Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Zellen für eine Mikroarray-basierte Transkriptomanalyse zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Retina aus dem umgebenden Gewebe herauspräpariert und anschließend in Einzelzellen dissoziiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, einzelne Zellen zu gewinnen und in PCR-Röhrchen mit Lysepuffer einzubringen.

Dann werden die Zellen lysiert und die cDNA mittels reverser Transkription amplifiziert, gefolgt von der Polymerase-Kettenreaktion. Schließlich wird die Hybridisierung der einzelnen Zell-cDNA auf einem AiMatrix-Microarray verwendet, um die in einer einzelnen Zelle exprimierten mRNA-Moleküle nachzuweisen. Der Hauptvorteil der Profilierung der Genexpression in Einzelzellen im Vergleich zu Ansätzen mit gesamtem Gewebe liegt darin, dass die Isolierung einzelner Zellen den Zugang zu sehr kleinen Zellpopulationen ermöglicht, die einen Teil des gesamten Gewebes bilden würden.

Diese Zellen können alles sein, von verschiedenen Arten von Neuronen bis hin zu kleinen Populationen von Stammzellen. Die Einzelzelltechnik ermöglicht es uns, sowohl die Zelltypen als auch spezifische Marker für diese kleinen Zellpopulationen zu identifizieren und Gen-Netzwerke zu bestimmen, die in diesen äußerst seltenen Zellsubgruppen exprimiert werden. Zusätzlich erlaubt die Einzelzell-Profilierungstechnik die Identifizierung von Gen-Netzwerken, die während sehr dynamischer Entwicklungsübergänge vorübergehend in sehr kleinen Zellsubgruppen exprimiert werden.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise wann Vorläuferzellen beginnen, Gen-Netzwerke zu exprimieren, die mit der Differenzierung assoziiert sind, und wie sich diese Vorläuferzellen voneinander unterscheiden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu zellulären Therapien bei neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Glaukom, denn indem wir die entscheidenden Netzwerke bei der Entwicklung einzelner Zellen aufklären, kommen wir einen Schritt näher daran, solche Zellen für den Einsatz in der zellulären Ersatztherapie erzeugen zu können. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Mausretina in eine Schale geben, die mit PBS gefüllt ist.

Entfernen Sie anschließend den Glaskörper und die Linse. Danach wird das gesamte retinale Pigmentepithel entfernt. Inkubieren Sie die Retina in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.

Anschließend vorsichtig das Röhrchen antippen, um eventuell angesetzte Zellen zu lösen. Dann vorsichtig 10 bis 20 Mal mit einer P-1000-Pipette auf- und abpipettieren. Wenn große Gewebeklumpen verbleiben, weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und erneut 10 bis 20 Mal auf- und abpipettieren.

Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter DNA, eine mit einer Konzentration von 10 Einheiten pro Mikroliter, zur Netzhaut hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Vortexen Sie die Probe vorsichtig bei Raumtemperatur erneut mit dem P1000-Pipettiergerät weitere 10 bis 20 Mal. Zentrifugieren Sie sie anschließend drei Minuten bei 3000 U/min.

Entfernen Sie dann den Überstand und lassen Sie 100 bis 200 Mikroliter Flüssigkeit am Boden zurück. Klopfen Sie das Röhrchen leicht an, um das Pellet zu lösen. Fügen Sie anschließend ein Milliliter HBSS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Schwenken.

Zentrifugieren Sie es bei 3000 U/min für drei Minuten. Entfernen Sie danach vorsichtig den Überstand. Anschließend resuspendieren Sie es im folgenden Schritt in 450 Mikrolitern PBS, die 0,1 % BSA enthalten, und bereiten Sie zwei Sechs-Zentimeter-Schalen vor, die jeweils fünf Milliliter PBS mit 0,1 % BSA enthalten.

Als Nächstes plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf eine Petrischale. Lassen Sie die Zellen mindestens fünf Minuten lang sedimentieren. Danach stellen Sie die Schale mit den dissoziierten Zellen unter ein inverses Mikroskop.

Verwenden Sie eine Pipette mit feiner Spitze und einer Absaugvorrichtung, um eine einzelne Zelle zu gewinnen. Bringen Sie dann die Mikropipette nahe an die Zelle heran, sodass diese leicht durch Kapillarwirkung in die Mikropipette eindringt. Danach geben Sie die Zelle auf eine zweite Petrischale ab und stellen sicher, dass nur eine einzige Zelle zur Genexpressionsanalyse gewonnen wird.

Dies erfolgt entweder durch Entfernen überflüssiger Zellen oder durch Verlegen der Zelle von Interesse an eine andere Stelle mit einer neuen Mikropipette. Wenn eine einzelne Zelle vollständig von den benachbarten Zellen isoliert ist, verwenden Sie eine neue Mikropipette, um die Zelle von Interesse aufzusaugen. Danach geben Sie sie direkt in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen, das 4,5 Mikroliter Zelllysepuffer enthält.

Zentrifugieren Sie die Probe kurz in einer Mikrozentrifuge, um die Zelle in Puffer zur Zelllyse einzutauchen. Führen Sie diesen Schritt nach jeder fünften Zelle und erneut am Ende der Sammlung durch. Denken Sie daran, das Röhrchen während der gesamten Einzelzell-Isolation auf Eis zu halten, und sammeln Sie die Einzelzellen innerhalb eines Zeitfensters von zwei Stunden nach der Dissoziation, um optimale Ergebnisse in diesem Verfahren zu erzielen. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend kurz in einer Mikrozentrifuge, um sicherzustellen, dass die Einzelzelle vollständig in Puffer zur Zelllyse eingetaucht ist.

Um die Zelllyse zu fördern, inkubieren Sie die Probe 90 Sekunden lang bei 70 Grad Celsius in einem Thermocycler. Danach stellen Sie das Röhrchen sofort für zwei Minuten auf Eis. Um die Reverse Transkription durchzuführen, geben Sie 0,33 µL hinzu.

Hochgestellte Drei mit 200 Einheiten pro Mikroliter, 0,05 Mikroliter Inhibitor mit 40 Einheiten pro Mikroliter und 0,07 Mikroliter T-vier-Gen-32-Protein zu dem Reaktionsgefäß geben. Die Reaktionsmischung 50 Minuten bei 50 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren. Nach 50 Minuten das Enzym weitere 15 Minuten bei 70 Grad Celsius inaktivieren.

Wenn dies erledigt ist, stellen Sie das Röhrchen zurück auf Eis. Um den freien Primer zu entfernen, geben Sie 0,1 Mikroliter 10×-Exonuklease-Puffer, 0,8 Mikroliter H₂O und 0,1 Mikroliter Exonuklease (1 bei 20 Einheiten pro Mikroliter) zu dem Röhrchen hinzu und inkubieren es 30 Minuten bei 37 °C in einem Thermocycler.

Nach 30 Minuten das Enzym inaktivieren, indem man das Reaktionsgemisch 25 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert. Am Ende das Röhrchen wieder auf Eis stellen. Als Nächstes sechs Mikroliter des Tailing-Reaktionsgemischs zur Probe hinzufügen.

Inkubieren Sie es im Thermocycler bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten, bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten und anschließend bei vier Grad Celsius lagern. Danach 10 Mikroliter der getaillten Probe zur PCR-Reaktionsmischung hinzufügen. Führen Sie die Synthese des zweiten Strangs und die PCR-Amplifikation durch, um cDNA zu markieren.

Um eine robuste Hybridisierung auf iMatrix-Microarrays zu erhalten, fragmentieren Sie zunächst die cDNA, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter der Einzelzell-cDNA zu acht Mikrolitern 1x One-For-All-Puffer hinzufügen. Geben Sie anschließend ein Mikroliter dieser verdünnten DNA zu einer 80-Mikroliter-Reaktionslösung. Fügen Sie danach 20 Mikroliter 5x TDT-Puffer, 2,5 Mikroliter Biotin-6-dATP und ein Mikroliter verdünntes TDT hinzu.

Fügen Sie danach 20 µL 5× TDT-Puffer, 2,5 µL Biotin und 6 dDATP sowie 1 µL TDT hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 90 Minuten bei 37 °C. Anschließend 5 Minuten bei 65 °C.

Anschließend bei minus 20 Grad Celsius lagern oder unmittelbar mit einem a iMatrix-Microarray hybridisieren. Hier ist ein repräsentatives Beispiel für Einzelzell-CD-NA-Schmierpräparate und genspezifische PCR: Die Gelen A, F, G, N und H enthalten starke CD-NA-Schmierpräparate, während die Gelen B, C, D und E deutlich schwächer ausgeprägt sind. Die cDNAs wurden aus fluoreszierenden Netzhautganglienzellen isoliert und anschließend mit PCR-Primern getestet, die spezifisch für die Marker der Netzhautganglienzellen BRN drei B und PAC sechs sind, sowie mit genspezifischer PCR für den Photorezeptormarker.

CRX wurde verwendet, um den Kontaminationsgrad in der Einzelzelle zu bestimmen. cDNAs und Teilmengen von retinalen Ganglienzellen wurden durch Screening auf das Vorhandensein des Gens Tachykinin 1 identifiziert. Die Microarray-Ergebnisse für ausgewählte Gene, die in 22 verschiedenen Einzelzellen exprimiert sind, werden im Heatmap-Format dargestellt.

Die Intensitäten der Mikroarraysignale wurden so skaliert, dass sie der Intensität der roten Farbe entsprechen, während Schwarz das Fehlen eines Signals auf dem Mikroarray anzeigt. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie QPCR verwendet werden, um das im Mikroarray beobachtete Genexpressionsmuster zu bestätigen. Ergebnisse der C-Hybridisierung können ebenfalls genutzt werden, um weitere Fragen bezüglich der Lokalisation von Zellen, die bestimmte Gene exprimieren, zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie man Netzhäute dissoziiert, Einzelzellen isoliert und aus diesen Einzelzellen cDNA erzeugt. Für die Hybridisierung auf Microarrays.