Name: Visualisierung von Propriozeptoren in Drosophila Larven und Puppen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die Immunfärbung und Visualisierung von Chordotonalorganen in Drosophila-Larven und -Puppen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung propriozeptiver Sinnesorgane mittels konfokaler Mikroskopie.

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Die Autoren möchten die Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa danken für die Zusendung Antikörper. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (Nr. 29/08) von der Israel Science Foundation unterstützt. AS wird auch durch ein Forschungsstipendium der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.

Bevor Sie beginnen <ol><li> Wachsen Sie die gewünschten fly Kulturen. Die Durchstechflaschen nicht überfüllt (ca. 30 Fliegen pro 50 ml Fläschchen). Lassen Sie die Fliegen legen ihre Eier nur für einen Tag in jedem Fläschchen. Dies wird den Larven ausreichende Versorgung mit Lebensmitteln und ihnen zu ermöglichen maximale Größe vor kriecht aus der Nahrung in Kontakt kommen. Die Durchstechflaschen im entsprechenden Temperatur bis zum dritten Larvenstadium, um auf dem Fläschchen Wand wandern beginnen. </li><li> Bereiten Sie einen frischen Vorrat an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und PBT (0,1% Tween in PBS). Halten 10 ml PBS auf Eis. </li><li> Bereiten Sie 1-5 ml frisches Fixativ (4% Formaldehyd in PBT) und halten Sie sie auf Eis. Wir verwenden in Flaschen 37-38% Formaldehyd als Stammlösung. </li></ol> 1. Dissection und Fixierung von Dritten Larvenstadium <ol><li> Wählen Sie einen wandernden dritten Larvenstadium aus dem Fläschchen Wand und legen Sie sie in einem 50 ul Tropfen eiskaltem PBS auf einer Platte Sylgard Dissektion (aus Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit, Dow Corning Corporation in einGewebekulturschale). </li><li> Halten Sie die Larve, dorsal oben, nahe der Mündung Haken, mit feinen Pinzetten (Dumont Nr. 5 Zangen), und kleben Sie ein Insekt Stift (minutien, 0,1 mm, Edelstahl) durch die Larve des Gehirns. </li><li> Besorgen Sie sich die hintere Ende der Larve mit der Zange, ziehen Sie vorsichtig und sanft dehnen die Larve der Länge nach. Kleben Sie ein anderes Insekt Stift zwischen den beiden hinteren Luftlöcher. </li><li> Mit Feder Schere zwei horizontale Schnitte in der Körperwand (senkrecht zu der Vorwärts-Rückwärts-Achse), in der Nähe der vorderen und hinteren Stiften. </li><li> Mit den Frühling Schere die larvalen Körper Mauer entlang der dorsalen Mittellinie von der vorderen bis zum hinteren Einschnitt. </li><li> Entfernen der inneren Organe (Darm, Speicheldrüsen, Malpighischen Gefäße etc.) und die Luftröhre mit einer feinen Pinzette. Waschen Sie sanft ein-oder zweimal mit PBS. </li><li> Besorgen Sie sich die zwei Karosserievarianten Wandklappen mit einer Pinzette, strecken sie aus und hänge sie an der Platte mit Hilfe von zwei Insektennadeln für jede Seite. </li><li> Entfernen Sie den PBS und 50 ul der Fixierlösung (4% Formaldehyd in PBT). Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das Fixativ. Zweimal mit PBS waschen. Ziehen Sie die Insektennadeln. Mit einer Schere geschnitten Frühjahr die Larven Kopf und Schwanz Verlassen eines rechteckigen Filet. Übertragen Sie das feste Gewebe auf ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit PBS. </li><li> Sobald eine ausreichende Anzahl von Larven befestigt sind, kann man direkt weiter Antikörperfärbung. Wenn eine sofortige Färbung nicht erwünscht ist, sollte der feste Larven 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 95% Ethanol gewaschen und aufbewahrt werden in 95% Ethanol bei -20 ° C </li></ol> 2. Dissection und Fixierung der Puppen Teil I <ol><li> Kümmern Sie sich um den Fläschchen als für Larven Fixierung, bis dritten Larvenstadium zu pupariate beginnen. Untersuchen Sie die Vials pro Stunde und Mark, die Larven haben pupariated. Lassen Sie die markierten Puppen auf 30-40 Stunden bei 24 ° C oder 24-27 Stunden zu entwickeln bei 29 ° C. </li><li> Mit feinen Pinzetten holen 20-30 Puppen von the entsprechenden Alter und steckte sie in einen dunklen Porzellan Multi-Well-Sezieren Gericht. Achten Sie darauf, das Gewebe von Interesse zu beschädigen. </li><li> Entpacken Sie die Puppen aus der Puppenhülle. Beginnen Sie mit dem Abziehen des Operculum und weiter, bis die Puppe ist kostenlos. Legen Sie die Puppe in einen Brunnen mit PBT gefüllt. Weiter Extrahieren all die Puppen. Steps 2,4-2,6 sollte in kleinen Chargen von fünf Puppen zu einer Zeit durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie fünf Puppen auf einer ebenen Fläche zwischen dem Brunnen des Sezieren Gericht. Mit einem Messer geschnitten Mikrodissektion die Spitze des Kopfes und der hinteren Spitze des Bauches (alternativ ist es möglich, zwei Paare von Zangen verwenden, um Löcher an beiden Enden der Puppe reißen). </li><li> Halten Sie die Puppe an Ort und Stelle mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie ein 1 ml-Spritze zum Auswaschen der inneren Organe der Puppe, durch Einspritzen von PBT durch die vordere Öffnung. </li><li> Waschen Sie den sezierten Puppe kurz durch Eintauchen in eine gut mit PBS gefüllt und verschieben Sie sie in die kalte Fixativ in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gehalten. </li><li> Über Nacht (ON) bei 4 ° C </li></ol> Teil II <ol start="8"><li> Entsorgen Sie das Fixativ und waschen die Puppen dreimal je 5 Minuten, mit PBT. Halten Sie die gewaschenen Puppen auf dem Eis. </li><li> Füllen Sie zwei Vertiefungen der Sezieren Gericht mit PBT. Verwendung einer Polyethylen Pasteurpipette Übertragung mehreren Puppen einem der Vertiefungen. </li><li> Bewegen um eine Puppe zu einer Zeit, in der zweiten Wanne. Mit zwei Paar scharfe Zange mit perfekt ausgerichtet Tipps, ziehen Sie die transparente Puppenstadium Kutikula des Flügels: Sicherung der Puppe auf den Grund des Brunnens mit einer Pinzette, sanft und reißen die Nagelhaut mit dem zweiten Pinzette. Sobald die Nagelhaut gerissen ist, diese abziehen des Flügels. Achten Sie darauf, um den Flügel aus der Puppe trennen. Nach Abziehen des Nagelhaut vom Flügel Klinge, Peeling weiterhin die Schuppenschicht des Flügels Scharnier (wo die Flügel Chos befinden). </li><li> Nach Abziehen des Flügels Cuticula, kann man versuchen Abziehen des Schenkels Cuticula in einer ähnlichen Weise.Viele Beine sind wahrscheinlich in den Prozess verloren, aber trotz der geringen Ausbeute, dieser Schritt ist sehr zu empfehlen, da es stark verbessert die Färbung von Chos Bein. Die Chos des Haltere und Bauch kann ohne weiteres Abziehen der Cuticula sichtbar gemacht werden. </li><li> Platzieren Sie den &quot;geschält&quot; Puppe in ein Eppendorf-Röhrchen mit Methanol gefüllt und bei Raumtemperatur aufbewahren. Weiter Abziehen der Kutikula von all den Puppen, und fügen Sie sie dem gleichen Rohr. Mindestens 10 schön geschält Puppen sollten für jede Färbung gesammelt werden. </li><li> Entfernen Sie das Methanol und dreimal für jeweils 5 Minuten, mit 95% Ethanol. Feste Puppen können für längere Zeit in 95% Ethanol bei -20 ° C aufbewahrt werden </li></ol> 3. Immunfärbung von Larven und Puppen <ol><li> Waschen des fixierten Gewebes mit PBT dreimal jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. Larven können unter leichtem Schütteln auf einer rotierenden Platte gewaschen werden. Die Puppen sind ohne Schütteln gewaschen. </li><li> Ersetzen Sie das PBT mit Blocking-Puffer (PBT + 5% nOrmal Ziegenserum) und inkubieren ON bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie die Blockierung Puffer und Inkubation mit primären Antikörpern (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C </li><li> Mal Waschen mit PBT, wie in Schritt 3.1. </li><li> Entfernen Sie die PBT und inkubieren mit Sekundärantikörper (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C </li><li> Waschen zweimal mit PBT und einmal mit PBS, wie in Schritt 3.1. </li><li> Ersetzen Sie das PBS mit Eindeckmedium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) und inkubieren Sie bei 4 ° C auf. </li></ol> 4. Montage der Larven <ol><li> Die Larven werden auf einem Objektträger in einem Tropfen Eindeckmittel mit ihrer Kutikula nach unten und Körperwand Muskeln nach oben montiert. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Eindeckmedium auf einem sauberen Deckglas und verwenden es, um die Herstellung zu decken. Wenden Sie keine Druck auf die Larven montiert. </li></ol> 5. Montage der Puppen <ol><li> Bereiten Sie zwei Objektträgermit einem Tropfen Eindeckmedium, eine für Zerlegung und den zweiten für die Montage. </li><li> Setzen Sie mehrere Puppen auf einem der Dias. </li><li> Mit Hilfe einer Schere entfernen Frühjahr den Kopf und den hinteren Teil des Bauches. </li><li> Trennen Sie die dorsale Hälfte des Thorax aus der ventralen Hälfte, indem zwischen den Flügeln und den Beinen. </li><li> Legen Sie die sezierten Körperteile der Puppe auf der zweiten Objektträger in einem Tropfen Montagelösung. Sicherstellen, dass die Flügel und Beine gestreckt werden und versuchen, Überlagerung von Gewebe so weit wie möglich zu minimieren. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas und legen Sie es über der Probe. Üben Sie keinen Druck auf die Probe montiert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Immuno-gefärbten Chos der dritten Larvenstadium ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Beispiel zeigt eine schön gedehnt Abdominalsegment, in dem sieben der acht Chos sind deutlich sichtbar. Neuronen sind LaboreLED mit MAb22C10 (1:20, aus der Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa erhalten);. die Kappe, Band, Mütze und Band-Befestigung Befestigung Zellen werden mit anti-αTub85E (1:10, Klein et al beschriftet, 2010). Sekundärantikörper für Fluoreszenzfärbung waren Cy3, Cy5-konjugierten oder anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Die Proben wurden unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie (LSM 510, Zeiss). Ein Cluster von Flügel Chos am ventralen radiale Vene eines 35 h alte Puppe ist in Abbildung 2 dargestellt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Abbildung 1 (A) Schematische Darstellung der sechs Zelltypen, die eine einzelne Ch Orgel darstellen:. Vakuumierkappe (CA), Kappe (C), scolopale (S), Neuron (N), Band (L) und Lig. Befestigung (LA ). Die LCh5 Organ, in dem fünf Chos gruppiert sind, wird über die Gruppe der lateralen Quermuskeln (LT gestreckt1-4). Die laterale Längsmuskulatur (LL1), ventrale Längsmuskeln (VL1-4) und seitlichen schrägen Muskel (LO1) sind ebenfalls dargestellt. Tendon-Zellen werden als braune Kugeln (Entnommen aus Klein et al., 2010) dargestellt. (B) Ein Abdominalsegment eines dritten Larvenstadium mit einer 10X Vergrößerung betrachtet. Sieben der acht Chos, die in jedem Abdominalsegment liegen auf der Hand: fünf seitlichen Organe, die zusammen den pentascolopidial Orgel (LCh5), einen einzigen seitlichen Orgel (LCh1) und einer der beiden ventralen Chos (VChB). Die Neuronen (N) der Chos mit den neuronalen Marker MAb 22C10 (rot) markiert. Das Ligament (L), Kappe (C) und Befestigung Zellen (LA, CA) mit markierten Anti-αTub-85E (blau). Die Kappe und Lig. Zellen sind zusätzlich mit einer CHO-spezifischen GFP-Reporter beherbergen ein regulatorisches Element aus dem dei Locus (Nachman et al., Unveröffentlichte Daten) beschriftet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Abbildung 2. </sTrong&gt; Die Flügel Chordotonalorganen am ventralen Vene radiale werden bei einer 40-facher Vergrößerung betrachtet. Die Neuronen (N) mit den neuronalen Marker 22C10 (Rot, B) gekennzeichnet. Das Band (L) und der Kappe (C)-Zellen werden mit anti-Antikörper αTub85E (Blue, C) und einer CHO-spezifischen GFP-Reporter-Transgen (Nachman et al., Unveröffentlichte Daten) zusammen markiert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll in diesem Video beschrieben bietet eine Möglichkeit, propriozeptiven Chos während Larven und Puppen Stufen sichtbar zu machen. Studien über die Struktur und Entwicklung der propriozeptiven Chos wurden bisher hauptsächlich zur Gewinnung von embryonalen Stadien und larvalen Imaginalscheiben beschränkt. So viele Aspekte der späteren Stadien der Entwicklung, der sowohl juvenilen und adulten Chos, weitgehend unbekannt. Das beschriebene Protokoll, mit gemeinsamen genetischen Werkzeuge in Drosophila kombiniert wird, kann genutzt werden, um zu identifizieren und studieren neue Gene und Signalwege, die eine Rolle in späteren Stadien der Entwicklung Chos werden. Dieses Protokoll wurde für die Visualisierung von CHO optimiert, aber es kann für die Färbung von anderen Geweben, wie Puppen Flügel 6 angepasst werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes / Werkzeug </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (oder # 55) Zangen, Biologie Spitze </td><td> FST </td><td> 11252-20 oder 11252-10 (Oder ähnlich Zange) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz Edelstahl Insektennadeln, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Surgical Instrument Co </td><td> RS-6083 bis 10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Siliconelastomer Kit </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Mikro-Schere (gerade, 7,5 cm, Klinge 3mm) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Vannas Frühling Schere mit identischen technischen Daten sich von Roboz Surgical Instrument Co. erworben werden </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako Fluorescent Mounting Medium </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS Formulierung </td><td colspan="2"> 2 gr / lit KCl, 2 gr / lit KH 2 PO 4, 80 gr / lit NaCl, 21,7 gr / lit Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> Die Qualität der PBS ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0,1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von propriozeptoren in<em&gt; drosophila</em&gt; larven und puppen

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Propriozeption ist die Fähigkeit, die Bewegung oder Position von Körperteilen, indem sie auf Reize, die sich innerhalb des Körpers zu erfassen. In Fruchtfliegen und andere Insekten Propriozeption wird von spezialisierten Sinnesorgane bezeichnet Chordotonalorganen (chos) 2 zur Verfügung gestellt. Wie viele andere Organe in Drosophila, entwickeln Chos zweimal während des Lebenszyklus der Fliege. Zuerst entwickeln sich die Larven Chos während der Embryogenese. Starten Sie dann die erwachsenen Chos in den larvalen Imaginalscheiben entwickeln und auch weiterhin während der Metamorphose zu unterscheiden. Die Entwicklung der Larven Chos während der Embryogenese wurde ausgiebig studiert 10,11,13,15,16. Das Herzstück eines jeden Cho ist eine sinnliche Einheit eines Neurons und einem scolopale Zelle zusammen. Die sensorische Einheit wird zwischen zwei Arten von akzessorischen Zellen, die an der Kutikula über spezialisierte epidermalen Zellen 1,9,14 Befestigung anbringen gestreckt. Wenn ein Larve bewegt, die relative Verschiebung der Epidermal Anlage Zellen führt zu einer Dehnung des sensorische Einheit und damit Öffnung bestimmter transient receptor potential vanilloid (TRPV) Kanäle an der äußeren Segment des Dendriten 8,12. Die ausgelöste Signal wird dann an den Bewegungsapparat CPG Schaltung in das zentrale Nervensystem übertragen. Mehrere Chos in der erwachsenen Fliege 7 beschrieben. Diese werden in der Nähe der Gelenke der erwachsenen Fliege Ansätze (Beine, die Flügel und Halfter) und in der Brust und Bauch liegt. Darüber hinaus wurden mehrere hundert Chos bilden gemeinsam die Johnston Organ beim Erwachsenen Antenne, transduzieren akustische, mechanische Energie 3,5,17,4. Im Gegensatz zu dem umfangreichen Wissen über die Entwicklung der Chos in embryonalen Stadien, wird sehr wenig über die Morphologie dieser Organe während der Larvenstadien bekannt. Darüber hinaus, mit Ausnahme der femoralen Chos 18 und Johnston Organ, unseren KenntnissenGE über die Entwicklung und Struktur der Chos in der erwachsenen Fliege ist sehr lückenhaft. Hier beschreiben wir eine Methode zur Färbung und Visualisierung in Chos dritten Larvenstadium Larven und Puppen. Diese Methode kann zusammen mit genetischen Werkzeugen aufgetragen werden, um besser zu charakterisieren und zu verstehen, die Morphologie, die Entwicklung der verschiedenen Chos in-the-fly.

Eine Methode zur Immunfärbung und visualisieren Chordotonalorganen in Larven und Puppen von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beschrieben.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Die Propriozeption ist die Fähigkeit, die Bewegung oder Position von Körperteilen durch die Reaktion auf innerhalb des Körpers entstehende Reize wahrzunehmen. Bei Fruchtfliegen und anderen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, propriozeptive Cortin-Organe in Larven und Puppen von Drosophila sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Dritte-Instar-Larven oder Puppen gezüchtet und gesammelt werden, nachdem die Larven oder Puppen seziert wurden. Anschließend werden sie zur Immunfärbung fixiert.Anschließend werden die fixierten Larven oder Puppen mit den geeigneten Antikörpern immunschärfen. Der letzte Schritt besteht darin, die gefärbten Proben zur Mikroskopie aufzubereiten. Abschließend wird die Konfokalmikroskopie verwendet, um die Cortisonorgane sichtbar zu machen.Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur post-symbiontischen Entwicklung und Musterbildung von Prop-Rezeptoren in der Oph. zu beantworten. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in die Entwicklung von Prop-Rezeptoren ermöglichen kann, ist es auch auf andere Organe wie andere Arten von Sinnesorganen und Sehnen anwendbar. Zunächst sammeln Sie die erforderlichen Werkzeuge, Lösungen und ein Gefäß mit wandelnden Tieren.Im dritten Larvenstadium halten Sie die PBS- und Fixierungslösungen auf Eis. Wählen Sie eine wandern­de Larve im dritten Stadium von der Probengefäßwand und legen Sie sie in einen Tropfen von 50 µL eiskaltem PBS auf einer Dissektionsplatte aus Zigarrenelastomer in einer Zellkulturschale. Halten Sie die Larve unter dem Stereomikroskop mit feinen Pinzetten mit der dorsalen Seite nach oben nahe den Mundhaken fest und stechen Sie eine Insektennadel durch das Gehirn.Fassen Sie das hintere Ende der Larven mit der Pinzette. Ziehen Sie vorsichtig und dehnen Sie die Larven sanft in Längsrichtung. Stecken Sie eine weitere Insektennadel zwischen die beiden hinteren Kugeln, indem Sie Federpinzette verwenden.Schneiden Sie zwei horizontale Inzisionen in die Körperwand senkrecht zur anterioren-posterioren Achse, wobei Sie nahe an den vorderen und hinteren Nadeln bleiben. Schneiden Sie anschließend die Larvenkörperwand entlang der dorsalen Mittellinie von der vorderen bis zur hinteren Inzision auf. Entfernen Sie die inneren Organe und die Tracheen mit feinen Pinzetten.Anschließend einmal oder zweimal vorsichtig mit PBS waschen. Die beiden Körperwandlappen mit der Pinzette fassen, auseinanderziehen und mit jeweils zwei Insektennadeln pro Seite auf der Platte fixieren.Entfernen Sie das PBS und geben Sie 50 Mikroliter Fixierungslösung hinzu. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen der Fixierungslösung und zweimaligem Waschen mit PBS ziehen Sie die Insektennadeln mit einer Federpinzette heraus.Schneiden Sie Kopf und Schwanz des Larvenkörpers ab, sodass ein rechteckiges Filet übrig bleibt. Überführen Sie das fixierte Gewebe in ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit PBS. Sobald eine ausreichende Anzahl von Larven fixiert ist, kann direkt mit der Antikörperfärbung fortgefahren werden.Falls eine sofortige Färbung nicht gewünscht ist, sollten die fixierten Larven dreimal für jeweils fünf Minuten mit 95 % Ethanol gewaschen und anschließend im Ethanol bei minus 20 Grad gelagert werden. Überwachen Sie die Fläschchen wie bei der Larvenfixierung, bis die Larven des dritten Stadiums beginnen, zu fressen. Untersuchen Sie die Fläschchen stündlich und kennzeichnen Sie die Larven, die gefressen haben.Lassen Sie die markierten Puppen für 30 bis 40 Stunden bei 24 Grad Celsius oder für 24 bis 27 Stunden bei 29 Grad Celsius mittels feiner Pinzette entwickeln. Wählen Sie 20 bis 30 Puppen des geeigneten Alters aus und geben Sie sie in eine dunkle porzane Mehrmulden-Präparierschale. Achten Sie darauf, das Gewebe von Interesse nicht zu beschädigen.Extrahieren Sie anschließend die Puppen aus ihren Puppenkokons. Beginnen Sie damit, das Operculum abzulösen, und fahren Sie fort, bis die Puppe vollständig freigelegt ist. Entnehmen Sie alle Puppen und geben Sie sie in eine Mulde, die mit PBT gefüllt ist.Platzieren Sie fünf Puppen mit einem Mikrodissektionsmesser auf einer flachen Oberfläche zwischen den Vertiefungen der Präparierschale. Schneiden Sie die Spitze des Kopfes und die hintere Spitze des Abdomens ab. Halten Sie die Puppe mit feinen Pinzetten fest und spülen Sie die inneren Organe der Puppe aus, indem Sie PBT durch die vordere Öffnung injizieren, wozu Sie eine Ein-Milliliter-Spritze verwenden.Spülen Sie die dissektierte Puppe kurz, indem Sie sie in eine mit PBS gefüllte Vertiefung tauchen, und überführen Sie sie in das kalte Fixativ in einem Eppendorf-Röhrchen, das auf Eis steht. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag.Entfernen Sie das Fixativ und waschen Sie die Puppe dreimal mit PBT, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Halten Sie die gewaschene Puppe auf Eis. Füllen Sie zwei Vertiefungen der Petrischale mit PBT.Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette aus Polyethylen. Überführen Sie mehrere Puppen in eines der Löcher. Danach bringen Sie nacheinander jeweils eine Puppe in das zweite Loch.Unter Verwendung von zwei Paar scharfer Pinzetten mit perfekt ausgerichteten Spitzen wird die Puppe am Boden der Vertiefung fixiert und anschließend vorsichtig die Kutikula aufgerissen. Das Entfernen der Flügelkutikula ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Wir verlieren während dieses Schritts immer einige der Flügel, weshalb wir das Verfahren mit einer vergleichsweise großen Anzahl von Puppen beginnen.Wenn der Cuticula ein Riss entstanden ist, ziehen Sie sie vorsichtig vom Flügel ab, wobei darauf zu achten ist, dass der Flügel mit der Puppe nicht gelöst wird. Nachdem die Cuticula von der Flügelspitze entfernt wurde, fahren Sie fort, die Cuticula des Flügelscharniers abzulösen.Nachdem die Flügelkutikula abgezogen wurde, kann man versuchen, die Beinkutikula auf ähnliche Weise abzulösen. Viele Beine gehen dabei verloren, aber trotz der geringen Ausbeute wird dieser Schritt dringend empfohlen, da er die Färbung der Bein-Cortison-Organe erheblich verbessert. Legen Sie die Puppe in ein Eppendorf-Röhrchen, das mit Methanol gefüllt ist, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.Setzen Sie das Abziehen der Cuticula an allen Puy fort und geben Sie sie in denselben Kolben, insgesamt mindestens 10 gut entpuppte Puy. Entfernen Sie für jede Färbung das Methanol und waschen Sie dreimal je fünf Minuten mit 95 % Ethanol. Fixierte Puy können über längere Zeiträume in 95 % Ethanol bei minus 20 Grad vor der Immunfärbung aufbewahrt werden.Um die Larven zu montieren, geben Sie einen Tropfen Montagemedium auf einen Objektträger und positionieren Sie die Larven mit den Cuticula nach unten und den Körperwandmuskeln nach oben. Geben Sie einen kleinen Tropfen Montagemedium auf eine saubere Deckglasplatte und verwenden Sie diese, um die Präparation abzudecken, ohne Druck auf die montierten Larven auszuüben. Um die Puppe zu montieren.Bereiten Sie zunächst zwei Objektträger mit einem Tropfen Einbettmedium vor, einen für die Dissektion und einen zweiten zum Aufmontieren. Geben Sie mehrere pu auf einen der Objektträger und entfernen Sie dann mit der Präzisionspinzette den Kopf und den hinteren Teil des Abdomens. Trennen Sie anschließend die dorsale Hälfte des Thorax von der ventralen Hälfte, indem Sie zwischen den Flügeln und den Beinen schneiden.Legen Sie die dissezierten Körperteile der Puppe in den Tropfen Einbettmedium. Auf dem zweiten Objektträger sollten die Flügel und Beine gestreckt sein, und es sollte darauf geachtet werden, eine Überlappung der Gewebe so weit wie möglich zu vermeiden. Abschließend geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf ein Deckglas und legen es vorsichtig über die Probe, ohne übermäßigen Druck auszuüben.Dieses konfokale Mikrofoto von Immungefärbungen der Corton-Organe in einem Drittinstar-Larve zeigt ein gut gestrecktes Abdomensegment, in dem sieben der acht Corton-Organe deutlich sichtbar sind. Die fünf lateralen Organe, die gemeinsam das Penasco-Lipid-Organ bilden, ein einzelnes laterales Organ sowie eines der beiden ventralen Corton-Organe sind erkennbar. Die Neuronen des Corton-Organs sind mit dem neuronalen Marker, dem monoklonalen Antikörper 22C10, markiert und rot dargestellt.Das Ligamentkap und die Anheftungszellen sind mit Antifa-Tubulin 85 E markiert und in blau dargestellt. Die Kap- und Ligamentzellen sind zusätzlich mit einem cortikalen Hörorgan markiert. Spezifischer GFP-Reporter, der ein regulatorisches Element für das Delilah-Locus enthält.Hier sind die corti-typischen tonalen Organe an der ventralen radialen Ader in diesem konfokalen Mikroaufnahme eines 35 Stunden alten Puppenstadiums dargestellt. Die Neuronen sind mit dem neuronalen Marker 22C10 markiert und rot sowie in Panel B dargestellt. Die Ligament- und Haarzellen sind gemeinsam mit Antikörpern gegen Acetyliertes Tubulin 85E, die in blau und in Panel C dargestellt sind, sowie einem corti-typischen tonalen Organ gefärbt. Ein spezifisches GFP-Reporter-Transgen ist grün dargestellt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man propriozeptive Cortin-Organe sowohl in der Larve als auch im Puppenschnitt von oph sichtbar macht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass es für die Verwendung der beschriebenen Antikörper optimiert wurde. Unterschiedliche Antikörper können leicht abweichende Fixierungs- und Färbungsbedingungen erfordern.Daher sollte man bei Verwendung dieses Verfahrens mit verschiedenen Antikörpern die optimalen Bedingungen für die verwendeten Antikörper ermitteln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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