Name: Cholesterin Efflux-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Lernen Sie den Cholesterin-Efflux-Assay zur Quantifizierung des Cholesterintransports aus kultivierten Zellen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Plasmasakzeptoren und liefert Einblicke in den Lipidstoffwechsel für biochemische Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526615 und 545906) und zum Teil durch die Regierung von Victoria die OIS-Programm unterstützt. DS ist ein Fellow der NHMRC.

1. Herstellung von [3 H]-Cholesterin <ol><li> In der Dunstabzug, verzichten die erforderliche Menge an [3 H] Cholesterin in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 uCi (19 kBq) pro Vertiefung ist für einen typischen Test erforderlich). </li><li> Wenn [3H]-Cholesterin in Toluol suspendiert wird, trocknen Sie ihn nach unten komplett mit N2-Gas-und resuspendieren mit 100% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 1 uCi (37 kBq / ul. Vortex und gut mischen. </li></ol> 2. Plattieren von Zellen und Kennzeichnung zellulärem Cholesterin Dieses Protokoll wurde getestet mit folgenden Zelltypen: menschliche Monozyten 4,5, THP-1-menschlichen Monozyten-Makrophagen 6,7,8, RAW 264.7 murine Makrophagen 5,9,10,11, HeLa-Zellen 12, HUVEC (HUVEC), BHK-21 Zellen 9, Human-und Maus-Fibroblasten 13,14, HepG2 menschlichen Hepatokarzinomzellen 15 und, in modifizierter Form, von Thrombozyten &lt;sup&gt; 16. <ol><li> Die Zellen und zähle sie. Tafel Zellen in 12-Well-Platten bei der Enddichte von 0.2x10 6 Zellen pro Well in 0,9 ml Vollmedium. Die Zellen werden weiter wachsen und 0.8x10 6 Zellen pro Well zu dem Zeitpunkt der Ausströmung Experiment erreicht. Für Zellen, die sich nicht teilen, wie differenzierte THP-1 Zellen, sollte die Aussaatdichte 0.8x10 6 Zellen pro Vertiefung sein. Bei Verwendung von 6 - oder 24-Well-Platten, doppelt oder halb so viele Zellen pro Well. Die Zahl der Brunnen sollte ausreichend sein für Vierfachbestimmungen Für jeden experimentellen Zustand. </li><li> Wenn die Differenzierung von THP-1-Zellen erforderlich ist, fügen PMA (Endkonzentration 0,1 g / ml) zu den Medien für 48-72 h. </li><li> Fügen Sie eine kleine Teilmenge von Medien in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der [3 H] Cholesterin. </li><li> Waschen Seiten der Röhre mit Medien vor dem Hinzufügen [3 H] Cholesterin in einen separaten Aliquot komplette Medien (100 ul / Well). </li> &lt;li&gt; In der Medien, die [3 H]-Cholesterin in die Vertiefungen mit Zellen (Endvolumen pro Well 1 ml). Wenn keine Behandlung der Zellen vor der Markierung erforderlich ist, können Zellen in [3 H]-Cholesterin-Medium ausplattiert werden. </li><li> Inkubieren Zellen für 48 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 3. Äquilibrierung Incubation <ol><li> Nach 48 Stunden Inkubation, überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, sie sind gesund und sind bei etwa 80% Konfluenz. </li><li> Entfernen Sie das Medium mit [3 H] Cholesterin. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Wiederholen Sie 3 mal Waschen. </li><li> Bereiten serumfreien Medien. Falls erforderlich, aktivieren Zellen durch Zugabe von LXR-Agonisten (z. B. TO-901317 bei 1-4 mmol / l) oder cAMP (0,3 mmol / l; für Zellen der Maus Ursprungs) zu serumfreien-Medien. </li><li> Fügen Sie 500 ul serumfreiem Medium in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren für 18 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Cholesterin Efflux Incubation <ol><li> Nach 18 Stunden Inkubation in Serum-freiem Medium, zu überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie gesund sind und konfluent (mindestens 80% Konfluenz). </li><li> Planen Lösung von Cholesterin Efflux Akzeptoren in serumfreiem Medium. Beispiele für Akzeptoren schließen ein: Apolipoprotein AI (ApoA-I) (Endkonzentration 10 ug / ml) High Density Lipoprotein (HDL) (Endkonzentration 20 ug / ml) Cyclodextrin (Endkonzentration 200 ug / ml) Plasma (Endkonzentration 1-2%) </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. </li><li> Fügen Sie 250 ul serumfreiem Medium mit Akzeptoren in jede Vertiefung. </li><li> Lassen Sie eine Reihe von Brunnen, um Hintergrund-Efflux (Ausstrom zu serumfreien Medien ohne Akzeptor) bestimmen </li><li> Inkubieren Zellen für 2 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Dauer der Inkubation kann Efflux von 30 min bis 8 h variieren, wenn erforderlich. </li></ol> 5. Processing SAmples <ol><li> Nach 2 Stunden Inkubation überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Sammeln Sie Medien in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 14.000 rpm für 1-10 min bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Medium in 7 ml Szintillations-Fläschchen. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Proben bei 4 ° C </li><li> Platzieren Sie Platten in Gefrierschrank für 30 Minuten. Fügen Sie 500 ul dH 2 O in jede Vertiefung. Prüfen Zellen unter dem Mikroskop zu gewährleisten, dass alle Zellen von der Unterseite der Vertiefungen angehoben. Wenn noch anhaftenden, entweder die Platten mit dH 2 O bei 4 ° C über Nacht oder Kratzen Brunnen. </li><li> Wenn alle Zellen aufgehoben wurden ausgeschaltet, und Abpipettieren zum Aufbrechen Zellklumpen. Übertragen Sie 100 ul in 7 ml Szintillationsgefäße. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Platten bei 4 ° C </li><li> Platzieren Sie Szintillationsgefäße auf Szintillationszähler. Konfigurieren Zähler für [3 H] zählen indpm Einheiten. </li></ol> 6. Die Analyse der Ergebnisse <ol><li> Die Rate der Cholesterin-Efflux in der Regel als ein Anteil von Cholesterin aus den Zellen verschoben auf den Akzeptor ausgedrückt. Die folgende Formel verwendet wird: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Die spezifische Abgabe erfolgt als eine Differenz zwischen den Ausfluß in Gegenwart oder Abwesenheit des Akzeptors (leer) berechnet. </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. Timeline <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für ein Ergebnis einer Cholesterin-Efflux Versuchs ist in gezeigt. 1. In diesem Experiment THP-1 Monozyten wurden in Makrophagen und Cholesterin Efflux auf verschiedene Akzeptoren differenziert wargetestet. Cholesterin Efflux um Medium ohne Akzeptoren (&quot;blank&quot;) betrug 0,79% und dieser Wert wurde als nicht-spezifische Efflux angesehen und von anderen Werten abgezogen. Cholesterin Efflux für die menschliche ApoA-I (Endkonzentration 30 ug / ml) war 4,75%. Ein Verweis Plasmaprobe wurde in diesem Experiment aufgenommen, um inter-experimentellen Variabilität überwachen. Eine Referenzprobe kann für die Normalisierung der Daten über eine große Anzahl von Experimenten verwendet werden, aber wir fanden es sinnvoll, den Test wiederholen, wenn die Variabilität ist hoch. Ein Patient Plasma (Endkonzentration 2%) wurde getestet, bevor und nachdem der Patient mit Medikamenten behandelt wurde. Es wurde gefolgert, dass bei diesem Patienten Medikamente hatten einen negativen Einfluss auf die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Efflux zu unterstützen. Ein weiteres Beispiel für ein Ergebnis des Experiments ist in Efflux gezeigt. 2. In diesem Experiment wurden Makrophagen-RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert durch Inkubation über Nacht mit LXR-Agonisten TO-901.317 (Endkonzentration1 mol / L) und Cholesterin Efflux zu der gleichen Probe von menschlichem Plasma (2%) wurde getestet. Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung der zellulären Expression von ABC-Transportern mit LXR-Agonisten die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin zu extrazellulären Akzeptor freizugeben erhöht. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cholesterin Efflux aus THP-1 Zellen auf verschiedene Akzeptoren. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um die angegebene Akzeptor) nach Abzug des Rohlings Werte beschränkt. Mittelwert ± Standardabweichung von Vierfachbestimmungen, * p &lt;0,05. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cholesterin Ausfluß aus RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert mit LXR-Agonisten an menschlichem Plasma. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um dieangegeben Akzeptor) wird nach Abzug der Blindwerte gezeigt. Mittelwert ± SD von Vierfachbestimmungen, * p &lt;0,001.

<ol><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+feedback%3A+from+Schoenheimer%27s+bottle+to+Scap%27s+MELADL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation%3A+basic+concepts+and+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li>
<li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li>
<li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li>
<li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li>
<li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li>
<li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2FFunction+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides%3A+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li>
<li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li>
<li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+%28caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li>
<li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li>
<li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li>
<li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine widerstreitenden Interessen im Zusammenhang mit dieser Studie.

Das beschriebene Verfahren zur Cholesterin-Efflux gemessen wurde entwickelt, um die Bewegung von Cholesterin aus den Zellen zu einer extrazellulären Cholesterin-Akzeptor zu messen. Es gibt einige kritische Überlegungen zum Verständnis dieser Methode. Kennzeichnung und Äquilibrierung In der beschriebenen Methode markierten Cholesterin im Serum enthaltenden Serum zugegeben. Obwohl dies nicht im Detail untersucht, wird angenommen, dass Cholesterin in Serum-Lipoproteine...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien \ Cells </td><td> HeLa </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Komplette Medien </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-Glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% Endothelzellwachstum Ergänzung (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Serum-freie Medien </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 1% L-Glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% Endothelzellen wachsenth Ergänzung (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Passage-Methode </td><td> 1 x Trypsin </td><td> Aufhängung </td><td> Schaben </td><td colspan="3"> 1 x Trypsin </td></tr><tr><td> Durchtrittsverhältnis </td><td> 03.10 </td><td> 01.03 </td><td></td><td> 01.20 </td><td> 01.03 </td><td> 01.03 </td></tr><tr><td> Zell-Aktivierung (optional) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901.317 - LXR-Agonisten - Final konz. 4 uM </td></tr><tr><td> Andere Reagenzien </td><td></td><td> Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) - Zelldifferenzierung - Final konz. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterin efflux-assay

Cholesterol Efflux Assay

Cholesteringehalt von Zellen innerhalb der sehr engen Grenzen gehalten werden, zu viel oder zu wenig Cholesterin in einer Zelle führt zu Störungen von Zellmembranen, Apoptose und Nekrose 1. Die Zellen können Quelle Cholesterin aus intrazellulären Synthese und von Plasma-Lipoproteine ​​sind beide Quellen ausreichend, um Zellen vollständig erfüllen die Anforderungen für Cholesterin. Die Prozesse der Cholesterin-Synthese und die Aufnahme ist streng reguliert und Mängel an Cholesterin sind selten zwei. Übermäßige Cholesterin ist häufiger Problem 3. Mit Ausnahme von Hepatozyten und in gewissem Maße NNR-Zellen, Zellen sind nicht in der Lage, Cholesterin zu degradieren. Die Zellen haben zwei Möglichkeiten, um ihre Cholesterin-Gehalt zu reduzieren: auf Cholesterin in Cholesterylester, eine Option mit begrenzten Kapazitäten zu konvertieren, wie eine Überlastung Zellen mit Cholesterylestern ist auch giftig, und Cholesterin Efflux, eine Option, mit potenziell unbegrenzte Kapazität. Cholesterin Efflux ist ein specific Prozess, der durch eine Reihe von intrazelluläre, wie ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Proteine ​​A1 (ABCA1) und G1 (ABCG1) und Scavenger-Rezeptor des Typs B1 reguliert wird. Die natürliche Akzeptor von Cholesterin im Plasma ist High Density Lipoprotein (HDL) und Apolipoprotein AI. Die Cholesterin-Efflux Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen zu quantifizieren. Es misst die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin Efflux und / oder die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu halten. Der Assay besteht aus den folgenden Schritten. Schritt 1: Markieren zellulärem Cholesterin mit indem markiertem Cholesterin im Serum enthaltenden Medium und Inkubation mit Zellen für 24-48 h. Dieser Schritt kann mit dem Laden der Zellen mit Cholesterin kombiniert werden. Schritt 2: Inkubation der Zellen in einem Serum-freien Medium auf markiertem Cholesterin unter allen intrazellulären Cholesterin-Pools sich ausgleichen lassen. Dieses Stadium kann mit der Aktivierung von zellulären ch kombiniert werdenolesterol Transporter. Schritt 3: Inkubation der Zellen mit der extrazellulären Akzeptor und Quantifizierung der Bewegung des markierten Zellen Cholesterin aus dem Akzeptor. Wenn Cholesterin Vorstufen wurden verwendet, um neu synthetisierte Cholesterin zu kennzeichnen, einen vierten Schritt, Reinigung von Cholesterin, erforderlich sein. Der Test liefert folgende Informationen: (i), wie eine bestimmte Behandlung (eine Mutation, eine Knock-down, eine Überexpression oder eine Behandlung) die Kapazität der Zelle wirkt sich auf Efflux Cholesterin und (ii), wie die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Akzeptoren zu akzeptieren durch eine Krankheit oder eine Behandlung beeinflusst. Diese Methode wird häufig in Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Forschung, metabolische und neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und reproduktiven Erkrankungen eingesetzt.

Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Cholesterin Efflux-Assay

Der Cholesteringehalt der Zellen muss innerhalb sehr eng gesetzter Grenzen aufrechterhalten werden; ein zu hoher oder zu niedriger Cholesterinspiegel in einer Zelle führt zu einer Störung von ...

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Proteoliposomen werden verwendet, um gereinigte Kanäle und Transporter zu untersuchen, die in einer gut definierten biochemischen Umgebung rekonstituiert werden. Ein experimentelles Verfahren zur Messung des durch diese Proteine vermittelten Ausflusses wird veranschaulicht. Die Schritte zur Präparation von Proteoliposomen, zur Durchführung der Aufzeichnungen und zur Analyse der Daten zur quantitativen Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des rekonstituierten Proteins werden beschrieben.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Das Ziel dieser Studie war es, in-vitro- Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen Modulation der Morphologie der Cholesterin-Partikel zu bewerten. Vergleich der Lipidsenker ergab Variationen in ihrer Wirkung Modulation der morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur Messung von LDL-Cholesterin-Aufnahme mit Real-Time Zustrom Raten mit einem live Cell imaging-System in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik bietet eine Plattform die pharmakologische Aktivität von Verbindungen beeinflussen LDL Zustrom während der Überwachung für Zellmorphologie und damit potenzielle Zytotoxizität auf dem Bildschirm.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein Protokoll zum Aufbau eines Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Mikroskops (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorzustellen.

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Darin beschreiben wir die Protokolle zur Messung der Menge an fluoreszierendem Phospholipid, die spezifisch aus Lipidspenderpartikeln durch High-Density-Lipoprotein (HDL) entfernt wird, das im gesamten menschlichen Plasma oder Serum vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass diese Metrik der HDL-Funktionalität das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt.

High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der experimentellen Metastasierung Assay, mit denen die metastatische Potential von humanen Krebszelllinien zu bestimmen.

Experimentelle Metastase Assay

Lernen Sie den Cholesterin-Efflux-Assay zur Quantifizierung des Cholesterintransports aus kultivierten Zellen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Plasmasakzeptoren und liefert Einblicke in den Lipidstoffwechsel für biochemische Forschung.

Cholesterin Efflux-Assay

Weitere Videos entdecken