Name: Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Messung zellulärer Chemotaxis mit dem ECIS/Taxis-System unter Verwendung von elektrischer Zell-Substrat-Impedanz-Sensing. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (ES07408 und EB00208) unterstützt.

1. ECIS / Taxis Vorbereitung der Elektrode <ol><li> Die Goldoberfläche der ECIS / Taxis Elektrodenanordnung (bestehend aus 8 Kammern pro Folie) wird zuerst durch die Vorbehandlung mit sterilem 10 mM Cystein in entionisiertem Wasser (dH 2 O) 15 min bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen stabilisiert. </li><li> Saugen Sie die Cystein-Lösung von jeder Elektrode Kammer, spülen Sie 3-mal mit sterilem dH 2 O, und ersetzen mit 250 ul Vollmedium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES-Puffer). </li><li> Verbinden Sie die Elektroden-Array zu Array Instrument Pins auf Inhaber zu kontaktieren, um Elektrode Prüfung durchzuführen. </li><li> Chambers, die richtig angeschlossen sind, werden in grün auf dem Bildschirm hervorgehoben werden. Wenn die Kammern in rot hervorgehoben werden, sind sie nicht verbunden ist und die Elektrode in der Anordnung Halterung neu positioniert werden, um Kontakte für alle Kammern zu schaffen. </li><li> Nachdem alle Kammern verbunden sind, auf dem "Check"-Button in der Software-Controller zur Abschreckungabzubauen des anfänglichen Widerstands und Kapazitätswerte für jede Kammer. Die Widerstandswerte sollten zwischen 1600 und 2000 Ohm sein, und Kapazitätswerte sollte zwischen 5 und 6 Nanofarad für eine 8-Kammer-Array sein. Wenn eine Kammer ist nicht akzeptabel innerhalb dieser Parameter sollte die einzelne Kammer nicht verwendet werden, um Daten zu sammeln. </li><li> Trennen Sie die Elektrode aus Array Halter, um die einzelnen Kammern Agarose vorzubereiten. Aspirieren Medium aus den Kammern und waschen jeder Kammer 3 mal mit sterilem dH 2 O. </li></ol> 2. Vorbereiten Agarose Chambers <ol><li> In einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen, fügen Maßnahme 0,03 g Seakem GTG Agarose und 1 ml steriler PBS. Ersetzen Tubenkappe locker, und schmelzen die Agarose in Autoklaven für 2 min Flüssigkeit Zyklus (Schmelzen in einer Mikrowelle ist nicht für diesen Assay wirksam). Diese kurze Zeit nicht schmelzen wird das konische Rohr. Für weniger anspruchsvolle Zellen, die keine Serum für Kultur, (zB Dictyostelium discoideum) 0,5%Agarose kann im entsprechenden Medium hergestellt werden und in der Mikrowelle geschmolzen. Der Autoklav wird, die für Zellen, die Serum erforderlich, da dies denaturiert, wenn in der Mikrowelle geschmolzen werden. </li><li> 5 ml vollständigem RPMI-Medium in einem Wasserbad erwärmt (55 ° -60 ° C) direkt an der heißen Agarose, bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Agarose und Pipette nach oben und unten vorsichtig mischen. </li><li> Jeweils 300 pl geschmolzener Agarose Medium in jede Kammer, ersetzen Sie die ECIS / Taxis Array Deckel und lassen Sie Gel bei Raumtemperatur. </li><li> Pipettieren verbleibenden Agarose in die Kappe von 15 ml Tube zu Agarose Gelieren zu beurteilen. Dieses überschüssige Agarose wird auch in Teil 4 verwendet werden: Schneiden Brunnen in Agarose. </li></ol> 3. Der Bau und die Schärfung der Kanüle Nun Cutting Tool <ol><li> Schärfen zwei 14 Gauge Kanüle stumpfes Ende, mit einem 5/64 "-Bit. Drehen der Spitze des Bohrers in jedem Kanülenöffnung mit einer langsamen Geschwindigkeit bohren, dass bestimmte der Bohrer schneidet gesamten Innenkante jeder Kanüle opkung auf eine scharfe Schneidkante (Abbildung 4A) zu bilden. </li><li> Bohren Sie zwei Löcher, durch ein "x 2" x ¼ "Plexiglas (4B-D) mit einem 5/64" Bit in einer Bohrmaschine. Legen Sie jede geschärft 14-Gauge-Kanüle so dass es einen gleichen Abstand durch jede Plexiglas Loch ragt. </li></ol> 4. Schneiden Wells in Agarose <ol><li> Sterilisieren Sie die 14-Gauge-Kanüle durch leichtes flammenden die Tipps. Vor dem Schneiden Vertiefungen in der Kammer ECIS, ermöglichen die Kanülen auf Raumtemperatur abkühlen, oder Kühlen des Kanülen durch Berühren des Agarose in der Kappe des 15 ml-Röhrchen. Wenn die Temperatur der Kanüle zu hoch ist, wird die Agarose zu schmelzen als die Kammer Vertiefungen geschnitten werden, wodurch die Vertiefungen verformt und beschädigt. </li><li> Richten Sie die Kanüle Paar oberhalb der beiden Gold-Punkte rund um die Ziel-Elektrode in jeder Kammer (Abbildung 2c und 5). Legen Sie die Kanüle senkrecht, ohne horizontale Bewegung, Anhalten auf sanfte Berührung zwischen der Kanüle unddie Elektrodenoberfläche. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle wieder ohne horizontale Bewegung. Platzierung von zusätzlichen Bohrungen für den Widerstand gegen Gradienten ist auch eine Umgestaltung der Kanüle jig möglich. </li><li> Vorsichtig absaugen der Agarose-Stecker von der Kanüle verließ, mit einem sterilen 9 "Pasteurpipette, verbunden mit geringen Unterdruck, mit einem Staubsauger zu fangen Agarose Abfall. </li><li> Dann werden 300 ul vollständigem RPMI Medium auf die Oberfläche jeder Kammer bei 37 ° C, 2 min, um die Agarose zu sättigen, und dann sanft Absaugen der Medien von der Oberfläche und den Vertiefungen ohne die Agarose. </li></ol> 5. Das Laden des Wells <ol><li> Jedes der gut ist fähig, ein Volumen von 7 pl. Um ein gut in jeder Kammer werden 7 ul Zellen Suspension. Für Jurkat T-Zellen, verwenden Sie 2 x 10 7 Zellen / ml. Diese Zellen werden bis 7 ul 200 ng / ml SDF-1α nicht vollständig RPMI verdünnt, die Serum fehlt reagieren. Nur mit kompletter Medien allein als eine negative control. </li><li> Nachdem die Brunnen geladen werden, sehen jede Kammer des Arrays mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, daß alle Vertiefungen geschnitten wurden und richtig ausgefüllt. Die Zellen sollten in innerhalb der Grenzen des Brunnens Grenze. Wenn sie in beiden Brunnen zu sehen sind, oder sind darüber hinaus auch Grenzstreuen Zelle, dann eine Lücke unter dem Agarose gebildet. Beachten Sie die falsch eingerichtet Brunnen, da die Daten nicht zuverlässig von den Kammern zu interpretieren. </li></ol> 6. Data Collection <ol><li> Legen Sie die Elektrode in der Anordnung Halter und wieder anschließen, die Gold-Pads auf der Elektroden-Array auf die federbelastete Pogostiften des Inhabers und klicken Sie auf "Setup". Die Brunnen, die richtig angeschlossen sind, werden grün markiert werden. Wenn die Vertiefungen rot sind, sind sie nicht miteinander verbunden und die Elektrode in der Anordnung Halter positioniert werden. </li><li> Wählen Sie "8WE1" (8 und 1 Elektrode) aus dem Dropdown-Menü in der Software-Bedienfeld, um die Array-Konfiguration angeben. </li><li> Wählen Sie "Check" in der Software control-Panel, um die anfängliche Widerstand und Kapazität für jeden gut zu bestimmen. Die Widerstandswerte sollte zwischen 1600 und 2000 Ohm betragen, während die Kapazitätswerte zwischen 5 und 6 Nanofarad sein sollte. </li><li> Wählen Sie mehrere Frequenzen, um Widerstand bei mehreren Frequenzen zu messen. Es gibt eine Auswahl von Customizing-Frequenzen, oder mit einem Satz von empfohlenen Frequenzen. Die Standard-Einstellungen mit mehreren Frequenzen Erwerb erfassen Daten mit 11 voreingestellten Frequenzen (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 und 64.000 Hz) bei einer Rate von 8 Wells / min. Das Zeitintervall zwischen den Messungen können auch angepasst werden. Sammeln von Daten mit mehreren Frequenzen erlaubt die Analyse der Kapazität, Impedanz und Widerstand. Sammeln Widerstandswerte bei 4.000 Hz reicht meist für Säugetierzellen Chemotaxisstudien, aber die zusätzlichen Frequenzen können Informationen in anderen Zusammenhängen 12,13 liefern. </li><li> Insgesamt Experiment Dauer eingestellt werden, auf der rechtenPanel, oder das Experiment kann manuell gestoppt werden, indem Sie auf "Fertigstellen", um Zellen Widerstand auf, die von der Ankunft an der Elektrode sind produziert haben. Die Zeit, die für die Zelle auf der Elektrode ankommt, ist abhängig von dem Zelltyp verwendet. </li><li> Klicken Sie auf "Start" um die Datenerfassung zu starten. </li></ol> 7. Data Management <ol><li> Obwohl die Daten nach Excel exportiert werden können, ist die ECIS 1600R-Software, die das System ECISθ begleitet die effizienteste Methode, um ECIS / Taxis Daten zu analysieren. </li><li> Die Software-Daten-Analyse-Tool-Bar enthält die Radio-Buttons Z, R und C. Diese bestimmen, ob Impedanz, Widerstand, Kapazität oder jeweils auf der vertikalen Achse gegen die x-Achse (verstrichene Zeit) aufgetragen ist. </li><li> ECIS / Taxis Daten erfolgt am effektivsten als Widerstand im Laufe der Zeit bei 4.000 Hz angezeigt. Raschen Schwankungen im Widerstand oder microtransients (1), belegen zelluläre Bewegung über die Elektrode. Kompilieren, or Binning die Datenpunkte, so dass nicht alle Punkte grafisch dargestellt werden, ist nicht für die ECIS / Taxis zu empfehlen, da wird es durchschnittlich microtransients aus den Daten. </li><li> Nachdem die Grafik wurde mit dem Software ECIS1600R gemacht worden, kann er durch Auswahl von "Export Graph" aus dem Menü Datei gespeichert und als. Tif oder. Jpg-Datei exportiert werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Zelluläre Chemotaxis wird durch eine Erhöhung des Widerstands bei 4.000 Hz angegeben. Die Ankunft der Zellen von der Zielelektrode wird auch durch das Auftreten des raschen Schwankungen im Widerstand als microtransients oder Bewegungsanalyse nach Opp et beschrieben angegeben. al., 2009 (1) 14. Ein negatives Ergebnis wird durch konsequente angegeben, oder eine leichte Abnahme im Widerstand bei 4000 Hz, in Rot in 1 zu sehen. Das Fehlen von microtransients ist auch ein Zeichen von fehlender Bewegung der Zellen auf der Elektrode. Die Zunahme des Widerstandes ist direkt proportionalproportional zur Anzahl der Zellen, die die Elektrode 10 zu überqueren. Die Zugabe des monoklonalen Antikörpers spezifisch für eine chemische Lockstoffe oder Toxine bekannt, mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren zu blockieren stören können Chemotaxis 11. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Abbildung 1. Chemotaxis von humanen Jurkat T-Zellen in Reaktion auf SDF1α. Humane Jurkat T-Zellen (2.0x10 6 Zellen / ml) wurden in einem Gradienten von SDF-1α ausgesetzt (Ausgangskonzentration 100 ng / ml) oder RPMI 1640 als negative Kontrolle. Die normierte Widerstand bei 4000 Hz wurde graphisch dargestellt. Humane Jurkat T-Zellen bewegt in Reaktion auf SDF-1α, wie durch die Zunahme des Widerstandes und microtransients nachgewiesen, während keine Bewegung mit der Exposition gegenüber RPMI 1640 zu sehen war. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Abbildung 2. Draufsicht auf einen ECIS / Taxis Elektrode without Agarose. Jeder ECIS / Taxis Elektrode besteht aus 8 einzelnen Kammern bestehen. Jede Kammer teilt eine große Elektrode (a), und enthält einen einzelnen Zielelektrode (b). Jede Kammer hat auch 2 Gold Kreise (c), die als Leitfaden verwendet werden, wenn das Schneiden der Brunnen in der Agarose mit der Kanülen. Die Gold-Quadrate (d) sind die Kontaktflächen, die zu den Pogo-Stifte verbinden, um den Wechselstrom an die Elektrode angewendet. Die einzelnen Ziel-Elektroden sind jeweils in der Schaltung mit größeren Gegenelektrode (e). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Abbildung 3. Zwei Vertiefungen werden in jede Agarose-gefüllte Kammer geschnitten. Wenn die chemische Lockstoffe einem zugegeben und es einen Gradienten in der Agarose zu schaffen, mit der höchsten Konzentration der chemoattract am nächsten zu der Lockstoff auch diffundiert. Die Zellen reisen unter der Agarose zu höheren Konzentrationen von Lockstoff und übergehen kann die Ziel-Elektrode. Alsdie Zellen kreuzen die Zielelektrode, wird eine Erhöhung des Widerstands der ECIS 1600R Software aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Abbildung 4. Insertion von zwei 14-Gauge-Kanüle in Plexiglas. A) A 5/64 "Bohrer wird verwendet, um die Kanülenspitze zu schärfen. B) Zwei Löcher müssen in Plexiglas gebohrt werden, um das 14-Gauge-Kanüle nach dem Schuss Layout unterzubringen. C) Verwenden Sie eine Bohrmaschine, um die Löcher zu gewährleisten sind senkrecht zum pleixglass Oberfläche. D) zwei geschliffenen Kanülen werden über ¼ "Plexiglas, 2 mm voneinander entfernt (gemessen vom inneren Kanten) eingefügt. Diese Kanülen geschärft werden vorsichtig in Agarose eingesetzt, um die Brunnen zu schneiden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Abbildung 5. Ausrichten von Kanülen mit goldenen Punkten in ECIS / Taxis Kammer. Zum Brunnen ausfallen, muss das geschärfte Kanülenmit den flankierenden Goldpunkten das Ziel Elektrode an der Unterseite des ECIS / Taxis Kammer ausgerichtet werden. Die Kanülen sollten vertikal eingesetzt werden, ohne horizontale Bewegung, und entfernt in der gleichen Weise.

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</ol>

Ein Knecht David und Michael A Lynes haben eine erteilte Patent für die ECIS / Taxis-Technologie, die wie von der University of Connecticut zu Applied Biophysics, Inc. lizenziert worden

Neuartige Merkmale des ECIS / Taxis Assay in seiner Fähigkeit, die Sammlung von Daten in Echtzeit zu automatisieren, wenn die Zellen für chemische Lockstoffe reagieren. Während die banalsten Anwendung dieser Technologie ist es, zelluläre Antworten auf individuelle chemotaktischen Gradienten zu messen, oder an Steigungen von Mischungen von Chemotaxis Agonisten und-Antagonisten umfasst, ist die ECIS / Taxis Ansatz auch zugänglich für Abweichungen von diesen Konfigurationen, die sehr hilfreich sein in der EU noch Beurteilu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Angewandte Biophysik </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Elektroden-Array </td><td> Angewandte Biophysik </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG Agarose </td><td> BioWhittaker Molecular Applications </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone fötalem Rinderserum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penicillin 5000 IU / ml; Streptomycin 5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> 1M-Lösung, die Zellkultur </td></tr><tr><td> 14 Gauge Kanüle aus Edelstahl (2) 4 Zoll </td><td> Allgemeine Labor Supply </td><td> 5-8365-1 </td><td> Blunt Punkt </td></tr></tbody></table>

messung zellulärer chemotaxis mit ecis / taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Zelluläre Bewegung in Reaktion auf externe Stimuli ist von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse einschließlich Wundheilung, Entzündung und der Reaktion auf eine Infektion. Eine übliche Methode zur Chemotaxis messen, ist die Boyden-Kammer, in die Zellen und für chemische Lockstoffe durch eine poröse Membran getrennt sind. Wenn Zellen durch die Membran in Richtung der Lockstoff migrieren, sie an der Unterseite der Membran, oder fallen in die darunter liegenden Media zu halten, und anschließend gefärbt und visuell gezählt 1. Bei diesem Verfahren werden die Zellen in einem steilen Gradienten und vorübergehend für chemische Lockstoffe, die vermutlich eine schlechte Darstellung von Gradienten in Geweben 2 fanden sein ausgesetzt ist. Ein weiterer Assay-System, das unter Agarose-Chemotaxis-Assay, 3, 4 Maßnahmen Zellbewegung über ein festes Substrat in einem dünnen flüssigen Film, der unter dem Agarose-Schicht bildet. Die Steigung, die in der Agarose entwickelt ist flach und wird gedacht, um eine App seinlich und sinnvoll Darstellung von natürlich vorkommenden Steigungen. Chemotaxis kann durch mikroskopische Abbildung der Strecke ausgewertet werden. Sowohl der Boyden-Kammer Assay und der unter-Agarose-Assay werden meist als Endpunkt-Assays konfiguriert. Die automatisierte ECIS / Taxis System kombiniert die unter-Agarose-Ansatz mit Elektro-Zell-Substrat-Impedanzabtastung (ECIS) 5, 6. In diesem Assay werden Ziel-Elektroden in jeder von 8 Kammern. Eine große Gegenelektrode fließt durch jeden der 8 Kammern (2). Jede Kammer ist mit Agarose gefüllt und zwei kleine Vertiefungen sind die Senkung der Agarose auf beiden Seiten der Zielelektrode. Eine Vertiefung wird mit dem Test-Zellpopulation gefüllt, während die andere enthält die Quellen des Diffundierens chemoattraktive (Abbildung 3). Der Strom durch das System geleitet werden verwendet, um die Änderung des Widerstands, die als Zellen über die Zielelektrode übergeben tritt zu bestimmen. Die Zellen auf dem Ziel electrode um den Widerstand des Systems 6. Darüber hinaus vertreten schnellen Schwankungen im Widerstand Änderungen bei den Wechselwirkungen von Zellen mit der Elektrodenoberfläche und deuten auf anhaltende zelluläre Form ändert. Die ECIS / Taxis kann messen Bewegung des Zellpopulation in Echtzeit über längere Zeit, sondern auch empfindlich genug, um die Ankunft einer einzelnen Zelle in der Target-Elektrode zu erfassen. Dictyostelium discoidium ist bekannt, dass in der Gegenwart eines Folat-Gradienten 7, 8 und die chemotaktische Reaktion lässt sich durch ECIS / Taxis 9 gemessen werden migrieren. Leukozyten Chemotaxis, als Reaktion auf SDF1α und Chemotaxis-Antagonisten können auch mit ECIS / Taxis 10, 11 gemessen. Ein Beispiel für die Leukozyten Reaktion auf SDF1α ist in 1 gezeigt.

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Die zelluläre Bewegung als Reaktion auf externe Stimuli ist grundlegend für viele zelluläre Prozesse, einschließlich der Wundheilung, Entzündungen und der Reaktion auf ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Chemotaxis in einem automatisierten Echtzeit-Assay zu messen, der die elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung (EISs) nutzt. Dies wird erreicht, indem man zunächst die Axxis-Elektroden vorbereitet, indem man jede Kammer mit 0,5 % Agaros in komplettem RPMI-Medium füllt. Der nächste Schritt besteht darin, gleichzeitig zwei Vertiefungen in das Agaros jeder Kammer mit einer Kanülen-Vorrichtung der Größe 14 Gauge einzuschneiden und die beiden Agaros-Stopfen aus jeder Kammer abzusaugen.Ein Brunnen wird mit einer Einzelzell-Suspension gefüllt, während der andere mit einem Chemoattraktans befüllt wird. Anschließend wird die Elektrode über den Array-Halter, der in einen Inkubator mit für den zu testenden Zelltyp geeigneten atmosphärischen Parametern platziert wird, an das ISIS-Theta-System angeschlossen. Letztendlich kann die zelluläre Chemotaxis durch die Echtzeit-Messung der Widerstandsänderung beobachtet werden, wenn die Zellen die Ziel-Elektrode zwischen den beiden Brunnen erreichen.Der Hauptvorteil des Axxis-Assays gegenüber bestehenden Methoden wie dem Boyden-Kammer-Assay oder herkömmlichen, mikroskopbasierten Unter-Agros-Assays liegt darin, dass er die automatisierte Echtzeitmessung der Chemotaxis ermöglicht, ohne dass eine ständige Manipulation des Systems erforderlich ist. Um mit der Elektrodenpräparation zu beginnen, stabilisieren Sie die Goldoberfläche des ISIS-Texas-Elektrodenarrays durch eine Vorbehandlung mit steriler 10-millimolarer Cysteinlösung in entionisiertem Wasser für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen. Nach der Vorbehandlung aspirieren Sie die Cysteinlösung aus jeder Elektrodenkammer. Dreimal mit steriler entionisierter Wasser spülen und mit 250 Mikrolitern vollständigem Medium ersetzen. Als Nächstes das Elektrodenarray mit den Kontaktstiften am Instrumentenarray-Halter verbinden, um eine Elektrodenprüfung durchzuführen. Kammern, die ordnungsgemäß verbunden sind, werden auf dem Computerschirm grün hervorgehoben.Wenn die Kammern rot hervorgehoben sind, sind sie nicht verbunden, und die Elektrode sollte im Array-Halter neu positioniert werden, um Kontakte für alle Kammern herzustellen. Sobald alle Kammern verbunden sind, klicken Sie im ISYS-Theta-Softwarecontroller auf die Schaltfläche „Prüfen“, um die Anfangswiderstands- und Kapazitätswerte für jede Kammer zu bestimmen. Die Widerstandswerte sollten zwischen 1600 und 2000 Ohm liegen und die Kapazitätswerte zwischen fünf und sechs Nanofarad für ein Acht-Kammer-Array. Falls eine einzelne Kammer nicht innerhalb dieser akzeptablen Parameter liegt, sollte sie nicht zur Datenerfassung verwendet werden.Schließen Sie als Nächstes die Elektrode vom Array-Halter ab, um die einzelnen AROS-Kammern vorzubereiten. Aspirieren Sie das Medium aus den Kammern und waschen Sie jede Kammer dreimal mit steriler entionisierter Wasser. Um die Einrichtung der AROS-Kammern zu beginnen, bereiten Sie eine AROS-Lösung mit RPMI-Medium gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.Pipettieren Sie 300 Mikroliter geschmolzenes Aros-Medium in jede Kammer und pipettieren Sie das verbleibende Agros in den Deckel eines 15-Milliliter-Röhrchens. Um die Gelierung des Agros zu beurteilen, ersetzen Sie die ISIS-Axxis-Array-Abdeckung und lassen Sie das Medium bei Raumtemperatur erstarren, um die wiederverwendbare Kanüle herzustellen. Mit dem Präzisions-Schneidwerkzeug für die Vertiefungen zwei stumpfe 14-Gauge-Kanülen schärfen.Unter Verwendung eines 5/64-Zoll-Bohrers die Bohrspitze mit einer Bohrmaschine mit niedriger Drehzahl in jeder Kanülenöffnung drehen und sicherstellen, dass der Bohrer die gesamte Innenkante jeder Kanülenöffnung ausschneidet. Um eine scharfe Schneidkante zu erzeugen, zwei Löcher mit einem 5/64-Zoll-Bohrer durch Plexiglas bohren. Mit einer Bohrmaschine jede geschärfte 14-Gauge-Kanüle in eines der Löcher einsetzen, sodass jede Kanüle gleich weit aus dem Plexiglas herausragt.Sterilisieren Sie das Kanülengerät mit 14 Gauge, indem Sie die Kanülen Spitzen kurz mit der Flamme erhitzten, bevor Sie die Vertiefungen in der EIS-Kammer schneiden. Kühlen Sie die Kanüle ab, indem Sie die Agros in den Deckel des 15-Milliliter-Röhrchens berühren. Wenn die Temperatur der Kanüle nicht abgesenkt wird, schmilzt das Agros beim Schneiden der Kammervertiefungen, wodurch die Vertiefungen verformt und defekt werden.Das Ausschneiden der Vertiefungen, ohne die Integrität des Agaros zu beeinträchtigen, ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Dies erfordert eine sorgfältige Ausrichtung der Kanüle und einen sehr geringen Vakuumdruck. Richten Sie das Kanülenpaar über den beiden goldenen Punkten aus, die die Ziel-Elektrode in jeder Kammer umgeben.Führen Sie die Kanüle vertikal ein, ohne horizontale Bewegungen, und stoppen Sie, sobald ein sanfter Kontakt zwischen der Kanüle und der Elektrodenoberfläche erfolgt ist. Entfernen Sie die Kanüle vorsichtig erneut, ohne horizontale Bewegungen, mithilfe einer sterilen fünf Zoll langen Pasteur-Pipette, die mit einem Vakuumfallenanschluss an einen schwachen Unterdruck angeschlossen ist. Um den Agaros-Abfall aufzufangen, aspirieren Sie vorsichtig die von dem Kanülenwerkzeug zurückgelassenen Agaros-Stopfen.Anschließend 300 Mikroliter vollständiges RPMI-Medium auf die Oberfläche jeder Kammer bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten geben, um die Aros zu sättigen. Nach zwei Minuten das Medium vorsichtig von der Oberfläche und aus den Vertiefungen aspirieren, ohne die Aros zu stören. Jede Vertiefung kann ein Volumen von sieben Mikrolitern pro Vertiefung in jeder Kammer sowie sieben Mikroliter Zellsuspension aufnehmen.In dieser Demonstration werden jca-T-Zellen in einer Konzentration von zwei mal zehn hoch sieben Zellen pro Milliliter verwendet. Anschließend sieben Mikroliter des Chemoattractans in die zweite Vertiefung der Kammer geben. Für jca-T-Zellen 200 Nanogramm pro Milliliter SDF-1α in unvollständigem Medium verdünnt verwenden.RPMI wird als Chemoattractant für eine negative Kontrollbeladung verwendet. Sieben Mikroliter vollständiges Medium allein in die zweite Vertiefung geben. Nach dem Beladen der Vertiefungen jede Kammer des Arrays mit einem umgekehrten Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen korrekt geschnitten und ordnungsgemäß gefüllt wurden.Die Zellen sollten sich innerhalb der Grenzen des Brunnenrands befinden. Wenn Zellen in beiden Brunnen zu sehen sind oder über die Grenze des Zellbrunnens hinauswachsen, entsteht eine Lücke unter den Aros. Beachten Sie, dass falsch eingerichtete Brunnen nicht zuverlässig ausgewertet werden können, da die Daten aus diesen Kammern nicht zuverlässig interpretiert werden können.Um die Datensammlung zu beginnen, platzieren Sie die Elektrode in der Array-Halterung. Stellen Sie die Verbindung zwischen den Goldpads auf dem Elektrodenarray und den federbelasteten Pogo-Pins der Halterung wieder her, die im ISIS-theta-Software-Setup vorgesehen sind. Die Brunnen, die ordnungsgemäß verbunden sind, werden grün hervorgehoben. Wenn die Vertiefungen rot sind, sind sie nicht verbunden, und die Elektrode sollte in der Array-Halterung über das Dropdown-Menü neu positioniert werden. Wählen Sie im Software-Panel acht W eins Semikolon. Dies zeigt die Array-Konfiguration Acht an.Wählen Sie in der Software-Steuerungsoberfläche für eine Vertiefung die Option „Prüfen“ aus, um die Anfangswerte für Widerstand und Kapazität zu bestimmen. Wählen Sie für jede Vertiefung mehrere Frequenzen aus, um den Widerstand bei verschiedenen Frequenzen zu messen. Die Erfassung von Daten bei mehreren Frequenzen ermöglicht die Analyse von Kapazität, Impedanz und Widerstand.Es besteht die Möglichkeit, Frequenzen anzupassen, oder es kann ein Satz empfohlener Frequenzen verwendet werden. Die standardmäßigen Einstellungen für die Mehrfrequenzmessung erfassen Daten bei 11 voreingestellten Frequenzen mit einer Rate von acht Vertiefungen pro Minute. Auch das Zeitintervall zwischen den Messungen kann angepasst werden.Die gesamte Versuchsdauer kann im rechten Bereich festgelegt werden. Alternativ kann der Versuch manuell durch Klicken auf „Beenden“ gestoppt werden. Sobald die Zellen einen Widerstand erzeugt haben, der darauf hinweist, dass sie am Elektrodenort angekommen sind, klicken Sie auf „Start“, um die Datenerfassung zu beginnen.Obwohl die Daten nach Excel exportiert werden können, ist die mit dem EISs-theta-System gelieferte EISs-1600-R-Software die effizienteste Methode zur Analyse von EISs-Steuern-Daten. Die Symbolleiste für die Datenanalyse in der Software enthält die Optionsfelder Z, R und C. Diese legen fest, ob jeweils die Impedanz, der Widerstand oder die Kapazität auf der vertikalen Achse gegenüber der X-Achse, die die verstrichene Zeit darstellt, aufgetragen wird. Die EISs-Steuern-Daten werden am effizientesten als Widerstand über der Zeit bei 4.000 Hertz dargestellt.Schnelle Schwankungen des Widerstands oder mikrotranziente Signale sind Hinweise auf zelluläre Bewegungen über die Elektrode; ein Glätten oder Biegen der Datenpunkte, bei dem nicht alle Punkte berücksichtigt werden, wird für die y-Achse nicht empfohlen, da dadurch mikrotranziente Signale aus den Daten herausgemittelt würden. Sobald der Graph erstellt wurde, kann er mit der ISIS-1600R-Software über die Auswahl „Graph exportieren“ im Dateimenü exportiert und als PNG- oder JPEG-Datei gespeichert werden.Menschliche Jerk-CAT-T-Zellen wurden einem Gradienten von SDF-1α ausgesetzt, um die Bewegung zu stimulieren, oder als negativer Kontrollversuch RPMI 1640. Der normalisierte Widerstand bei 4.000 Hertz wurde hier aufgezeichnet. Die zelluläre Chemotaxis zeigt sich durch einen Anstieg des Widerstands bei 4.000 Hertz, während sich die menschlichen J-CAT-T-Zellen als Reaktion auf SDF-1α bewegen.Das Eintreffen von Zellen an der Ziel-Elektrode wird durch das Auftreten schneller Schwankungen des Widerstands angezeigt, die als mikroskopische Transienten bezeichnet werden. Die Zunahme des Widerstands ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen, die die Elektrode überqueren. Ein negatives Ergebnis zeigt sich durch einen stabilen Widerstand oder eine leichte Abnahme des Widerstands bei 4.000 Hertz.Dies wird beobachtet, wenn die Zellen RPMI 1640 ausgesetzt werden. Das Fehlen von mikrotransienten Signalen ist ebenfalls ein Zeichen für die Abwesenheit von Zellbewegungen an der Elektrode. Zusätzlich zu diesem Grundverfahren können weitere Modifikationen vorgenommen werden, um mit Esys, Texas die zelluläre Bewegung in Gegenwart monoklonaler Antikörper, die spezifisch für einen Chemoattractanten sind, pharmazeutischer Modulatoren oder Toxine zu überwachen.

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