Name: Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis-Biofilmen an einer Luft-Medium-Grenzfläche und die Bestimmung der Häufigkeit arzneimitteltoleranter Persistenzellen. Diese Methode liefert wichtige Erkenntnisse über die Mechanismen der Arzneimitteltoleranz.

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Die Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung durch die National Institutes of Health und American Lung Association durchgeführt.

1. Wachsende Biofilmen von M. Tuberkulose in einer 250ml-Flasche mit Schraubverschluss gelagert <ol><li> Medien-Herstellung: 0,5 g KH 2 PO 4, 0,5 g MgSO 4, 4g L-Asparagin, 2 g Zitronensäure, 0,05 g Eisenammoniumcitrat, 60ml von Glycerin in 900 ml Wasser. Der pH-Wert mit NaOH auf 7,0. Autoklav, abgekühlt und unmittelbar vor dem Beginn des Versuchs, fügen sterilen ZnSO 4 bis zu einer Endkonzentration von 0,1% w / v. Seit 7000 mc 2 ist ein Pantothenat auxotroph dieser Stamm erfordert auch Pantothensäure bei 10μg/mL der Endkonzentration. </li></ol> Hinweis: Dies ist ein Standard Zusammensetzung Sauton Medien für M. tuberculosis verwendet. Falls erforderlich, wird andere spezielle Vorlagen können auch nach anderen mykobakteriellen Arten verwendet werden. <ol start="2"><li> Zuchtansätze Zubereitung: Grow M. Tuberkulose in 7H9OADC mit 0,05% Tween-80 für eine Woche, oder OD 600 von 0,7 bis 1,0. Die culture können direkt als Inokulum werden bei einer Verdünnung von 1:100 verwendet. </li><li> Dispense 25ml Sauton die Medien zu einer 250ml-Flasche mit Schraubverschluss gelagert Polystyrol (Corning). Fügen Sie 250μl des Inokulums auf das Medium, Kappe der Flasche sehr fest und legen Sie sie ungestört in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C für 3 Wochen. Beachten Sie die Flasche einmal täglich, um sicherzustellen, dass es keine Verschmutzung. </li><li> Am Ende der dritten Woche, lösen Sie den Verschluss der Flasche, um das weitere Wachstum von M. erlauben Tuberkulose an der Grenzfläche. Wenn die Kappe wird in diesem Stadium nicht gelockert dann die unzureichende Sauerstoffkonzentration im Behälter wird weiter verzögern das Wachstum von Bakterien. </li></ol> 2. Wachstum von M. Tuberkulose Biofilmen in 12-Well-Platten <ol><li> Bereiten Sie die Medien und Inokulum von mc 2 7000, wie in A1 und A2 beschrieben. </li><li> Mischen Sie 60 ml Medium mit 600μl des Inokulums. Dispense 4.5mL des Gemisches in jede Vertiefung der Platte. Die Platte mit Deckel. Wickeln Sie die Platte mehrmals mit Parafilm. Die Platte ungestört in befeuchteten Inkubator bei 37 ° C für 5 Wochen. </li></ol> 3. Um die Frequenz des Arzneimittels toleranten persisters in M. Tuberkulose Biofilmen <ol><li> Grow M. Tuberkulose Biofilmen in einer 12-Well Format, wie in Abschnitt B dieser beschriebenen dauert insgesamt ca. 5-Wochen. </li><li> Sobald die Biofilme gereift sind (nach 5 Wochen Inkubation) injizieren Ihre Wahl des Antibiotikums in der gewünschten Konzentration in den Medien unter den Biofilmen mit einer Mikrospitze in einer Pipette. </li></ol> Hinweis: Die Lautstärke der Medien unter den Häutchen reduziert sich auf etwa 3,0 ml. So Ermittler sollte entsprechend berechnen die Menge der Droge. <ol start="3"><li> Strudel die Platte vorsichtig, so dass das Antibiotikum gründlich in dem Medium diffundiert. Für statistisch signifikante Ergebnisse, injizieren die Antibiotiotic in vier Brunnen. Parallel dazu spritzen die gleiche Menge an Lösungsmittel, in dem das Antibiotikum in den anderen vier Brunnen aufgelöst wurde, und lassen Sie die letzten vier Vertiefungen der Platte unberührt. Die Platte mit Deckel und stellte neue Schichten von Parafilm um die Platte herum. Legen Sie sie zurück in den Inkubator für gewünschten Zeitraum. </li><li> Am Ende der Inkubation zu öffnen und die Platte hinzuzufügen Tween-80 bis zu einer Endkonzentration von 0,1% (Volumen / Volumen) in jeder der Vertiefungen. Schwenken Sie die ganze Platte für eine gleichmäßige Verteilung sanft des Waschmittels. Anschließend wird die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Mischen Sie den Inhalt jedes Wells mit Pipette mehrmals, so dass gesamte Inhalt gleichmäßig auf eine 15 ml konische Röhrchen übertragen werden können. </li><li> Anzentrifugieren den Inhalt des Rohrs bei 4000rpm für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Das Pellet in 5 ml frischem Waschpuffer (PBS mit 10% Glycerin und 0,05% Tween-80). Wiederholen Sie die dreimaligem Waschen. Das Pellet in 5 ml Waschpuffer. Halten Sie es auf der Wippe für overnight bei 4 ° C </li></ol> Hinweis: Obwohl niedrige Temperatur wurde ursprünglich für M. smegmatis (um sein Wachstum während der Dispersion zu minimieren) entwickelt und verwendet für M. tuberculosis als auch die langsam wachsenden Arten können am ehesten bei Raumtemperatur ohne Einfluss auf Ergebnis geschaukelt zu werden. Rocking bei Raumtemperatur könnte notwendig sein, wenn Arbeiten im BSL-3-Anlage. <ol start="6"><li> Bereiten Sie eine sterile Spritze mit Mikrospitze (2-200 ul) durch Abschneiden seiner breiten Ende auf die entsprechende Größe, passend sie auf die Spritze und wickelte sie mit Parafilm versehen. Führen Sie den gesamten Inhalt des Rohres durch die Spitze montierten Spritze und sammeln sich in einem frischen 15 ml Tuben. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 bis 6 mal, bis du eine ziemlich homogene Suspension zu beobachten. </li><li> Verdünnungsreihe der Suspension und die Platte Verdünnungen auf 7H11OADC Platte, um die Anzahl der lebensfähigen Kolonien in jeder Vertiefung zu bestimmen. Die Inkubation erfolgt für drei Wochen in 37 ° C Inkubator. Bestimmen Sie die Frequenzcy der persisters im Biofilm Bevölkerung durch Berechnen des Verhältnisses der Anzahl der Kolonien in der Antibiotika behandelt, um die auf Lösungsmittel behandelt Platten erhalten werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn in einer Flasche kultiviert, das Wachstum von M. Tuberkulose kann an der Basis der Flasche bis zum Ende der ersten Woche zu sehen. Am Ende der zweiten Woche, kann lückenhaft Wachstum von Bakterien auf der Luft-Media-Schnittstelle erkannt, obwohl das Wachstum an der Luft-Medium-Schnittstelle ist konsistent sichtbar am Ende der dritten Woche (1A). Zu diesem Zeitpunkt die Anlagerung der Bakterien an der Wand des Behälters beobachtet. Von diesem Punkt an das Wachstum der Kultur tritt vor allem auf die Luft-media-Schnittstelle. Die Flüssigkeit unter der Oberfläche Wachstum ist klar. Typischerweise reift der Struktur am Ende der fünften Woche (1B). Wenn Inkubation verlängert wird, werden die Strukturen beginnen, auf den Boden des Behälters sinken. InteressanterweiseAnziehen der Kappe bis zum Ende der dritten Woche ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, und aus unbekannten Gründen eine lose-verschlossenen Flasche erheblich verzögert Initiierung des Wachstums auf die Schnittstelle 9. In der 12-Well-Format wird ein robuster Biofilm an der Luft-Media-Schnittstelle in jeder der Vertiefungen am Ende von fünf Wochen (2A) gesehen. Wenn die Platten nicht vollständig eingewickelt dann Differential Biofilmwachstum beobachtet wird. Im schlimmsten Fall kann bedeutende Medien Verdampfen Strömungsabriss das Wachstum der Bakterien (Fig. 2B). So Einwickeln der Platte ist notwendig, sowohl um die Verdunstung zu verhindern sowie zu Umwelt für die Biofilmbildung (siehe vorigen Absatz) zu schaffen. Die Zahl der lebensfähigen Bazillen in Biofilmen mit dieser Technik bestimmt ist ziemlich reproduzierbar. Antwort von M. Tuberkulose Biofilme hängt von der Art der Antibiotika. Für eine bakterizide Antibiotika wie Rifampicin, folgt ein Verlust der Lebensfähigkeit bipha<html> sic Trend 9. Ein rascher Rückgang der Rentabilität in den ersten drei bis vier Tagen durch eine anhaltende Phase, in der ein kleiner Prozentsatz der Bevölkerung bleiben völlig widerspenstig gegen Antibiotika unabhängig von der Konzentration des Antibiotikums oder der Zeitpunkt der Exposition gefolgt. Abbildung 3 zeigt die Anzahl der lebensfähigen Bazillen in reife Biofilme nach einer 7-tägigen Exposition gegenüber 50μg/mL (50 mal höher als die MHK) von Rifampicin. <img alt="1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> 1A. Frühe Auftreten von M. Tuberkelbazillen auf dem Luft-Media-Interface von Bakterien nach 3 Wochen Inkubationszeit. <img alt="Abbildung 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> Abbildung 1B. Gereift Biofilmen von M. Tuberkulose auf dem Luft-Media-Schnittstelle nach fünf Wochen der Inkubation. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; 2A. 5-Wochen alte Biofilme von M. Tuberkulose in 12-Well-Format entwickelt. <img alt="2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> 2B. Ein gescheiterter Versuch, M. tuberculosis Biofilmen in 12-Well-Platte wachsen, ohne Parafilm. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Vertreter Diagramm, das die Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters in M. Tuberkulose Biofilme wachsen in 12-Well-Format und ausgesetzte von Rifampicin für sieben Tage 50μg/mL.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Tuberkulose (TB), durch die Infektion von Mycobacterium tuberculosis verursacht wird, bleibt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit. Fast ein Drittel der Weltbevölkerung schätzungsweise asymptomatisch durch den Erreger infiziert werden, zeigen etwa 9 Millionen neue Fälle in Klinik jedes Jahr mit den Symptomen einer aktiven TB und rund 1,7 Millionen sterben an der Infektion jedes Jahr 11. Die enorme Belastung der Krankheit ist in erster Linie durch einen Mangel an einem Impfstoff ...

<table><tbody><tr><td>Brutschrank</td><td>VWR international</td><td>Modell # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Kulturgefäße aus Polystyrol</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>12-Loch-Gewebekulturplatte</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Konische 50-mL-Röhrchen</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographiekühlschrank</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schale</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobasisch)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eisensulfat-Ammoniumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantothensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Brühe</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC-Anreicherung</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>250-mL-Lagervorratsflasche</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>12-Loch-Platten</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>10-mL-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>1–200&amp;mu;L-Pipettenspitzen</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Difco Mycobacteria 7H11 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibasisch)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

wachstum von mycobacterium tuberculosis biofilme

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, hat eine außerordentliche Fähigkeit, gegen Umweltbelastungen einschließlich Antibiotika überleben. Obwohl Stresstoleranz von M. Tuberkulose ist eine der wahrscheinlich Mitwirkenden an den 6-monatigen Chemotherapie der Tuberkulose ein, bleiben die molekularen Mechanismen dieser charakteristischen Phänotyp des Erregers unklar. Viele mikrobielle Spezies entwickelt haben, um in stark beanspruchenden Umgebungen von sich selbst organisierenden überleben in hoch organisierten, Oberfläche angebracht und Matrix eingekapselt Strukturen, so genannte Biofilme 2-4. Das Wachstum in den Gemeinden scheint eine bevorzugte Überlebensstrategie von Mikroben sein, und wird durch genetische Komponenten, die Oberfläche Befestigung, interzelluläre Kommunikation, und die Synthese von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 5,6 Regulierung erreicht. Die Toleranz gegenüber widrigen Umweltbedingungen wird wahrscheinlich durch EPS erleichtert, und vielleicht durch die physiogische Anpassung einzelner Bazillen auf heterogene Mikroumgebung innerhalb der komplexen Architektur von Biofilmen 7. In einer Reihe von neueren Arbeiten haben wir festgestellt, dass M. tuberculosis und Mycobacterium smegmatis haben eine starke Neigung, in organisierten vielzelligen Strukturen wachsen genannten Biofilmen, die vertragen mehr als 50 Mal können die minimalen Hemmkonzentrationen der Anti-Tuberkulose-Medikamente Isoniazid und Rifampicin 10.08. M. Tuberkulose, aber faszinierend erfordert spezielle Bedingungen, um reife Biofilme, insbesondere 9:1-Verhältnis von Headspace bilden: Medien sowie eingeschränkte Luftaustausch mit der Atmosphäre 9. Bedarf an spezialisierten Umweltbedingungen könnte möglicherweise auf die Tatsache, dass M. verknüpft werden Tuberkulose ist ein obligat humanpathogene und damit hat sich um Gewebe-Umgebungen angepasst. In dieser Veröffentlichung zeigen wir Methoden zur Kultivierung von M. TuberkuloseBiofilme in einer Flasche und einer 12-Well-Platte-Format, die bequem für bakteriologische sowie genetische Studien ist. Wir haben das Protokoll eines abgeschwächten Stamm von M. beschriebenen Tuberkulose, mc 2 7000, mit einer Deletion in den zwei Loci, panCD und RD1, die kritisch für die in vivo das Wachstum des Erregers 9 sind. Dieser Stamm kann sicher in einer BSL-2 Containment werden für das Verständnis der biologischen Grundlagen der Tuberkulose-Erreger wodurch die Anforderung eines teuren BSL-3-Anlage verwendet. Die Methode kann erweitert werden, mit entsprechenden Modifikationen in den Medien, um Biofilm von anderen kultivierbaren Mykobakterien wachsen. Insgesamt wird ein einheitliches Protokoll zur Kultivierung von Mykobakterien Biofilmen helfen den Ermittlern bei der Untersuchung der grundlegenden elastischen Eigenschaften von Mykobakterien interessiert. Darüber hinaus wird eine klare und präzise Verfahren zur Züchtung von Mykobakterien Biofilme auch helfen, die klinische und pharmazeutische investigators zur Prüfung der Wirksamkeit eines potentiellen Arzneimittels.

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der menschlichen Tuberkulose, besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, Umweltstressoren zu überstehen, einschließlich ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Kultivierung von M. tuberculosis-Biofilmen an der Luft-Medium-Grenzfläche zu demonstrieren und die Häufigkeit von arzneimittelresistenten Bakterien in diesen Biofilmen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das geeignete Medium und die Inokula vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, M. tuberculosis-Biofilme in 12-Loch-Platten zu kultivieren.Dann wird ein Testantibiotikum in einer gewünschten Konzentration zugegeben, und die Häufigkeit der medikamententoleranten Persistierenden wird bestimmt. Bei M. tuberculosis können Biofilme nachgewiesen werden. Letztendlich kann die Technik genutzt werden, um die Grundlagen der Biofilmbildung zu verstehen und die Mechanismen der Medikamententoleranz bei M. tuberculosis aufzuklären. Der Hauptvorteil des in vitro-Biofilmwachstums von Mycobacterium tuberculosis in detergentfreiem Medium liegt darin, dass das spontane Wachstum der komplexen, mehrzelligen Architektur einzigartige Eigenschaften des Organismus offenbart, die in planktischen Kulturen nicht zu beobachten sind.Dazu gehören die Oberflächenanheftung, zelluläre Wechselwirkungen, die Synthese einer zusätzlichen Matrix sowie die physiologische Anpassung innerhalb des heterogenen Mikromilieus dieser Struktur. Wichtig ist, dass diese Informationen für das Verständnis der Grundlagen der Persistenz von *M. tuberculosis* in bestimmten spezialisierten Nischen wie Kavitäten hochgradig relevant sein werden, wo ein exuberantes Wachstum von Bazillen in einem zusätzlichen Milieu innerhalb multizellulärer Strukturen wahrscheinlich ist. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf eine verkürzte Therapie der Tuberkulose, da die Identifizierung und gezielte Beeinflussung von mit Biofilmen assoziierten Faktoren die Häufigkeit von drogentoleranten Teilpopulationen in Biofilmen verringern könnte.In diesem Protokoll wird eine Standardzusammensetzung von Soans-Medium verwendet, um M. tuberculosis anzuzüchten. Bei der Kultivierung von Biofilmen anderer mykobakterieller Spezies hingegen sind deren jeweils spezifische, geeignete Medien zu verwenden. Bereiten Sie den primären Inokulum von M. tuberculosis in 125-Milliliter-Kunststoffflaschen mit 15 Milliliter flüssigem Medium vor.Zwischen 80 Wachstum. Die Kulturen unter Standardbedingungen, bis ihre OD 600 zwischen 0,7 und 1,0 liegt, was etwa eine Woche dauert. Bei dieser Dichte kann die Kultur direkt als Inokulum in einer Verdünnung von eins zu 100 verwendet werden. Nachdem das Inokulum vorbereitet ist, fügen Sie 600 Mikroliter zu 60 Milliliter Sawtons-Medium hinzu.Nachdem das Inokulum vorsichtig in das Medium eingemischt wurde, je 4,5 Milliliter der Mischung in jedes der 12&nbsp;Vertiefungen einer Platte gegeben, die Platte abgedeckt und mehrmals mit Parafilm umwickelt. Anschließend wird die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37&nbsp;Grad Celsius inkubiert.Nach fünf Wochen ungestörten Wachstums mit der Untersuchung auf die gegenüber Medikamenten toleranten Persistierenden fortfahren. Nach fünf Wochen Reifung hat sich das Mediumvolumen auf etwa drei Milliliter pro Vertiefung über vier Vertiefungen reduziert. Ein Antibiotikum der Wahl unterhalb des Biofilms in das Medium injizieren.Vier weitere Vertiefungen sollten allein mit dem Lösungsmittel beimpft und die letzten vier Vertiefungen unberührt gelassen werden. Dies gewährleistet statistische Aussagekraft, und die entsprechenden Kontrollen sorgen dafür, dass die Platte sanft angeschwollen wird, sodass das Antibiotikum sich vollständig im Medium verteilt. Decken Sie die Platte nun ab.Legen Sie frische Schichten aus Paraform um die Platte und inkubieren Sie die Platte je nach Experiment zwischen ein und sieben Tagen. Am Ende der Inkubation geben Sie Tween 80 zu jeder Vertiefung hinzu. Schwenken Sie die gesamte Platte vorsichtig, um das Dispersionsmittel gleichmäßig zu verteilen.Anschließend die Platte 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 15 Minuten den Inhalt jedes Wells mit einer Pipette so lange mischen, bis eine einheitliche Lösung vorliegt. Danach die Kultur in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Zentrifugieren Sie das kegelförmige Reagenzglas und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter frischem Waschpuffer, zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie. Wiederholen Sie das Aufschwemmen der Zellen in Waschpuffer noch dreimal.Anschließend die Zellen über Nacht in Waschpuffer auf einem Schüttler im Kühlschrank belassen. Obwohl die niedrige Temperatur ursprünglich für EMS-magmatische Zwecke entwickelt wurde, um das Wachstum während der Dispersion und Verwendung für M tuberculosis zu minimieren. Die langsam wachsenden Arten können höchstwahrscheinlich bei Raumtemperatur geschüttelt werden, ohne dass dies Auswirkungen auf die Ergebnisse hat.Das Schütteln bei Raumtemperatur könnte notwendig sein, wenn in einer BSL-3-Anlage gearbeitet wird. Bereiten Sie am nächsten Tag eine Spritze zur Homogenisierung und Übertragung vor. Passen Sie für jede Suspension eine Mikropipettenspitze an eine sterile Spritze an. Schneiden Sie das breite Ende der Spitze auf die passende Größe zu, verbinden Sie sie mit der Spritze und umwickeln Sie die Verbindung mit Parafilm.Die gekühlte Zellsuspension durch eine mit einer Spitze ausgestattete Spritze geben und das Volumen in ein sauberes 15-Milliliter-Konischgefäß abgeben. Diesen Schritt fünf bis sechs Mal wiederholen, wobei das Gefäß kontinuierlich ausgetauscht wird, bis die Suspension sehr homogen erscheint. Bereiten Sie nun serielle Verdünnungen jeder Suspension vor und impfen Sie jeweils eine Verdünnung auf eine Agarplatte aus.Nach einer dreiwöchigen Inkubation der Platten ermitteln Sie die Häufigkeit von Persistern in der Biofilmpopulation, indem Sie die Anzahl der Kolonien auf den mit Antibiotika behandelten Platten mit der auf den Kontrollplatten vergleichen. Beim Kultivieren in einer Flasche wuchs M tuberculosis in der ersten Woche am Boden der Flasche.Am Ende der zweiten Woche zeigte sich ein fleckiger Bakterienwuchs an der Luft-Medium-Grenzfläche, der am Ende der dritten Woche noch deutlicher sichtbar wurde. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass die Bakterien an der Wand des Behälters anhafteten, und das Wachstum der Kultur erfolgte hauptsächlich an der Luft-Medium-Grenzfläche. Die Flüssigkeit unterhalb des oberflächennahen Wachstums war klar.Am Ende der fünften Woche war die Struktur vollständig ausgereift. In einem 12-Loch-Format nach fünfwöchiger Inkubation war in jedem Loch von Platten, die nicht vollständig umhüllt waren, ein stabiler Biofilm an der Luft-Medium-Grenzfläche sichtbar. Es wurde differenzielles Biofilmwachstum sowie eine signifikante Mediumsverdunstung beobachtet.Das bakterielle Wachstum auf diesen Platten war zum Stillstand gekommen. Die Anzahl lebensfähiger Bazillen in Biofilmen war recht reproduzierbar und variierte je nach verwendetem Antibiotikum. Beispielsweise führte Rifampicin, ein bakterizides Antibiotikum, zu einem raschen Rückgang der Lebensfähigkeit während der ersten drei bis vier Tage, dem eine persistierende Phase folgte, in der ein kleiner Prozentsatz der Population gegenüber Antibiotika völlig resistent blieb, unabhängig von der Konzentration des Antibiotikums oder der Dauer der Exposition.Das gleiche Verfahren kann bei der Untersuchung von Mutanten eingesetzt werden, um Gene zu identifizieren, die an der Anheftung von Mycobacterium tuberculosis an die Biofilmoberfläche, am bakteriellen Wachstum an der Grenzfläche sowie an der Reifung von Pecos beteiligt sind. Beachten Sie, dass die Arbeit mit M. tuberculosis äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer Sicherheitsstufe 3 gemäß Biosicherheitsrichtlinien zu beachten sind, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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