötung wurde historisch verwendet und induziert weniger als 100 Punktmutationen pro Genom.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Egress-Mutanten in der Population anzureichern. Sobald die Population vergrößert wurde, geben Sie 120.000 frisch lysierte Parasiten zu konfluenten HFF-Zellen in 10 Milliliter hinzu. Inkubieren Sie einen Tag lang zwei Stunden bei 35 Grad Celsius.Dies synchronisiert die Population, indem die Besiedlungszeit begrenzt wird. Nach der Inkubation das Medium abpipettieren und die Zellen 10 Sekunden lang mit 10 Milliliter kalter PBS spülen, dann 10 Milliliter ED-Eins-Medium ergänzt mit 25 Milligramm pro Milliliter Dextransulfat hinzufügen.Dadurch werden die Glykan-bindenden Oberflächenproteine auf den Parasiten gesättigt, sodass diese erneut an die Wirtszelle binden und sie neu infizieren können. Inkubieren Sie den Kolben 26 Stunden lang in einem feuchten Inkubator bei 40 Grad Celsius und 5 % CO2. Während dieser Zeit wird normal gefaltetes Protein durch fehlergefaltetes, temperatursensitives Protein ersetzt.Verdünnen Sie am nächsten Tag den gewählten Egress-Induktor auf die Arbeitskonzentration in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter H-B-S-S-C ergänzt mit 25 Milligramm pro Milliliter Dextransulfat enthält. Geben Sie es in ein Wasserbad, um die Lösung 30 Minuten lang vorzuwärmen.Aspirieren Sie das Medium aus den mit Parasiten infizierten Kolben und geben Sie die vorgewärmte Egress-Induktor-Lösung hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, wie in dem beigefügten Dokument angegeben. Danach aspirieren Sie das Medium und spülen Sie für 10 Sekunden. Mit 10 Milliliter kaltem PBS 10 Milliliter ED eins, ergänzt mit 25 Milligramm pro Milliliter Dextransulfat und 50 Mikromolar Pyridin DIO-Carbamat, zugeben und fünf Stunden bei 35 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation das Medium abziehen und einmal 10 Sekunden mit PBS spülen.Dann 10 Milliliter EED 1 Medium hinzufügen und den Kolben in den 35 °C warmen Inkubator zurückstellen. Täglich schütteln, um die ausgetretenen Parasiten zu verteilen.Die Inkubation fortsetzen, bis die Parasiten den Einschichtverbund zerstören. Ungefähr sieben Tage nach dem Anreicherungsscreen wird die Population für einen Durchgang weitervermehrt. Anschließend werden die Phänotypen mittels eines Auswanderungs-Assays bestätigt.Inokulieren Sie 20.000 Parasiten in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte, die konfluente HFF-Zellen auf Deckgläsern enthält, und inkubieren Sie acht Stunden lang in einem 35 °C warmen Inkubator, um die Invasion aller Parasiten im Medium bei permissiver Temperatur zu ermöglichen. Danach überführen Sie die Platte in einen 40 °C warmen Inkubator für 24 Stunden, um das Phänotyp zu induzieren und Schollen mit acht bis 24 Parasiten heranzuziehen, nachdem jede Vertiefung mit einem Milliliter PBS für 10 Sekunden gewaschen wurde. Geben Sie bei Raumtemperatur einen Milliliter Egress-Induktor hinzu, der zuvor in H-B-S-S-C vorgewärmt und verdünnt wurde, und inkubieren Sie für die in der begleitenden schriftlichen Anleitung beschriebenen Zeiträume.Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie, indem Sie je ein Milliliter 100 %iges Methanol pro Vertiefung hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie anschließend mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen und Aufbringen der Deckgläser zählen Sie mithilfe eines Mikroskops mit 40- bis 60-facher Objektivvergrößerung den Prozentsatz an S-Egress im Vergleich zu den intrazellulären Vakuolen. Nach der Validierung des Phänotyps der angereicherten Egress-Mutantenpopulation wird die polyklonale Population geklont, um einzelne Parasitenklone zu erhalten.Nachdem die Parasitenkonzentration auf 500 Parasiten pro Milliliter in ED-einem-Medium in einer 3-84-Well-Platte mit einer konfluenten Monoschicht aus HFF-Zellen eingestellt wurde, ersetzen Sie das Medium mit jeweils 40 Mikrolitern pro Vertiefung ED-einem-Medium unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Vier polyklonale Populationen sind als rot, blau, gelb und grün dargestellt.In dieser Abbildung kann auf einer Platte geklont werden, um diese Pipette zu verwenden. 40 Mikroliter pro Vertiefung verdünnter Mutante eins in die Vertiefungen C3 bis C12, Mutante zwei in die Vertiefungen C13 bis C22, Mutante drei in die Vertiefungen H3 bis H12 und Mutante vier in die Vertiefungen H13 bis H22. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung sollte nun 80 Mikroliter betragen.Danach die Lösung mithilfe einer Mehrkanalpipette fünfmal auf- und abpipettieren und 40&nbsp;Mikroliter in die Reihe unterhalb der Startreihe übertragen. Führen Sie diese Verdünnungsreihen mit Verdünnungsfaktor zwei bis zur Reihe H, Mutanten eins und zwei, bzw. bis zur Reihe N, Mutanten drei und vier, fort. Entsorgen Sie die überschüssigen 40&nbsp;Mikroliter aus der letzten Reihe.Inkubieren Sie die Platte sieben bis zehn Tage lang ungestört in einem 35 Grad Celsius warmen Inkubator. In der folgenden Woche überprüfen Sie die Vertiefungen unter einem invertierten Mikroskop mit einem 10- bis 20-fachen Objektiv auf das Vorhandensein einzelner Plaques, die als Löcher in der Zellschicht sichtbar sind. Wählen Sie vier Vertiefungen pro Mutante mit jeweils einem einzelnen Plaque aus und überführen Sie die Parasiten in einen T-12,5-Zellkulturkolben, der mit HFF-Zellen konfluent ist und mit fünf Milliliter gefüllt wurde.Züchten Sie das Medium ED mit den Parasiten in einem 35 Grad Celsius warmen Inkubator. Schütteln Sie die Kolben täglich, um die extrazellulären Parasiten zu verteilen. Dies dauert in der Regel sieben Tage.Plaque-Assays wurden in einer sechslochigen Platte mit verschiedenen EMS-Mutagenkonzentrationen und unterschiedlichen Anzahlen von Parasiten pro Loch durchgeführt. Wie in diesem Video gezeigt, sind die weißen Stellen in den Löchern Parasiten-Plaques, die sich in der HFF-Monomerschicht auf mit EMS behandelten Platten gebildet haben. Die Ergebnisse dieser Plaque-Assays wurden verwendet, um Überlebenskurven von Parasiten zu erstellen, die zunehmenden Dosen von EMS und ENU ausgesetzt waren.Die Dosis, die eine 70 %ige Abtötung verursacht, wurde anschließend für Mutageneseexperimente ausgewählt. In einem anderen Experiment wurde der Prozentsatz des Auswanderungs-Mutanten-Phänotyps in der Population nach Anreicherung mittels Durchflusszytometrie wie hier gezeigt bestimmt. Wenn das Startverhältnis von Auswanderungs-Mutanten zu Wildtyp-Parasiten eins zu 10.000 betrug, wurde durch Anreicherung eine Reinheit von 80 % erreicht.Jedoch, wenn das Startverhältnis eins zu 100.000 Parasiten betrug, machte die isolierte Population nur ein bis zwei Prozent aus. Diese Daten legen nahe, dass die Anreicherungsleistung des Screenings tausendfach ist. In einem dritten Experiment wurde der Ausbruch durch das Calciumionophor A23187 induziert. In diesen Aufnahmen markieren die Pfeile vier verschiedene VAEs, die vier bis acht Parasiten enthalten, die YFP in den Kontrollen exprimieren.Jedoch markieren die Pfeile vier Gruppen verstreuter Parasiten, die vier unabhängige Egress-VAs widerspiegeln. So lässt sich das Verhältnis von mutiertem zu Wildtyp-Phänotyp einfach durch Zählen bestimmen, nachdem diese Prozedur durchgeführt wurde. Zusätzliche Methoden wie kosmische Komplementation oder die Ganzgenomsequenzierung können durchgeführt werden, um die ursächliche Mutation und damit das Gen von Interesse zu identifizieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Mutagen der gewünschten Art titriert, eine Population von Toxoplasma-Parasiten mutagenisiert und einzelne temperatursensitive Egress-Mutanten aus dieser mutagenisierten Population isoliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paramethyming-resistenten Toxoplasma-Parasiten äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrillen, während Sie dieses Verfahren durchführen.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ...

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Vorwärtsgenetik ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung von Genen in intrazellulären Krankheitserregern, die für die Resistenz gegen zellautonome Immunität wichtig sind. Der derzeitige Ansatz verwendet angeborene Immunzellen, insbesondere Makrophagen, um neue Toxoplasma gondii-Gene zu identifizieren, die für die Immunevasion wichtig sind.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen...

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Bewertung der Hemmungswirksamkeit chemischer Verbindungen gegen in vitro intrazelluläres Wachstum von Toxoplasma gondii mit einem luziferase-basierten Wachstumstest. Die Technik wird verwendet, um die Hemmungsssspezifität durch genetische Deletion des entsprechenden Zielgens zu bestätigen. Die Hemmung von LHVS gegen TgCPL-Protease wird als Beispiel bewertet.

Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung und Genotypisierung von Toxoplasma-Gondii-Stämmen mittels tragbarer Nanoporensequenzierung ausgewählter genetischer Marker, wodurch skalierbare, gezielte Stammerkennung in laborgetreuen Isolaten ermöglicht wird, mit potenzieller zukünftiger Anwendung in Überwachungsumgebungen.

Multi-Locus-Sequenzierung zur Zerrungstypisierung von Toxoplasma gondii

Erfahren Sie eine phänotypische Screening-Methode zur Isolierung von Toxoplasma gondii-Mutanten mit temperatursensiblen Egress-Phänotypen. Diese Technik ermöglicht die effiziente Anreicherung von Mutanten mit Defekten beim Verlassen der Wirtszelle.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

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