Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens war die Entwicklung eines Mikrotiterplatten-Assays, der die Aktivität eines Gerinnungsproteinfaktors V während der Bildung eines Fibringerinnsels im menschlichen Plasma misst. Als Reaktion auf eine Verletzung wird der Blutgerinnungsprozess aktiviert und führt zu einer Reihe von Xymogen-zu-Protease-Umwandlungsreaktionen, die schließlich zur Bildung des Gerinnungsenzyms Thrombin führen, das lösliche Fibrinogen zu Fibrinmonomeren, die sich dann zu einem unlöslichen Fibringerinnsel verbinden. Normalerweise verbleibt das Blut im gesunden oder unverletzten Zustand als frei fließende Flüssigkeit, und die Menge des gebildeten Fibrins entspricht der Menge an abgebautem oder abgebautem Fibrin.

In bestimmten Krankheitssituationen führt jedoch eine zu hohe Gerinnung zu Herzerkrankungen und Schlaganfällen, während eine zu geringe Gerinnung zu Blutungsneigung führt, die häufig bei den Hämophilien zu beobachten ist. Faktor V ist ein Protein im Plasma, das in seiner aktivierten Form Faktor fünf A ein kritischer Beschleuniger der Thrombinbildung während der Bildung von Fibringinneln ist. Als Teil des Prothrombin-Enzymkomplexes besteht Prothrombin aus vier Komponenten Faktor 10 A, dem Proteasefaktor fünf A, dem Co-Faktor Lipid, der Oberfläche und Kalzium. Der Melinefaktor fünf A erhöht die katalytische Effizienz oder kcat des Faktors 10 A gegenüber seinem Substrat Prothrombin um etwa das 3000-fache, wodurch die Thrombinbildung und die Bildung von Fibringinneln tiefgreifend verbessert werden.

Die Mikrotiterplatten-Plattform wird aufgrund der Bequemlichkeit, des Zeitaufwands, der kleinen Probenvolumina, der kontinuierlichen Überwachung und des hohen Durchsatzes für die Messung enzymkatalysierter Ereignisse bevorzugt. Die Bildung von Fibringerinnseln kann mit einem Mikroplatten-Reader überwacht werden, indem die Zunahme der Lichtabsorption von Plasma gemessen wird, wenn es von einem klaren gelben Erscheinungsbild ohne Fibringerinnsel und minimaler Lichtabsorption zu einem undurchsichtigen, trüben Erscheinungsbild mit einem Fibringerinnsel und maximaler Lichtabsorption wechselt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie manuellen Kippröhrchen-Assays oder Assays mit automatisierten Analysatoren besteht darin, dass die Methode schnell und kostengünstig ist, geringe Anforderungen an das Probenvolumen stellt und einen hohen Durchsatz aufweist.

Der Assay misst die Aktivität des unbeabsichtigt aktivierten und Thrombin-aktivierten Faktors fünf, um eine vollständige quantitative Bewertung seiner gesamten funktionellen Aktivität zu erhalten. Derek Tilley, ein Meisterschüler im Labor, wird diese Technik vorführen. Um die Faktor-Fünf-Aktivität in einer Plasmaprobe zu messen, ist es notwendig, die einstufige Aktivität des Faktors Fünf, die Standardkurven des Zeitpunkts der Fibringerinnselbildung in Panel A und die Anfangsrate der Fibringerinnselbildung in Panel B unter Verwendung von normalem humanem Plasma oder NHP als Standard zu konstruieren, der definitionsgemäß eine Einheit der Faktor-Fünf-Aktivität pro ML enthält, um das Faktor-Fünf-defiziente Plasma aufzutauen. normales menschliches Plasma und Probe von unbekanntem Plasma und Thromboplastin bei 37 Grad für 10 Minuten.

Mischen Sie den Plasmatransfer mit Faktor fünf-Mangel und die Thromboplastik vorsichtig in separate Kunststoffwaschschalen und inkubieren Sie auf Eis. Lagern Sie das normale menschliche Plasma und die Probenplasma-Unbekannten nach dem schonenden Mischen auf Eis. Lagern Sie das Calciumchlorid 25 Millimolar in destilliertem Wasser in einer separaten Waschschale bei Raumtemperatur für den Faktor fünf einstufige Aktivitätsstandardkurven.

Bereiten Sie jeweils 200 Mikroliter zweifacher serieller Verdünnung von normalem menschlichem Plasma aus 0 2 4 8 16 32 64, 1 28, 2 56 und 512 fach in HBS pH 7,4 mit 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, wirbeln Sie es gut durch und inkubieren Sie es auf Eis. Bereiten Sie für die unbekannten Plasmaproben jeweils 200 Mikroliter mit 40-facher Verdünnung von normalem menschlichem Plasma und unbekannten Probenplasmen in HBS pH 7,4 unter Verwendung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Legen Sie fünf Mikrotiter-Streifen in den Schablonenhalter des Mikroplatten-Readers.

Schalten Sie den Mikroplatten-Reader ein und greifen Sie mit einer Mehrkanalpipette auf die Softmax Pro-Mikroplatten-Anwendungssoftware zu. Gleichzeitige Zugabe von 50 Mikrolitern Faktor-Fünf-defizientem Plasma zu allen Proben-Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit einer einzigen Pipette, 50 Mikroliter der vorbereiteten 10 seriellen Verdünnungen von normalem menschlichem Plasma und die 40-fachen Verdünnungen von normalem menschlichem Plasma und Probenplasma-Unbekannten zu trennenden MICROPLATE-Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen, 50 Mikroliter Thromboplastik in alle Probenvertiefungen geben. Inkubieren Sie im Mikroplatten-Reader eine Minute lang bei 25 Grad Celsius und schütteln Sie während der 15 bis 25 Sekunden der einminütigen Inkubation.

Über den Computer, der mit dem MICROPLATE-Lesegerät verbunden ist, greifen Sie auf die Softmax Pro Microplate-Anwendungssoftware zu. Stellen Sie den Mikroplatten-Reader auf eine Absorptionswellenlänge bis 405 Nanometer, einen Modus auf eine kinetische Temperatur auf 25 Grad Celsius ein und programmieren Sie den Mikroplatten-Reader so, dass er in den ersten fünf Sekunden nach der Zugabe von Kalziumchlorid schüttelt und die Absorption bei 405 Nanometern sechs Minuten lang alle fünf Sekunden misst. Danach ist das Fünf-Sekunden-Schüttelintervall nicht in den berechneten Gerinnselzeiten enthalten, indem zwei Mehrkanalpipetten gleichzeitig 50 Mikroliter Calciumchlorid zu den beiden Mikrotiterplattenstreifen mit Proben hinzufügen.

Warten Sie 15 Sekunden und drücken Sie sofort auf das Startsymbol in Softmax Pro vom Computer aus, um den Assay zu starten. Für jede analysierte Plasmaprobe wird die Zeit der Gerinnselbildung bestimmt und als die Zeit in Sekunden definiert, um die halbmaximale Erhöhung der Absorption zu erreichen. Die anfängliche Rate der Gerinnselbildung ist definiert als die Rate der Zunahme der Absorption über die ersten fünf Zeitpunkte des linearen Teils der Zunahme der Absorption über die Zeit.

Das Ausmaß der Gerinnselbildung ist definiert als die Differenz zwischen der maximalen und minimalen Absorption, die während der Gerinnselbildung am Ende des Laufs erreicht wird. Verwenden Sie die ABSORPTIONS-Zeit-Profile in Softmax Pro, um den Zeitpunkt, die Anfangsrate und das Ausmaß der Gerinnselbildung für die serielle Verdünnung von normalem menschlichem Plasma zu bestimmen. Um die einstufigen Aktivitätsstandardkurven für Faktor V zu konstruieren, verwenden Sie die Gerinnungszeiten für das 40-fach verdünnte normale menschliche Plasma und Probenplasma-Unbekannte, um die Aktivität des Faktors fünf in Einheiten pro Mille aus der einstufigen Aktivitätsstandardkurve des Faktors fünf zu interpolieren.

Dies stellt den Faktor fünf dar, eine einstufige Aktivität oder die ohne absichtliche Aktivierung durch Thrombin. Dies ist ein repräsentatives Beispiel für die Bildung von Fibringerinnseln im Faktor-Fünf-Assay im Laufe der Zeit, der vom Mikroplatten-Reader erzeugt wird. Das Profil stellt die Bildung von Fibringerinnseln unter Verwendung von 32-fach verdünntem normalem menschlichem Plasma in einer einzigen Mikroplatte dar.

Nun, die vertikale Achse bezeichnet die Änderung des Absorptionsmittels bei 405 Nanometern, die als Folge der Bildung von Fibringerinnseln aufgetreten ist. Die Zeit der Gerinnselbildung wurde als Mittelpunkt der Absorptions-Zeit-Kurve von 36,4 Sekunden berechnet. Die anfängliche Rate der Gerinnselbildung wurde mit 611,88 Millieinheiten pro Minute berechnet.

Das Ausmaß der Wolkenbildung wurde mit 0,35 Einheiten berechnet. Der Faktor-Fünf-Assay misst genau die Anfangszeit und das Ausmaß der Wolkenbildung. Die Inspektion der Bohrlöcher nach Abschluss der Analyse bestätigte, dass es zu einer Gerinnselbildung kam.

Alle Reaktionen erreichten ungefähr das gleiche Ausmaß der CloudFormation mit einer allgemeinen Änderung der Extinktion bei 405 Nanometern zwischen 0,35 und 0,45 Einheiten zwischen der anfänglichen Absorption vor und der maximalen Absorption nach Thromboplastik und Calciumchlorid. Hinzu kommen repräsentative Beispiele für die einstufige Aktivität des Faktors fünf, die Standardkurve der Gerinnselzeit in Sekunden gegenüber der Aktivität des Faktors fünf in Einheiten pro Mil und die anfängliche Rate der Klauenbildung in Millieinheiten pro Minute gegenüber dem Faktor fünf. Die Aktivität in Einheiten pro mille für normales menschliches Plasma ist in Feld A bzw. Feld B dargestellt.

Da Faktor fünf normalerweise mit Thrombin aktiviert wird. Der aktive Co-Faktor Faktor fünf A ein zweiter Assay nach Zugabe und Inkubation mit Thrombin ist entscheidend für die genaue Messung der zweistufigen Aktivität des Faktors fünf einer Plasmaprobe mit absichtlicher Aktivierung durch zugesetztes Thrombin für den zweistufigen Faktor-Assay. Bereiten Sie 200 bis 300 Mikroliter gereinigtes Thrombin in seiner Endkonzentration von hundert Nanomolaren in HBS pH 7,4 vor und inkubieren Sie auf Eis, verdünnen Sie 120 Mikroliter des über dem normalen menschlichen Plasma und probieren Sie Plasmen vom 40- bis 100-fachen mit 170 Mikrolitern HBS pH 7,4, die 2,8 Millimolar enthalten.

Calciumchlorid. Fügen Sie 10 Mikroliter Thrombin hinzu, um eine Endkonzentration von 10 nanomolaren zu jeder Probe zu erreichen. Wirbel. Gut zum Mischen und Inkubieren bei 37 Grad Eine Minute lang das normale menschliche Plasma und die Probenplasmen auf das 500-fache verdünnen, indem Sie 400 Mikroliter HBS pH 7,4 hinzufügen.

Bestimmen Sie die Gerinnselzeit für normales menschliches Plasma in jedem der Proben-Plasma-Unbekannten-Assays aus den Absorptions-Zeit-Profilen in soft max Pro. Unter Berücksichtigung der 500-fachen Verdünnung verwenden Sie die Gerinnselzeit für jede Probe, um die zweistufige Aktivität des Faktors fünf aus der einstufigen Standardkurve des Faktors fünf der Gerinnselzeit gegenüber der Aktivität zu berechnen. Dies stellt die zweistufige Aktivität des Faktors fünf dar oder die mit absichtlicher Aktivierung durch Thrombin.

Die Gesamtaktivität des Faktors fünf kann dann berechnet werden als der Faktor fünf zweistufige Aktivität abzüglich des Faktors fünf einstufige Aktivität. Die Standardkurve der logarithmischen Gerinnselzeit im Vergleich zur logarithmischen Faktor-Fünf-Aktivität wurde verwendet, um die Faktor-Fünf-Aktivität in normalem menschlichem Plasma und in Plasmen von neun Patienten mit disseminierter intravaskulärer Gerinnung oder DIC, alle neun DIC-Patienten, zu messen. Es zeigte sich eine einstufige Aktivität des Faktors fünf und die anfänglichen Raten der Gerinnselbildung, die im Durchschnitt um 54 und 18 % verringert waren. Die zweistufige Aktivität des Faktors fünf und die Gesamtaktivität waren bei den DIC-Patienten im Durchschnitt um 44 und 42 % im Vergleich zum normalen menschlichen Plasma verringert.

Der Faktor fünf und die DIC-Patienten führten zu einer verlängerten Zeit und einer verringerten Rate der Bildung von Fasergerinnseln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie diese Methode in Ihrem Labor umsetzen können. Die Methode kann leicht angepasst werden, um die Aktivität eines beliebigen Gerinnungsfaktors im Plasma zu messen, wodurch sie für ein breites Spektrum von Forschungs- und klinischen Anwendungen geeignet ist.

Letztendlich werden sich diese Informationen über Faktor V positiv auf das Gesundheitswesen auswirken, indem thrombotische oder blutende Erkrankungen wie DIC früher diagnostiziert und behandelt werden.