Name: Bestimmung der Säugetier-Zellzahlen, Größe der Zellen und Zell Gesundheit Mit dem Moxi Z Mini Automated Cell Counter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Zellzählung mit dem Moxi Z Mini unter Verwendung des Coulter-Prinzips und mikrofluidischer Kassetten. Diese Methode liefert in acht Sekunden präzise Ergebnisse zu Zellkonzentration, Größe und Gesundheitsindex für Säugetierzellkulturen.

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1. Vorbereitung der Proben <ol><li> Verdünnen der Zellsuspension mit ORFLO Verdünnungsmittel oder einem geeigneten Verdünnungsmittel, so daß die Zellkonzentration im Arbeitsbereich des Instruments (3.000 bis 500.000 Zellen / ml für den Typ M-Kassette, oder 3.000 bis 2.500.000 Zellen / ml für Typ S-Kassette) ist. </li><li> Eine Verdünnung von 1:5 bis 1:20 (Typ M-Kassette) oder ohne Verdünnung bis 1:5 Verdünnung (Typ S-Kassette) ist für die meisten Säugetier-Zelllinien empfohlen, aber die entsprechende Verdünnung wird nach Zelltyp und Aussaatdichte abhängen. Das Volumen für eine genaue Zählung erforderlich ist ungefähr 75 ul. </li></ol> 2. Die Proben laufen <ol><li> Drehen Sie das Moxi Z durch Drücken der Power-Taste und die Home-Bildschirm wird angezeigt. </li><li> Drücken Sie das Tablett ab und legen Sie eine Kassette in das Moxi Z. Die Pipette 75μL Probe ... wird angezeigt. </li><li> Pipettieren Sie 75 &amp;mgr; l Probe in die Einfüllöffnung der Kassette (blaues Ovalbeschriftet 1 oder 2, je nachdem, welcher Ende der Kassette wurde in das Gerät eingesetzt). Dies sind die Einweg-Kassetten, die für 2 Tests verwendet werden können. Hinweis: Setzen Sie die Pipettenspitze direkt in den Laden gut bei ~ 45 °-Winkel, so dass die Spitze unter der vorderen Lippe der gut gefangen wird. Beim Dosieren, ist es wichtig, dass das Vakuum nicht &quot;weiterkommen&quot; der Abgabe der Flüssigkeit wie Lufteinschlüsse verursachen könnten, um die Kassette geben. Es wird empfohlen, eine kleine Kugel (die Größe der Eintrag well) flüssiger Form über die auch während der Abgabe haben. </li><li> Zum Zählen meisten Säugetierzellen, berühren Sie den Bildschirm irgendwo zu beginnen. Für die Zählung sehr kleiner Teilchen (4 bis 8 um mittlere Durchmesser für Typ M und um 08.03 durchschnittlichen Durchmesser für Typ S), kann die Moxi Z in Small Particle-Modus ausgeführt werden. Hinweis: die Kassette Typ wird in der schwarzen Leiste am oberen Rand des Bildschirms angezeigt. In diesem Modus setzt Moxi Z den Durchmesser Skala auf 2 bis 10 um als Standard und führt die Anzahl usingen optimierten Parameter für den Nachweis von kleinen Zellen. Drücken Sie die TOUCH HIER Small Particle Mode-Taste (schwarzes Quadrat), um den Test zu starten und laufen in diesem Modus. </li><li> Das Moxi Z beginnen Sie den Test und die Zellzahl Ergebnisse werden in ca. 8 Sekunden (Typ M-Kassette) oder 15 Sekunden (Typ S-Kassette) abgeschlossen. </li><li> Die Curve Fitting und MVI Berechnungen beginnen automatisch und erfordert nur ein paar zusätzliche Sekunden. Wenn ein geeigneter Sitz gefunden wird, werden die Ergebnisse dann automatisch auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Um den Standard-Gating Erwerb Modus vorzunehmen, drücken Sie die Kurvenanpassung Graf-Taste, um in Gating-Modus umzuschalten. </li><li> An diesem Punkt kann die Kassette aus dem Gerät entfernt werden. </li></ol> 3. Verwalten von Daten <ol><li> Wenn AutoMode Skalierung ausgeschaltet ist, werden die Ergebnisse zunächst für eine Kurvenanpassung Zählung auf einer Skala von 2-34 Durchmesser um (Typ M-Kassette) oder 2-26 μ angezeigtm (Typ S-Kassette). Wenn Automode Skalierung ist, dann wird die Moxi Z automatisch in die Skala der horizontalen Achse (x-Achse) auf den Bereich, der der Breite der Kurvenanpassung Bevölkerung am nächsten ist und gleichzeitig alle Kurvenanpassung Daten angezeigt werden. </li><li> Wenn AutoMode Skalierung ausgeschaltet ist, um manuell die Ergebnisse mit einer höheren Auflösung, berühren Sie das Symbol um 26.02 (Typ M) oder das Symbol um 18.02 (Typ S). Hinweis: Die Kassette Typ wird in dem blauen Feld oben links auf dem Bildschirm angezeigt. Dies wird empfohlen, beim Zählen kleinere Zellen oder Partikel, sowohl die Kurvenanpassung Fähigkeiten sowie die Fähigkeit des Benutzers, um visuell zu unterscheiden Nuancen der Daten zu verbessern. </li><li> Bei Erhöhung des horizontalen Auflösung, wird die Schaltfläche Skalierung dynamisch anpassen, um für das Radfahren zwischen den zur Verfügung stehenden x-Achse Skala reicht erlauben: 2-34, 2-26, 2-18 und 2-10 um für den Typ M-Kassette; oder 2 -26, 18.02, 10.02 und um für die Type S-Kassette. Diese Funktion ist nur AvailaZweidrahtleitung unmittelbar nach einer Zellzahl. </li><li> Zählen Sie Informationen (Zellen / ml) für die Kurve-fit oder gated Region ist in einem schwarzen Kasten unter der linken Seite des Histogramms angezeigt. Mittlere Zellgröße beruhen in dem schwarzen Kasten unter der rechten Seite des Histogramms angezeigt. </li><li> Der MVI-Wert ist ein blaues Feld oben rechts im Histogramm angezeigt. Wenn der Test in kleinen Partikel-Modus ausgeführt wurde, wird die MVI keine Anwendung und wird als &quot;MVI = SPM&quot; angezeigt werden. Zusätzlich, wenn die Konzentration der Zellen außerhalb des MVI Betriebsbereich, eine Botschaft der &quot;MVI = Out of Range&quot; wird angezeigt. </li><li> Um das aktuelle Histogramm speichern, berühren Sie die Fertig-Symbol. Dieser speichert die Daten mit dem Namen &quot;Test XXX&quot; wobei XXX die entsprechenden Prüfnummer. </li><li> Um manuell Tor des Histogramms, berühren, um die Kurve Fit Zählergebnisse Taste umzuschalten. Damit ist die Standard-Gating Erfassungsmodus. Dann schieben Sie die blau-Gating-Marker, die Tore gesetzt, oder tippen Sie the Pfeile links und rechts (diese erscheint nach Berühren der blau-Gating-Marker) für feine Tor Anpassungen werden nur die Zellen zwischen den Markierungen werden gezählt. Das Histogramm vertikale Skala wird automatisch basierend auf der Kurve-fit Bevölkerung Amplitude skaliert. Um diese vertikale Skala einstellen, streichen Sie den Bildschirm nach oben oder unten in der Histogramm-Region. </li><li> Berühren Sie die Gated Graf Ergebnisse, um die Anzeige zu Kurvenanpassung Modus zurückzukehren und Kurvenanpassung Modus den Standard-Erfassungsmodus. </li><li> Dann drücken Sie die Fertig-Symbol, um die Ergebnisse zu speichern und zum Startbildschirm zurück. Um die Ergebnisse zu löschen, drücken Sie auf das Symbol Löschen jederzeit dauerhaft zu löschen, die Ergebnisse des Tests. </li></ol> 4. Analyse von bereits erfassten Daten <ol><li> Um einen gespeicherten Test zu öffnen, drücken Sie die Histogramm-Symbol auf dem Home-Bildschirm. </li><li> Ikonen für bis zu neun gespeicherten Histogramme werden auf dem Bildschirm angezeigt werden.Drücken Sie auf das entsprechende Symbol für den Test von Interesse oder drücken Sie die Page Up oder Page Down Symbole, um weitere Testergebnisse anzuzeigen. </li><li> Jedes Histogramm wird entweder in der Curve Fit Count-Modus oder Gated Count-Modus geöffnet werden, je nachdem, wie es gespeichert wurde. In Gated Count-Modus können Gating Marker positioniert, indem jede Markierung blau-Gating unabhängig Wünsche offen. Auto-Tor durch Berühren Sie auf die gewünschte Spitze. Berühren Sie, um zwischen dem Grafen und Gated Curve Fit Graf Modi zu wechseln. </li><li> Drücken Sie die Zoom-und Unzoom Symbole, um die vertikale Skalierung des Histogramms einstellen. Die vertikale Skala kann auch durch vertikal einen Finger über das Display nach oben (zu erhöhen) oder unten (leiser) direkt geändert werden. </li><li> Drücken Sie die Löschen-Symbol dauerhaft zu löschen, die Ergebnisse des Tests. </li><li> Drücken Sie die Fertig-Symbol, umschließen Sie die Testergebnisse und kehren Sie zum Startbildschirm zurück. (Hinweis: Zoom-Ansicht nicht gespeichert werden.) </li></ol> 5. Übertragen von Daten an einen PC <ol><li> Daten können auf einen PC mit der Orflo Moxichart Anwendung oder über USB-Transfer, indem Sie das Moxi Z USB-Kabel an einen PC oder Mac übertragen werden. Für Bluetooth-Übertragung (MoxiChart), zuerst die Bluetooth-ID des Geräts, indem Sie die Bluetooth-Symbol auf dem Home-Bildschirm des Moxi Z-Einheit. </li><li> Auf dem Computer, öffnen Sie die MoxiChart Anwendung und klicken Sie auf das Bluetooth-Symbol in der oberen rechten Ecke. Dann wählen Sie das Gerät, das mit dem Bluetooth-ID des Moxi Z entspricht, und wählen Sie einen Zielordner für die hochgeladenen Dateien. </li><li> Moxichart wird automatisch übertragen Sie alle Dateien in das angegebene Verzeichnis über die Bluetooth-Verbindung. </li><li> Dateien per Bluetooth (MoxiChart) oder USB übertragen kann geöffnet werden und Analysedirekt mit der Anwendung MoxiChart zed oder, weil sie formatiert sind. csv-Dateien, können sie direkt in Microsoft Excel oder andere Programme Datenanalyse werden für zusätzlich / custom Analyse eröffnet. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Um die Präzision und Genauigkeit des Moxi Z beurteilen, Grafen von HEK-293 Zellen, HeLa-Zellen, CHO-K1-, Hefe-, Jurkat E6-1-Zellen, PC12-Zellen, und Bead-Suspensionen mit Konzentrationen im Bereich von 0-500,000 Zellen präzise kalibriert / ml (Typ M Kassette) und 0-2-2.5e 6 Zellen / ml (Typ S-Kassette) wurden gezählt und verglichen mit einem Coulter Z2 und die Moxi Z. Alle Säugerzellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten und kultiviert wie zuvor beschrieben, 11.07. Kurz gesagt, wurden Zellen in Suspension in 75 mm 2 Gewebekulturflaschen mit Kern Medien RPMI 1640 (Jurkat E6-1-, PC12), MEM (HEK-293-, HeLa-Zellen) oder F12K (CHO-K1-Zellen) kultiviert. Alle Medien wurden ergänzt mit10% fötalem Rinderserum und 100 U penicillin/100 ug Streptomycin. Die Flaschen wurden in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 gehalten. Die Zellen wurden alle 3 Tage passagiert. Hefezellen (X5, C. albicans, Vin 13) gespendet wurden und sofort verwendet, wie zur Verfügung gestellt. Erstmuster Konzentrationen von ~ 500.000 Zellen / ml für den Typ M-Kassette Daten und ~ 2-2.5e 6 Zellen / ml für die Type S-Kassette wurden unter Verwendung des Coulter Z2. Nachfolgende theoretische Konzentrationen wurden durch serielle Verdünnungen mit physiologischer Puffer (Isoton II oder Hanks Balanced Salt Solution) vorbereitet. Bei jeder Konzentration wurden identische Proben von beiden Systemen gemessen und gegen einander. Wie in 2 ersichtlich ist, gab es eine starke lineare Korrelation (Typ M r 2&gt; 0,9886, Typ S r 2&gt; 0,9781) zwischen den Zählungen für alle Proben. Die Konzentrationen wurden auch zu erwarten / theoretische Zellkonzentrationen sowohl mit dem Moxi Z und der Z2 verglichen ( <strong&gt; Abbildung 3) und erneut gezeigt, starke lineare Korrelationen (Typ M r 2&gt; 0,9758, Typ S r 2&gt; 0,9774). Um die Genauigkeit zu bestimmen, wurden HEK-293 und HeLa-Zellzahlen unter Verwendung des Coulter Z2, Z Moxi und eines Hämocytometers. Der mittlere Variationskoeffizient (CV, n = 19) der Zellzahlen unter Verwendung des Moxi Z (Typ M-Kassette), Coulter Z2 und eine Zählkammer wurden berechnet mit Lebenslauf von 5 separate Zählungen in den 200.000-300.000 Zellen / ml-Bereich gemessen wird. Die geringe durchschnittliche CV (4) des Moxi Z ist vergleichbar mit der Z2 und steht stellvertretend für die hohe Genauigkeit nur erreichbar mit einem Coulter-basierten Zähltechnologien. Genauigkeit der Abmessungen des Moxi Z Instrument wurde als nächstes untersucht durch die Messung der erworbenen präzisionskalibriert Polystyrol-Kügelchen. Mittleren Teilchengröße Messungen (n = 5) von Moxi Z wurden gegen Hersteller berichtet Größen aufgetragen. Wie ersichtlich in Abbildung 5, die Moxi Z Messungen konsistent aufeinander abgestimmt die Hersteller Werte mit einem hohen lineare Korrelation (r 2 = 0,9989). Jenseits von Größe und Anzahl der Informationen, bietet Moxi Z ein Reagenz-freie, allgemeine Beurteilung der Säugetier-Zellkultur Gesundheit mit einem gemeldeten Moxi Viability Index (MVI) Wert. Dieser Index wird aus einem Verhältnis der Anzahl der Zellen in der Population von Interesse mit Bezug auf die gesamten Partikel zählt erzeugt. Um die MVI Messmöglichkeiten zu demonstrieren, wurden MVI Lesungen (Typ M-Kassette) auf Standard-Handbuch und durchflusszytometrische Live / Dead-Messtechnik verglichen. Die Populationen der Toten (&lt;10% lebensfähig) HEK-293-und HeLa-Zellen wurden über Nacht durch Inkubation von lebenden Zellen in einem Nährmedium-frei, Natriumfluorid enthält Verdünnungsmittel (Isoton II, Beckman Coulter) bei 37 ° C erstellt Kontrollierte theoretische Lebensfähigkeit wurden durch Mischen ratiometrisch bekannten Konzentrationen von lebenden und toten Zellen hergestellt. Res.eratung Lösungen wurden für die Lebensfähigkeit Ebenen in zweifacher Ausfertigung mit beiden Hämozytometer Zählungen und Messungen Durchflusszytometer analysiert. Hämocytometer Messungen wurden unter Verwendung eines traditionellen 50/50 Mischung von 0,1% Trypan Blau Lösung und Zellen. Durchflusszytometrie-Messungen wurden unter Verwendung eines Guave PCA-Zytometer (Merck) unter Verwendung des Viacount Reagens und die Hersteller-Protokoll spezifiziert (Merck). Wie in Abbildung 6 dargestellt, waren die Pearson-Korrelationskoeffizient Werte (r 2) &quot;der linearen Anpassung der MVI Daten zu analogen Hämozytometer Lebensfähigkeit Prozentsätze für&quot; HEK-Zellen und HeLa-Zellen r 2 = 0,9937 und r 2 = 0,9728, beziehungsweise. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz Kultur Gesundheitsinformationen bietet in einem breiten Spektrum von Zellvitalitäten, die den Vergleich zu den Live / Dead-Messungen mit einem Durchflusszytometer oder Hämozytometer. Tabellen und Abbildungen (Von Dittami et al, 2011.) 15: Abbildung 1. Dünnschicht-Coulter-Zählung: Elektrischer Strom wird durch die Zelle Sensing Zone der Dünnschicht-Kassette weitergegeben. Wie Zellen einzelne Datei fließen durch die CSZ, werden die momentanen Erhöhungen der Spannung durch die Moxi Z. gemessen <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Abbildung 2. Moxi Z zählt sind vergleichbar mit Coulter Z2 zählt. Gleiche gilt der Zelle und Kügelchen Suspensionen wurden unter Verwendung sowohl eines Coulter Z2 und die Moxi Z. gemittelt Zählwerte (n = 3-4) der Moxi Z zählt wurden in Bezug auf die gezeichneten Coulter Z2 entsprechenden Zählungen und R 2-Werte der linearen Anpassung bestimmt. A) Typ M-Kassette - Konzentrationsbereich von 0 - 500.000 Zellen / ml. B) Typ S-Kassette - Konzentrationsbereich von 0 - 2-2.5e 6 / ml.Error Balken zeigen ± 1 Standardabweichung. Abbildung 3. Moxi Z Konzentrationsmessungen vs theoretischen Zellkonzentrationen. A) Typ M-Kassette - Theoretische Konzentration Werte wurden aus Verdünnungsreihen von zunächst 500.000 Zellen / ml Probe vorbereitet B) Typ S-Kassette -. 2.5e 6 Zellen / ml Probe - Theoretische Konzentration Werte von Verdünnungsreihen eines anfänglichen 2 hergestellt. Fehlerbalken zeigen ± 1 Standardabweichung. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Abbildung 4. Variationskoeffizient für die Coulter Z2, Moxi Z (Typ M-Kassette) und Hämocytometer. Der mittlere Variationskoeffizient (CV, n = 19) von HEK-293-und HeLa-Zellzahlen für jeden Ansatz wurden mit Lebensläufen aus 5 separaten gemessen berechnet Grafen von HEK-293-und HeLa-Zellen in der 200.000 - 300.000 Zellen / ml-Bereich. Fehlerbalken zeigen ± 1 Standardabweichung. Abbildung 5. Die Genauigkeit der Messungen mit Partikelgröße Moxi Z-Moxi Z gemessen Perlgröße (Typ M-Kassette) vs Hersteller berichtet Perlgröße. Fehlerbalken zeigen ± 1 Standardabweichung. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Abbildung 6. Kultur Health Assessment mit MVI - Vergleich von MVI-Messungen (Typ M-Kassette) und Guava PCA Viacount Rentabilität im Vergleich zu Visual, Trypan-Blau gefärbten Lebensfähigkeit zählt mit einer Zählkammer.

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Gregory M. Dittami und HE Ayliffe sind Angestellte der Orflo Technologies, dem Unternehmen, entwickelt, fertigt und vertreibt das Moxi Z. Richard D. Rabbitt bietet Teilzeit, bezahlt Beratungsexpertise zur Orflo Technologies. Produktion und freien Zugang zu diesem Artikel wird von Orflo Technologies gesponsert.

Die zugrunde liegende Implementierung der Coulter-Ansatz kann extrem deterministische der Genauigkeit der Messungen. Ein kritischer Bereich ist die Korrektur der Roh-Zellzahlen für &quot;Zufall Ereignisse&quot; wo zwei oder mehrere Zellen gleichzeitig passieren durch die Öffnung und werden als ein einziges elektrisches Ereignis gemessen. &quot;Der Zufall Ereignisse&quot; dazu beitragen, Fehler, die auf einer Reihe von Faktoren wie Größe der Zellen und Grad der Clusterbildung (Davis et al 1967) 6 variiert. Als ein Ergebnis kann die erforderliche Korrektur für zufällig jeder gegebenen Probe nicht vorhergesagt werden, variiert stark zwischen den Zellen / Partikel-Typen und sogar zwischen verschiedenen Kulturen identische Zelltypen. Etablierte Theorie, erste Veröffentlichung von Coulter verankert, beinhaltet das Aufbringen einer logarithmischen Anpassung der rohen setzt auf der Anzahl der Ereignisse beobachtet und einer empirisch bestimmten, Partikel-Korrekturfaktor, Z. Während die genaue Zählungen kann richtig mit t erreicht werdenseine Korrektur Algorithmus wird in der praktischen Anwendbarkeit aufgrund der großen Variationen in z-Werte zwischen verschiedenen Zelltypen und der damit verbundenen Schwierigkeit genaue Vorhersage der Wert begrenzt. Hier, mit dem &quot;echten&quot; Zellzahl von der Moxi Z Kurvenanpassung in Verbindung mit dem Zusammentreffen Korrekturalgorithmus identifiziert, die Moxi Z dynamisch korrigiert Zufall auf die tatsächliche Konzentration zu erreichen. Wenn auf Ergebnisse, die mit High-End-Coulter Z2 verglichen produzierte das Moxi Z vergleichbar zählt in einem Konzentrationsbereich von 0 - 500.000 Zellen / ml (Typ M-Kassette) und 3.000, - 2-2.5e 6 Zellen / ml (Typ S-Kassette) . Darüber hinaus erzielt die Moxi Z diese Zahl mit einer Genauigkeit ähnlich niedrige Variationskoeffizienten zählt und in einer Präzision im Partikelmessung, die charakteristisch für den Goldstandard, Coulter-Technik in Zellzählung ist. Darüber hinaus deuten die hier präsentierten Daten, dass die Moxi Z können wertvolle Informationen liefernin Bezug auf die allgemeine Gesundheit der Zellkulturen. Das Moxi Z nutzt die Kurvenanpassung Ansatz mit einer proprietären Software-Algorithmus, um diese Kultur des Gesundheitszustandes festzustellen. Morphologische Veränderungen mit dem Zelltod assoziiert, wie blebbing, auseinander zu brechen, und die Volumenproduktivität Verzerrungen (Kataoka und Tsuruo 1996 Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, machen es möglich, die Moxi-Z zu impedimetrischen Unterschiede zwischen unterscheiden leben Populationen und tote Zelle / Schutt Populationen. Die MVI wird durch die Analyse der Kultur / Partikelgrößenverteilung auf die relativen Beiträge der Partikel-Ablagerungen, abgestorbene Zellen geschrumpft, und die Kurve ausgestattete Zellpopulation von Interesse zu identifizieren generiert. Der MVI-Wert spiegelt damit eine Bevölkerung Index oder ratiometrisch Maßnahme der monodispersen Population zählt in Bezug auf das gesamte Teilchen Bevölkerung Profil. Dieser Wert ist dann algorithmisch-based angepasst Bevölkerungsstatistik und empirische Beobachtungen. Because der MVI schaut auf andere Parameter als traditionelle Ansätze Färbung, ist nicht zu erwarten, diese Techniken zu spiegeln, sondern bietet eine wertvolle Alternative Blick in die Gesundheit einer Zellkultur, insbesondere im Hinblick auf den Trümmern und mikrobiellen Verunreinigungen. Zusammenfassend ist die Moxi-Z Zellzahl-Messgerät ein ultra kleines Tischgerät, das eine präzise und reproduzierbare Tests von Zellzahl, Zellgröße und Gesundheit Zelle mit dem Coulter-Prinzip und Kurvenanpassung Software-Algorithmen mit einer patentierten Dünnschicht-Sensor-Technologie kombiniert wird, liefert . Mit dem Typ M-Kassette ist in der Lage Zählen von Partikeln im Bereich von 4 bis 25 Mikrometer im Durchmesser (dynamischer Bereich von 2 - 34 Mikrometer), in 8 Sekunden. Mit dem Typ S-Kassette ist in der Lage Zählen von Partikeln im Bereich von 3 bis 20 Mikrometer im Durchmesser (dynamischer Bereich von 2 - 26 Mikrometer), in 15 Sekunden. Außerdem führt die Moxi-Z Gesundheitszustandes ohne die Verwendung von Reagenzien. Es ist viel weniger Arbeit intensive und subjektiver als manuelles Zählen. Im Vergleich zu Standard-Coulter-Zählung, die Moxi schneller ist, deutlich kleiner, bietet mehr Informationen, benötigt deutlich weniger Wartung ist einfacher zu bedienen, und ist ein Bruchteil der Kosten.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ORFLO Diluent </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Kassetten-Dispenser </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Speichert bis zu 25 Kassetten für bequeme Vorratsbehälter </td></tr><tr><td> USB-Kabel </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Verbindungsleitung Messgerät PC / Mac oder Netzteil </td></tr><tr><td> Power Adapter (US-und EU-Modelle) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Verbindet USB-Kabel an eine Steckdose </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Mox Storesi Z-Software und Benutzerhandbuch </td></tr><tr><td> Calibration Check Perlen </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronische Kalibrierung Cassette </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Elektronische Kassette für die Überprüfung der ordnungsgemäßen Betrieb des Systems und Kalibrierung </td></tr></tbody></table>

bestimmung der säugetier-zellzahlen, größe der zellen und zell gesundheit mit dem moxi z mini automated cell counter

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Die Zählung von Partikeln und Zellen wird für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt, darunter routinemäßige Zellkultivierung, hämatologische Analysen und industrielle Kontrollen1-5. Ein entscheidender Durchbruch in der Technologie zur Zählung von Zellen/Partikeln war die Entwicklung der Coulter-Methode durch Wallace Coulter vor über 50 Jahren. Bei dieser Methode wird ein elektrisches Feld über eine mikrometergroße Öffnung angelegt und einzelne Partikel werden hydrodynamisch durch diese Öffnung fokussiert. Die durch die Partikel verursachte Verengung der Öffnung führt zu einer messbaren Änderung der elektrischen Impedanz, die direkt und präzise mit der Zellgröße bzw. dem Zellvolumen korreliert werden kann. Die Anerkennung dieses Verfahrens als Standardmethode in der Zell- und Partikelzählung beruht auf der außergewöhnlichen Präzision und Genauigkeit bei der Größenbestimmung und Zählung von Partikeln, insbesondere im Vergleich zu manuellen und bildbasierten Technologien (Genauigkeiten in der Größenordnung von 98 % bei Coulter-Zählgeräten gegenüber 75–80 % bei manuellen und visuellen Systemen). Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Coulter-Methode im Gegensatz zu bildbasierten Ansätzen eine echte dreidimensionale (3D) Messung von Zellen/Partikeln ermöglicht, wodurch Störungen bei der Zählung durch Verunreinigungen und Agglomerationen deutlich reduziert werden, da präzise volumetrische Informationen über die Zellen/Partikel berechnet werden. Insgesamt bietet dies eine Methode zur Zählung und Größenbestimmung von Zellen, die genauer, weniger mühsam, zeitsparender und weniger subjektiv ist als andere Zählverfahren6.
Trotz der Bedeutung der Coulter-Technik für die Zellzählung war ihre breite Anwendung in routinemäßigen biologischen Studien aufgrund der Kosten und der Größe herkömmlicher Geräte bisher nicht praktikabel. Obwohl ein kostengünstigeres, auf der Coulter-Methode basierendes Gerät entwickelt wurde, weist es im Vergleich zu teureren Geräten der gleichen Art Einschränkungen bei der Korrektur von „Koinzidenzereignissen“ auf, bei denen zwei oder mehr Zellen gleichzeitig die Öffnung passieren und gemeinsam gemessen werden. Eine weitere Einschränkung bestehender Coulter-Technologien ist das Fehlen von Parametern zum allgemeinen Zustand der Zellproben. Daher müssen häufig zusätzliche Methoden in Kombination mit der Coulter-Zählung eingesetzt werden, um die Zellviabilität zu beurteilen. Dies verlängert die Versuchsvorbereitungszeit und erhöht die Kosten, da die herkömmlichen Methoden zur Bestimmung der Viabilität eine Zellfärbung und/oder die Verwendung teurer und umständlicher Geräte wie eines Durchflusszytometers erfordern.
Der hier beschriebene Moxi Z mini automatische Zellzähler ist ein äußerst kompaktes Gerät für den Laborplatz, das die Genauigkeit des Coulter-Prinzips mit einer Dünnfilm-Sensortechnologie kombiniert, um eine präzise Größenbestimmung und Zählung von Partikeln im Bereich von 3–25 Mikrometern zu ermöglichen, abhängig von der verwendeten Zellzählkassette. Mit der Typ-M-Kassette können Partikel mit mittleren Durchmessern von 4–25 Mikrometern gezählt werden (dynamischer Bereich: 2–34 Mikrometer), während die Typ-S-Kassette zur Zählung von Partikeln mit einem mittleren Durchmesser von 3–20 Mikrometern (dynamischer Bereich: 2–26 Mikrometer) verwendet wird. Da das System ein volumetrisches Messverfahren nutzt, entspricht der Bereich von 4–25 Mikrometern einem Zellvolumenbereich von 34–8.180 fL und der Bereich von 3–20 Mikrometern einem Zellvolumenbereich von 14–4.200 fL, was insbesondere bei der Messung nicht kugelförmiger Partikel von Bedeutung ist. Um Säugetierzellen mit dem Moxi Z zu zählen, werden die zu zählenden Zellen zunächst mit ORFLO oder einem ähnlichen Verdünnungsmittel verdünnt. Eine Zellzählkassette wird in das Gerät eingeschoben, und die Probe wird in den Anschluss der Kassette aufgegeben. Tausende von Zellen werden innerhalb von 8–15 Sekunden nacheinander durch eine „Cell Sensing Zone“ (CSZ) in der Dünnfilm-Membran gezogen. Nach Abschluss des Durchlaufs verwendet das Gerät eine proprietäre Kurvenanpassung in Kombination mit einem proprietären Softwarealgorithmus, um Korrekturen für Koinzidenzereignisse vorzunehmen und gleichzeitig die allgemeine Kulturgesundheit zu bewerten, indem das Verhältnis der Anzahl der Zellen in der interessierenden Population zur Gesamtanzahl der Partikel bestimmt wird. Die Gesamtanzahl der Partikel umfasst geschrumpfte und zerfallene tote Zellen sowie weiteres Zelltrümmermaterial und Kontaminationen. Die Ergebnisse werden im Histogrammformat mit automatischer Kurvenanpassung dargestellt, wobei die Tore bei Bedarf manuell angepasst werden können.
Letztlich ermöglicht das Moxi Z eine Zählung mit einer Präzision und Genauigkeit, die mit der eines Coulter Z2, dem derzeitigen Goldstandard, vergleichbar ist, und liefert zusätzlich Informationen zum Kulturzustand. Darüber hinaus erzielt es diese Ergebnisse in kürzerer Zeit, benötigt weniger Platz, zeichnet sich durch deutlich einfachere Bedienung und Wartung aus und verursacht nur einen Bruchteil der Kosten vergleichbarer Technologien.

Das Moxi Z Miniatur automatisierte Zelle Zähler ist ein neuartiges Instrument, das die Coulter-Prinzip kombiniert mit der patentierten Dünnschicht-Sensor-Technologie und einer proprietären Software-Algorithmus, um Sizing durchführen und das Zählen von einem breiten Größenbereich der Partikel sowie auf die allgemeine Gesundheit der monodispersen bestimmen Säugerzellkulturen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung dieses Instruments zum Zählen und Überwachung des Gesundheitszustands der Zellkulturen.

Bestimmung der Säugetier-Zellzahlen, Größe der Zellen und Zell Gesundheit Mit dem Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Die Partikel- und Zellzählung wird für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter die routinemäßige Zellkultur, die hämatologische Analyse und industrielle Qualitätskontrollen1-5. Ein ...

Der Mxi Z Mini automatisierte Zellzähler ist ein äußerst kompakter Tischgerät, das hochpräzise Zell- und Partikelzählungen durchführt. Durch die Kombination des etablierten TER-Prinzips mit einer patentierten Dünnfilmesensortechnologie. Die mit dem Mxi Z verwendeten Kassetten sind präzise mikrofluidische Sensoren zur Bestimmung der Zellanzahl.Ein Kassettenbehälter wird an der Vorderseite des Geräts eingesetzt, und 75 Mikroliter Probe werden in die Probeneinführungsöffnung gegeben. Sobald der Lauf beginnt, werden die Zellen nacheinander durch eine Zellsensorzone in der Dünnfilmmembran der Kassette gezogen, wobei Tausende von Zellen pro Probe erfasst werden, während sie die Sensorzone passieren. Das genaue Volumen jeder Zelle wird mittels einer Impedanzmessung bestimmt.Nach acht Sekunden werden die durchschnittliche Zellkonzentration, die durchschnittliche Zellgröße und der Zellgesundheitsindex zusammen mit einem vollständigen Histogramm mit hoher Auflösung der gesamten Partikelpopulation angezeigt. Die Probendaten können anschließend direkt am Gerät analysiert und gespeichert oder per Bluetooth oder USB auf einen Mac oder PC übertragen werden. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen Systemen wie Hämocytometern oder bildbasierten automatischen Zellzählern liegt in seiner deutlich höheren Zuverlässigkeit, wobei Genauigkeit und Präzision über 95 % betragen, verglichen mit 75 bis 80 % bei bildbasierten Systemen.Plus misst es die Zellgröße, ist viel schneller und nicht subjektiv. Obwohl diese Methode ideal für eine Million Zellzählungen ist. Sie kann auf eine breite Vielfalt von Zellzähl-Anwendungen angewendet werden, da sie über einen weiten dynamischen Bereich verfügt.Solche Anwendungen umfassen die Zählung von weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen, Protozoen, Algen und Hefen. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie eine frisch abgetrennte Suspension von HEK 2 93-Zellen in einem Medium mit physiologischer Leitfähigkeit, wie z. B. Flüssigkeitsverdünnungsmittel oder PBS, auf die geeignete Konzentration verdünnen. Vorsichtig pipettieren, um Zellagglomerationen zu minimieren, und sicherstellen, dass das Gerät vom Stromversorgungsgerät getrennt ist.Schalten Sie dann das Mxi Z ein, indem Sie die Netzschaltertaste drücken; der Startbildschirm wird angezeigt. Das Mxi Z verwendet Einweg-Kassetten des Typs M oder S, bei denen es sich um präzise mikrofluidische Sensoren handelt. Jede Kassette verfügt über zwei Ladeöffnungen, die durch ein blaues Oval gekennzeichnet und mit eins oder zwei beschriftet sind.Jedes Kassette kann für zwei Tests verwendet werden. Kassetten vom Typ M haben einen Arbeitsbereich von 3000 bis 500.000 Zellen pro Milliliter. Der Bereich für Kassetten vom Typ S liegt bei 3000 bis 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter.Drücken Sie die Schale nach unten und fügen Sie eine Kassette ein, um Homogenität der Probe sicherzustellen, indem Sie diese langsam mehrmals umstülpen. Danach pipettieren Sie 75 Mikroliter der Probe. Führen Sie die Pipettenspitze fest in die Probenöffnung ein, halten Sie die Pipette in einem Winkel von 45 Grad und geben Sie die Probe in einer gleichmäßigen Bewegung in die Öffnung ab, wobei sichergestellt werden muss, dass der gesamte Inhalt der Probe abgegeben wurde.Berühren Sie den Bildschirm im vorgesehenen Kreis oder an einer beliebigen Stelle außerhalb des Feldes für den Kleinteilchenmodus, um mit der Zählung zu beginnen. Der mxi Z startet den Test, und die Ergebnisse der Zellzählung liegen nach acht Sekunden vor. Bei Verwendung der Type-M-Kassette werden die Ergebnisse automatisch mithilfe eines proprietären Algorithmus zur Kurvenanpassung angezeigt, der die einzelne Population der interessierenden Zellen erfasst und gleichzeitig die Gesamtanzahl aufgrund von Koinzidenz korrigiert.Ereignisse oder Ereignisse, bei denen mehrere Partikel oder Aggregate gleichzeitig die detektierende Zellzone durchlaufen. Beachten Sie, dass diese Koinzidenzereignisse zwar außerhalb des Kurvenanpassungsbereichs rechts liegen, aber dennoch in die Gesamtanzahl der Zählungen einfließen. Sobald eine geeignete Anpassung gefunden ist, wird ein Histogramm mit hoher Auflösung der gesamten Probenpopulation zusammen mit den numerischen Werten für Zellkonzentration, mittleren Durchmesser und mittleres Volumen angezeigt.Zusätzlich wird ein Moxie-Populationsindex oder MPI-Wert als Indikator für die allgemeine Kulturgesundheit angegeben. Die Zählwerte ganz links im Histogramm sind normal und stellen die Baseline-Rauschschwelle des Systems dar, die zur Optimierung der Systemempfindlichkeit und möglicher Probendebris-Zählungen angepasst wurde. Sobald der Probendurchlauf abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kassette aus dem Gerät, wählen Sie „Fertig“, um die Daten zu speichern, und kehren Sie zum Startbildschirm zurück.Ein visueller Indikator bestätigt, dass die Probe durchlaufen wurde. Soll eine zweite Probe durchlaufen werden, drehen Sie die Kassette um und führen Sie sie in die Einheit ein. Nach einem Durchlauf im Normalmodus werden die Ergebnisse als Kurvenanpassungszählung auf einer Größenskala von vier bis 34 Mikrometern für die Typ-M-Kassette bzw. drei bis 26 Mikrometern für die Typ-S-Kassette angezeigt. Um die x-Achse auf einen Bereich von vier bis 26 Mikrometern umzuskalieren, tippen Sie auf das Umskalierungs-Symbol.Drücken Sie nacheinander das Symbol zum erneuten Skalieren, um die X-Achsen-Skala nacheinander auf folgende Bereiche umzustellen: vier bis 18 Mikrometer, vier bis 10 Mikrometer und zurück zu vier bis 34 Mikrometer. Wechseln Sie gegebenenfalls zurück in den Kurvenanpassungsmodus. Die Testnummer für die aktuelle Analyse wird oben im Histogramm in einem grünen Kasten angezeigt.Die Daten werden unter der Testnummer gespeichert. Berühren Sie das Gating-Symbol, um den Gating-Modus umzuschalten, der eine manuelle Gating-Option für das Histogramm ermöglicht. Dadurch wird Gating zum standardmäßigen Erfassungsmodus. Die Gating-Bereiche können geändert werden, indem die blauen Markierungen links und rechts verschoben werden, oder indem eine der Markierungen berührt und anschließend mit den erscheinenden Pfeiltasten schrittweise verschoben wird.Die angezeigten Zählungen und durchschnittlichen Größenangaben werden ausschließlich aus den Teilchen innerhalb des Gating-Bereichs berechnet. Drücken Sie das Fertig-Symbol, um die Ergebnisse zu speichern und zum Startbildschirm zurückzukehren. Um einen gespeicherten Test zu öffnen, drücken Sie das Histogramm-Symbol auf dem Startbildschirm.Es werden jeweils Symbole für bis zu neun gespeicherte Histogramme angezeigt. Berühren Sie „Page down“ oder „Page up“ bzw. streichen Sie nach oben oder unten, um bei Bedarf weitere Testergebnisse anzuzeigen und das Symbol für den gewünschten Test auszuwählen. Jedes Histogramm wird entweder im Kurvenanpassungsmodus oder im Gated-Modus geöffnet.Abhängig davon, wie es gespeichert wurde, wird im oberen linken Bereich des Bildschirms der für den Test verwendete Kassetten-Typ, entweder M oder S, angezeigt. Gespeichert. Histogramme können außerdem zwischen Gating- und Kurvenanpassungsmodus umgeschaltet werden, um durch Berühren des gewünschten Peaks automatisch zu gaten. Dadurch werden die optimalen Gating-Positionen für den ausgewählten Peak festgelegt.Dies ist besonders bei Mehrfachspitzen situations nützlich. Um einen interessierenden Peak anzugeben, drücken Sie die Zoom- und Unzoom-Pfeilsymbole, um die Anzahlenskala auf der Y-Achse des Histogramms anzupassen. Die vertikale Skalierung kann auch geändert werden, indem Sie mit einem Finger über den Peak nach oben wischen, um sie zu verringern, oder nach unten, um sie zu erhöhen. Drücken Sie das Zurück-Symbol, um diesen Test zu schließen und zum Startbildschirm zurückzukehren.Daten können mithilfe der Moxie-Chart-Anwendung auf einen Mac oder PC übertragen werden. Drücken Sie dazu zunächst das Bluetooth-Symbol auf dem Startbildschirm der Moxie-Z-Einheit. Die Einheit meldet ihre Bluetooth-ID am Computer; öffnen Sie die Moxie-Chart-Anwendung und klicken Sie auf das Bluetooth-Symbol in der oberen rechten Ecke.Danach wählen Sie das Gerät aus, das der Bluetooth-ID des Z entspricht, und legen den Zielordner für die hochgeladenen Dateien zusätzlich zum Bluetooth fest. Eine andere Möglichkeit, Daten von der Mxi Z auf einen Computer zu übertragen, besteht darin, ein USB-Kabel zu verwenden und das Gerät wie ein normales USB-Gerät zu behandeln. Bei Datenakten können Datenakten von einer über USB angeschlossenen Mxi-Z-Einheit in jedes Verzeichnis auf dem Computer kopiert werden.Die Dateien können direkt mit der Mxi Charles-Anwendung geöffnet und analysiert werden, oder – da es sich um CSV-Dateien handelt – direkt in Microsoft Excel oder anderen Programmen zur Datenanalyse geöffnet werden, um vom Kunden eine Vergleichsanalyse der Zählergebnisse zwischen dem Mxi Z und anderen Methoden durchzuführen. Mithilfe eines Zählwerkzeugs zur Analyse identischer Suspensionen aus präzisionskalibrierten Kügelchen und Säugetierzellen wurden die Zellen nach beiden Methoden gezählt. Es wurden vier verschiedene Größen von Kügelchen mit Durchmessern von sechs bis 15,6 Mikrometer sowie mehrere verschiedene Zelllinien getestet.Der Durchschnitt von drei bis vier Zählungen wurde aufgetragen, wie hier zu sehen ist. Die erhaltenen Zählungen waren nahezu identisch, was darauf hinweist, dass der Moxie Z in der Lage ist, genaue Zählungen über einen weiten Größenbereich durchzuführen, um den Bereich der Konzentrationen zu demonstrieren, die mit dem Mxi Z genau bestimmt werden können. Dieselben Kügelchen und Zellen wurden seriell verdünnt, ausgehend von einer anfänglichen Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter für die Kassette vom Typ M oder etwa 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter für die Kassette vom Typ S. Die theoretischen Zellkonzentrationen wurden anschließend gegen die erhaltenen Zählwerte aufgetragen, wie hier dargestellt. Die gemessenen Konzentrationen entsprachen den theoretischen Zellkonzentrationen, was eine genaue Zählung über den dynamischen Bereich jeder Kassette belegt: 3.000 bis 500.000 Zellen pro Milliliter für die Kassetten vom Typ M und 3.000 bis 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter für die Kassetten vom Typ S. Um die Variabilität der erhaltenen Ergebnisse zu untersuchen, wurden fünf getrennte Zählungen von HEK 293- und HELOC-Zellen im Bereich von 200.000 bis 300.000 Zellen pro Milliliter mithilfe eines Call-to-Z-Zwei-, Moxi-Z- und Hämozytometers durchgeführt.Wie anhand dieses Diagramms ersichtlich ist, war der mittlere Variationskoeffizient bei dem Z two und dem mxi Z vergleichbar und deutlich geringer als bei dem Hämocytometer, was darauf hindeutet, dass die Reproduzierbarkeit des Mxi Z der des Z two entspricht und der des Hämocytometers überlegen ist. Um die Präzision des Mxi Z bei der Bestimmung der Partikelgröße zu demonstrieren, wurden hergestellte Kügelchen mit dem Mxi Z gemessen. Für jedes Kügelchenmaß wurden fünf Messungen durchgeführt, gemittelt und gegen die vom Hersteller angegebene Kügelchengröße aufgetragen. Der Mxi Z maß die Kügelchen in der vom Hersteller angegebenen Größe.Der R-Quadrat-Wert betrug 0,9989, um die Fähigkeit des Mxi Z zur Beurteilung der Kultur zu demonstrieren. Messungen des Zellgesundheitsindex wurden mit dem Mxi Z für identische Ansätze mit toten Zellen, HEK- und Hela-Zellen aufgezeichnet und mit den visuellen Trypanblau-Ausschlussergebnissen des gleichen Proben-Hämatoms bezüglich des Prozents an Vitalität oder mit dem Durchflusszytometer Guava PCA zum Vergleich gegenübergestellt. Die Vitalitätsmessungen für die Proben wurden ebenfalls in dem Diagramm eingetragen, wie hier zu sehen ist.Die berechnete Vitalität sowohl für HGK- als auch für LAR-Zellen, ermittelt mit dem Mxi Z, lag auf dem gleichen Niveau wie die Vitalitätsmessungen, die mit der Trypanblau-Ausschlussmethode durchgeführt wurden, mit Bestimmtheitsmaßen (r²) von 0,9937 bzw. 0,9728. Die erhaltenen Daten sind zudem vergleichbar mit denen, die mittels Guava PCA und Durchflusszytometer ermittelt wurden, mit Bestimmtheitsmaßen von 0,9724 für die EK-Zellen und 0,9585 für die Hela-Zellen. Obwohl der Zellgesundheitsindex in bestimmten Fällen mit den Standardverfahren zur Bestimmung der Vitalität übereinstimmen kann, handelt es sich um eine völlig neue und andere Technik zur Beurteilung der Zellgesundheit und stimmt folglich nicht immer mit den älteren Methoden überein.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einfach Informationen zur Zellgesundheit, Zellgröße und Zellanzahl gewonnen werden können, während Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zelldichte im richtigen Bereich liegt.

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