Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle
24. April 2012
Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K interagieren + (GIRK) Kanälen beschrieben. Der Test basiert Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe zu GIRK Kanal-Aktivität zu messen. Diese Technik eignet sich sowohl für den Einsatz auf einer Reihe von Zelllinien.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Medikamente zu identifizieren, die die Grk-Kanäle modulieren. Dies wird erreicht, indem die A TT 20-Zellen zunächst in der 96-Well-Platte plattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Testmassen mit dem Verset Liquid Plate Handling System zu verdünnen.
Als nächstes werden die verdünnten Testverbindungen mit Hilfe des Versets auf die Zellen aufgetragen. Der letzte Schritt besteht darin, die 96-Well-Platte in den Synergy Fluoreszenzplatten-Reader mit zwei Fluoreszenzplatten einzusetzen und die Kontroll- und Somatostatinlösungen in die Wells zu injizieren. Letztendlich wird der Fluoreszenzplatten-Reader verwendet, um die Verbindungen zu zeigen, die das Somatostatin-induzierte Fluoreszenzsignal verändern und so die Grk-Kanäle modulieren.
Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie der Patch-Clamp-Aufzeichnung besteht darin, dass eine große Anzahl von Verbindungen schnell gescreent werden kann, um festzustellen, ob sie Gerk-Kanäle modulieren. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Schmerzen, da Verbindungen, die den Gerk-Kanal aktivieren und zu einer Hemmung der nozizeptiven Übertragung von FI führen, identifiziert werden können. Die 96-Well-Platten und die Beschichtung der Zellen stammen von Maribel Vasquez.
Ein Student in meinem Labor: Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Hypophysenzellen A TT 20 in DMEM, ergänzt mit 10 % Pferdeserum, bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 züchten. Halten Sie die Kultur aufrecht, indem Sie die Zellen alle fünf bis sieben Tage nach einem Standardverfahren subkultivieren. Als nächstes die Vertiefungen mit dem schwarzen Klarlack beschichten.
Untere 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern Poly-L-Lysin. Lassen Sie die Vertiefungen 30 Minuten im Inkubator trocknen. Entfernen Sie dann überschüssige Poly-L-Lysin-Platte aus den Zellen in der 96-Well-Platte, die 200 Mikroliter Medium mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Well enthält.
Lagern Sie die Zellen danach drei bis vier Tage im Inkubator. Verwenden Sie eine Aspirationsanordnung, um das Kulturmedium langsam aus der Zellmonoschicht zu aspirieren, und waschen Sie dann die Zellen mit 200 Mikrolitern normaler Pufferlösung. Fügen Sie anschließend jeweils 200 Mikroliter Pufferlösung hinzu, die den membranpotentialempfindlichen Farbstoff enthält.
Inkubieren Sie die Zellen 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie nach 40 Minuten die A TT 20-Zellen aus dem Inkubator und lassen Sie sie wieder auf Raumtemperatur zurückkehren, saugen Sie den alten Puffer ab. Tragen Sie dann eine frische Pufferlösung, die das MPD enthält, auf die Zellen auf.
Als nächstes verwenden Sie das Liquid-Handling-System, um verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen und Kontrolllösungen auf die Zellen aufzutragen. In der 96-Well-Platte inkubieren die Zellen für fünf Minuten mit Testverbindungen zu den Fluoreszenzmessungen. Setzen Sie bei diesem Verfahren die 96-Well-Platte in einen Biotech-Synergy-Reader mit zwei fluoreszierenden Platten ein.
Erhalten Sie das fluoreszierende Hintergrundsignal bei einer Exsudationswellenlänge von 520 Nanometern und einer Missionswellenlänge von 560 Nanometern. Tragen Sie anschließend die G PCR R-Liganden oder die Kontrolllösung auf die Vertiefungen auf, um die GIR-Kanäle mit dem Synergy Zwei-Injektor-System zu aktivieren. Sammeln Sie dann die Datenpunkte in Zehn-Sekunden-Intervallen über einen 302. Stichprobenzeitraum.
Bei der Anregungs- und Emissionswellenlänge. Berechnen Sie den Z-Faktor, um die Zuverlässigkeit des Assays zu bestimmen. Z.Faktoren im Bereich von 0,5 bis 1,0 weisen darauf hin, dass die Qualität des Assays ausgezeichnet ist.
Platten mit Z-Faktoren unter 0,5 sind ausgeschlossen. Aus der Analyse geht hervor, dass Verbindungen, die das Fluoreszenzsignal modulieren, in Gegenwart von zwei Millimolaren Bariumchlorid oder 500 Nanomolaren Terapin Q erneut getestet werden, um die Spezifität des Kaliumkanals des nach innen gerichteten Gleichrichters zu bestätigen: hier ist ein repräsentatives HLB 0 2 1 15 2 Fluoreszenzsignal, gemessen über die Zeit in den A TT 20 Zellen unter Zugabe von Somatostatin oder Kontrolllösung. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität in der Y-Achse wurde berechnet, indem das Signal in Gegenwart von Somatostatin oder der Kontrolllösung durch das vor der Zugabe von Somatostatin oder Kontrolllösung gemessene Ausgangssignal dividiert wurde.
Hier ist die Behandlung der A TT 20 Zellen mit 500 Nanomolaren zu sehen. Terapin Q hemmt die durch Somatostatin vermittelte Abnahme des Fluoreszenzsignals, indem es zwei bindet und die G-Kanäle blockiert. Und hier ist die Behandlung der A TT 20-Zellen mit 20 mikromolaren Propafenon zu sehen, das auch die durch Somatostatin vermittelte Abnahme des Fluoreszenzsignals hemmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Medikamente identifizieren können, die Grk-Kanäle mit einem Fluoreszenzplatten-Reader modulieren.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen, die mit G-Protein-gesteuerten inwärtigen Gleichrichter-K+ (GIRK) Kanälen interagieren. Der Assay verwendet membranpotenzialempfindliche fluoreszierende Farbstoffe, um die GIRK-Kanalaktivität zu messen, was ihn für verschiedene Zelllinien anpassbar macht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Pharmakologie
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- GIRK-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle in der neuronalen Signalübertragung.
- Die Identifizierung von Modulatoren der GIRK-Kanäle kann zu neuen therapeutischen Strategien führen.
- Echtzeit-Assays verbessern die Effizienz des Wirkstoffscreenings.
- Fluoreszierende Farbstoffe bieten ein empfindliches Maß für die Kanalaktivität.
Zweck der Studie
- Um ein Verfahren zum Screening von Wirkstoffen zu entwickeln, die GIRK-Kanäle modulieren.
- Um ein Hochdurchsatzformat für die Prüfung mehrerer Verbindungen zu nutzen.
- Um das Verständnis der GIRK-Kanal-Pharmakologie zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Plattieren von A TT 20 Zellen in einer 96-Well-Platte.
- Verwendung des Verset-Flüssigkeitshandhabungssystems zum Verdünnen von Testverbindungen.
- Anwenden verdünnter Verbindungen auf Zellen mit dem Verset.
- Verwendung eines Synergy two Fluoreszenz-Plattenlesers zur Messung von Reaktionen.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Verbindungen, die somatostatininduzierte Signale verändern.
- Demonstration der Anpassungsfähigkeit des Assays an verschiedene Zelllinien.
- Erfolgreiche Modulation der GIRK-Kanalaktivität durch getestete Verbindungen.
- Validierung der Effektivität des Fluoreszenz-Plattenlesers beim Screening.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Assay ist ein wertvolles Werkzeug für die Wirkstoffforschung, die sich auf GIRK-Kanäle zielt.
- Echtzeit-Screening kann die Identifizierung potenzieller Therapeutika beschleunigen.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die klinischen Auswirkungen der identifizierten Verbindungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
