Name: Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Point-of-Care-Methode zur Bewertung der Enoxaparin-Wirkung auf die Blutgerinnung im Vollblut unter Verwendung von Heparinase. Diese Technik ermöglicht die Bestimmung der Basisgerinnungszeit.

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Die Untersuchungen wurden ausschließlich mit Unterstützung von Abteilungs-und institutionellen Ressourcen durchgeführt. Die Koagulation Apparat (Hemochron 801) wurde unverbindlich vom Hersteller ausgeliehen. Die Assay-Patronen wurden bei ihren Privatkunden die Kosten gekauft. Der einleitende Figur in dem Video wurde von Sanderink, et al geändert. 12 Die zweite Zahl in dem Video (Heparinase Aufschlusszeit natürlich) mit freundlicher Genehmigung von Inchiosa et al reproduziert wurde. 1

Ein. Heparinase Rekonstitution <ol><li> Lyophilisierte Heparinase I wird kommerziell (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) in Fläschchen mit 1 ug des gereinigten Proteins erhalten. Das Protein wird in 0,25 ml Salzlösung (0,9% NaCl) gelöst. </li></ol> 2. Entnahme von Blutproben <ol><li> Zwei Blutproben werden durch Vakuum in Natriumcitrat (0,3 ml 0,109 M; 3,2%) gezogen gepufferten Vacutainer-Röhrchen (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); die Rohre sowohl im Vorauflauf-Spike mit einer bekannten Konzentration von Enoxaparin, das Blutvolumen daß gezogen beträgt 2,7 ml. Der gesamte Inhalt ist dann 3,0 ml. </li></ol> 3. Heparinase Verdauung <ol><li> Der gesamte Inhalt des Fläschchens, die der Heparinase in eine Spritze (etwa 0,2 ml, 80% des Fläschchens; 0,8 ug Protein) abgesaugt werden kann, wird einem Vacutainer-Röhrchen überführt; 0,2 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wird zugegeben das zweite Rohr, das als basel dientine Zustand vor Eliminierung der Enoxaparin-Effekt. </li><li> Beide Vacutainer-Röhrchen werden in den Vertiefungen der thermostatisierten Hemochron Vorrichtung für einen Zeitraum von 5 min gegeben. (Die Angemessenheit einer 5 min Kochzeit mit Heparinase wurde in unserer bisher veröffentlichten Arbeiten etabliert. 1) </li></ol> 4. Gerinnungstests <ol><li> Am Ende des Heparinase Inkubation wird 2,0 ml Blut zur Probeneinsätzen übertragen. Im Fall des MAA Rohr, ist es mit 0,1 ml 250 mM CaCl 2, um die Koagulation zu initiieren vorgefüllt. Die kommerzielle aPTT Probeneinsätzen (A104) zur Einleitung in Vollblutgerinnungszeit das geworden Vacutainer-Röhrchen enthalten Natriumcitrat als Antikoagulans gezogen. </li><li> Die Hemochron Gerät signalisiert den Abschluss der Blutgerinnung und bewahrt die Gerinnungszeiten in Sekunden. Der Unterschied in der Gerinnungszeiten zwischen der Heparinase-behandelten Probe und der Ausgangsprobe, die Gerinnungszeit ti geteiltme für die Baseline Probe, ergibt die prozentuale Abnahme durch Eliminierung von Enoxaparin. Wie unten diskutiert, haben starke lineare Korrelationen für die Beziehung zwischen prozentuale Abnahme der Gerinnungszeit und der Konzentration von Enoxaparin in versetzten Proben aus Vollblut, sowie für die Korrelation mit den gemessenen Konzentrationen von Enoxaparin durch die chromgenic worden Assay der Anti-Xa erhalten Aktivität. Anti-Xa-Assays von Enoxaparin Konzentration wurden mit einem kommerziellen Kit für einen zweistufigen chromogenen Assay (; Aniara, Mason, OH BIOPHEN) durchgeführt. </li></ol>

<ol><li>Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+development+of+a+point-of-care+assay+of+enoxaparin+anticoagulant+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).</li>
<li>Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+prolongs+activated+and+nonactivated+whole+blood+clotting+time+and+potentiates+the+effect+of+heparin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro.</a> Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).</li>
<li>Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+protamine+excess+on+blood+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays.</a> Anesth Analg. 96, SCA39(2010).</li>
<li>Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+low+plasma+levels+of+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin.</a> Anesth Analg. 102, SCA10(2010).</li>
<li>Gogarten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+new+antithrombotic+drugs+on+regional+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia.</a> Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).</li>
<li>Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+of+different+low-molecular+weight+heparins+used+at+therapeutic+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose.</a> Drug Saf. 28, 333-349 (2005).</li>
<li>Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+of+enoxaparin+among+obese+and+renal+impairment+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients.</a> Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).</li>
<li>El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+HEMOCHRON+JR.+HEMONOXTM+point+of+care+test+in+monitoring+the+anticoagulant+effect+of+enoxaparin+during+interventional+coronary+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).</li>
<li>Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+anticoagulant+activities+of+the+low+molecular+weight+heparin+fractions+and+fragments+with+flavobacterial+heparinase%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase.</a> Thromb Res. 44, 599-610 (1986).</li>
<li>Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+individuality+of+commercially+available+low-molecular-weight+heparins+and+their+generic+versions%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).</li>
<li>Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anticoagulant+heparinoids+by+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling.</a> Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).</li>
<li>Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+the+prophylactic+dose+of+enoxaparin+once+daily+over+4+days+in+patients+with+renal+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment.</a> Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Assay von Enoxaparin Wirksamkeit kann als eine wichtige Option, um die relative Sicherheit der Durchführung einer invasiven Prozedur, die eine Begleitperson Blutungsrisiko oder Entwicklung eines Hämatoms ist festzustellen, dienen. Dies wäre besonders wichtig sein, wenn ein Epiduralinjektion erwogen wird. Die Mehrheit der Leitlinien empfehlen eine Wartezeit von 12 Stunden zwischen Injektion von Enoxaparin und Einleitung einer invasiven Verfahren fünf Nierenfunktion, Adipositas und Schwangerschaft kann die Dosierung Anforderungen der Enoxaparin beeinflussen 6,7 Da der Test innerhalb von 10 abgeschlossen werden kann.. - min Zeit, es könnte auch in einer Klinik oder Arztpraxis, wo sie Informationen über die Angemessenheit der Antikoagulation bei Patienten, bei denen ein Risiko der Entwicklung von venösen Thromboembolien sind bieten würde verwendet werden. Sofortige Dosisanpassung könnte eingeleitet werden, je nach Bedarf. Die Enoxaparin-Konzentration im Plasma kann durch einen chromogenen einem gemessen werdenssay des Ausmaßes der Hemmung des Koagulationsfaktor, Xa. Allerdings ergibt dies nur seine Konzentration, die nicht speziell ihre gerinnungshemmende Wirkung, die weit variiert zwischen den einzelnen Patienten. 6-8 Unsere Untersuchungen wurden nur mit Enoxaparin durchgeführt. Es kann jedoch davon ausgegangen, dass der Assay irgendeinem NMH, die abgebaut Heparinase I. Dieses ist bereits bekannt, der Fall für Dalteparin, Nadroparin und Tinzaparin sein soll angewandt werden könnte. 9-11 Wir haben das Assay in Bezug auf die Merkmale Das HEMOCHRON Gerinnungszeit Instrument. Das Instrument ist relativ kostengünstig, auch die Einweg-Blutentnahmeröhrchen, Heparinase Ampulle, und Assay-Patronen, eine Analyse für einen Patienten ist etwa 15 $ abzuschließen. Somit wäre es zu erwarten, dass geeignet ist, den Status Antikoagulans in verschiedenen klinischen Situationen zu überwachen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hepzyme </td><td> Siemens </td><td> B4240 </td><td> Heparinase I </td></tr><tr><td> &quot;MAA&quot; Patrone </td><td> Technidyne </td><td> FTK-ACT </td><td> modifiziert durch Kaolin Entfernen </td></tr><tr><td> aPTT Patrone </td><td> Technidyne </td><td> A104 </td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle point-of-care-test von enoxaparin gerinnungshemmer wirksamkeit im vollblut

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Es besteht das Bedürfnis nach einem klinischen Assay, um den Umfang, in dem Blut eines Patienten wirksam von der niedrigen Molekulargewicht-Heparin (LMWH), Enoxaparin ist antikoaguliert bestimmen. Es gibt auch dringende klinischen Situationen, wo es wichtig sein würde, wenn diese schnell ermittelt werden konnte. Der vorliegende Assay wurde entwickelt, um dies zu erreichen. Wir nur getestet menschlichen Blutproben, die mit bekannten Konzentrationen von Enoxaparin versetzt wurden. Das wesentliche Merkmal des vorliegenden Tests ist die Quantifizierung der Wirksamkeit von Enoxaparin in einer Blutprobe des Patienten durch Abbau von Inaktivität es mit Heparinase abzuschließen. Die mit Enoxaparin versetzt wurden; zwei Blutproben in Vacutainer-Röhrchen (Franklin Lakes, NJ Becton-Dickenson); gezogen wurden eine Probe wurde mit Heparinase für 5 min bei 37 ° C verdaut, repräsentiert die andere Probe des Patienten Basislinie antikoaguliertem Status. Die prozentuale Verkürzung der Gerinnungszeit in der Heparinase-behandelten Probe, wie zum Vergleich baseline Staat, ergab die gerinnungshemmende Beitrag von Enoxaparin. Wir verwendeten die tragbare, batteriebetriebene Hemochron 801 Vorrichtung zur Messung von Gerinnungszeiten (International Corp Technidyne, Edison, NJ). Die Vorrichtung hat zwei thermostatisch gesteuerten (37 ° C) Assay Rohrbrunnen. Wir haben die Assays in zwei Arten von Kassetten, die Assay beim Hersteller des Gerätes sind. Eine Patrone wurde modifiziert, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Wir entfernten das Kaolin aus der FTK-ACT Kartusche durch umfangreiche Spülen mit destilliertem Wasser, so dass nur die Glasoberfläche des Rohres, und vielleicht die Detektion Magneten als Aktivatoren. Wir nannten diese unsere minimal aktiviert Assay (MAA). Die Verwendung eines minimal aktiviert Assay wurde von uns und anderen untersucht. 2-4 Die zweite Patrone, die untersucht wurde eine aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) Assay (A104). Dies wurde als geliefert vom Hersteller verwendet. Die thermostatisiert Brunnen des Instruments werE für sowohl die Heparinase Verdauung und Koagulation Assays verwendet. Der Assay kann innerhalb von 10 min abgeschlossen. Der MAA-Assay zeigte robuste Veränderungen Gerinnungszeit nach Heparinase Verdauung von Enoxaparin über einen typischen klinischen Konzentrationsbereich. Mit 0,2 Anti-Xa IU pro ml Enoxaparin Blutprobe, verursacht Heparinase Verdauung eine mittlere Abnahme von 9,8% (20,4 sec) in Gerinnungszeit; bei 1,0 IU pro ml Enoxaparin gab es eine 41,4% ige Abnahme (148,8 sec). Dieser Bericht nur präsentiert die experimentelle Anwendung des Assays, dessen Wert in einem klinischen Umfeld muss noch eingerichtet werden.

Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse für die Beziehungen zwischen der prozentualen Abnahme der Gerinnungszeit nach der Eliminierung von Enoxaparin mit Heparinase für eine Reihe von Dornen Konzentrationen von Enoxaparin (0,2, 0,4 und 1,0 Anti-Xa-IE pro ml). Die Ergebnisse werden sowohl für die MAA und aPTT Probeneinsätze vorgestellt. Die gemessenen Konzentrationen an Enoxaparin von chromogenen Assay von Anti-Xa-Aktivität sind ebenfalls in der Abszisse jeder Parzelle enthalten. Abbildung 2 zeigt Diagramme der gleichen Daten wie prozentuale Abnahme der Gerinnungszeit vs chromogenen Maß für Anti-Xa-Aktivität. Starke lineare Korrelationen, mit hoher statistischer Signifikanzen wurden für alle vier Beziehungen gefunden. <img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Point-of Care Bestimmungen Enoxaparin contribution um Gerinnungszeiten spiked Vollblut auf prozentuale Veränderung (Verkürzung) der Gerinnungszeit nach Inkubation mit Heparinase basiert. Die Stachelwalze Enoxaparin Konzentrationen zugegeben, um Vollblut und die gemessenen Anti-Xa-Plasmakonzentrationen (Mittelwert ± SE, in Klammern) sind in der Abszisse des Graphen angeordnet. Alle Änderungen in Prozent Gerinnungszeiten sind als Mittelwert und SE dargestellt, zusammen mit dem durchschnittlichen Verkürzung der Gerinnungszeit in Sekunden. Daten von dem gleichen Patienten sind durch gestrichelte Linien verbunden sind. Die Daten für die vier Patienten mit Sternchen in der Handlung identifiziert A (MAA Ergebnisse) sind die gleichen wie die vier Patienten in Kurve B (aPTT-Assays). Alle Ergebnisse stellen Einzelbestimmungen. Die Pearson Korrelationskoeffizienten r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) und r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) für die Beziehungen mit dem MAA und aPTTassay sind. Wiedergabe mit Genehmigung aus Inchiosa et al. 1 . Abbildung 2 Die Ergebnisse für die prozentualen Veränderungen der Gerinnungszeiten in den Point-of-Care-Tests in 1A &amp; B gezeigt werden gegen Plasma Anti-Faktor-Xa Konzentrationen aufgetragen A, MAA Ergebnisse;. B, aPTT-Assays. Alle Ergebnisse sind aus einzelnen Gerinnungszeit-Assays und einzelne Bestimmungen der Anti-Faktor-Xa-Konzentrationen. Die Pearson Korrelationskoeffizienten r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) und r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) für die Beziehungen mit dem MAA-und aPTT-Assay, jeweils mit Zustimmung Inchiosa et al wiedergegeben. 1

Demonstration einer raschen quantitativen Assay der Hemmung der Blutgerinnung durch den niedrigen Molekulargewicht-Heparin, Enoxaparin. Der Beitrag von Enoxaparin durch Entfernen seinen Einfluss durch Verdauung mit Heparinase beurteilt. Eine umfassendere Beschreibung des Tests wird in unserer veröffentlichten Papier detailliert.<sup&gt; 1</sup&gt; Der Test erfordert noch klinische Bestätigung.

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

Es besteht die Notwendigkeit eines klinischen Assays, um festzustellen, in welchem Maße das Blut eines Patienten durch die ... effektiv antikoaguliert ist.

Einführend verweisen wir hier auf veröffentlichte Arbeiten zum Zeitverlauf der Plasmaspiegel des niedermolekularen Heparins Enoxaparin bei menschlichen Probanden. Heute präsentieren wir unsere Ergebnisse mit einem schnellen Point-of-Care-Assay für niedermolekulares Heparin. In diesem Fall handelt es sich bei der Substanz um Enoxaparin.Die auf dieser Folie gezeigten Ergebnisse zeigen die Plasmakonzentration bei Patienten, die das Medikament chronisch einmal täglich mit 40 Milligramm pro Tag erhalten haben, sowie den zeitlichen Verlauf nach der letzten Gabe bis zum weiteren Verschwinden. Man erkennt, dass etwa vier Stunden nach der Verabreichung eine maximale Konzentration von 0,4 internationalen Einheiten pro ml erreicht wird, wobei dieser Wert innerhalb des therapeutischen Bereichs des Wirkstoffs liegt. Ein besonderer Aspekt von Interesse ist jedoch, wie viel 12 Stunden nach der Verabreichung noch verbleibt, da es eine klinisch anerkannte Leitlinie gibt, nach der man mindestens 12 Stunden nach der Gabe von niedermolekularem Heparin – in diesem Fall Enoxaparin – warten sollte, bevor man bestimmte invasive Eingriffe durchführt, die ein Blutungsrisiko darstellen könnten. Für uns ist es von Bedeutung, dass zu diesem Zeitpunkt noch eine deutlich nachweisbare Menge vorhanden ist, und wir haben uns in einigen unserer Studien darauf konzentriert, wie wir noch zeigen werden.Auch in dieser Arbeit von Sender et al. wird dargestellt, dass Personen mit Nierenfunktionsstörung über den gesamten Zeitverlauf deutlich höhere Arzneimittelkonzentrationen aufweisen, und wir sehen, dass die 12-Stunden-Richtlinie im Fall eines Patienten mit Nierenfunktionsstörung oder wie bekannt bei einer schwangeren Frau oder bei adipösen Patienten möglicherweise sehr unzureichend ist. Ich möchte die Wissenschaftler vorstellen, die an diesem Projekt am New York Medical College beteiligt waren. Mein Name ist Mario Osa.Ich bin hier Professor für Pharmakologie. Ich bin Dr. Surya Patula, außerordentlicher Professor für klinische Anästhesiologie am New York Medical College. Mein Name ist Keshar Kal.Ich bin Medizinstudent im dritten Jahr. Dies ist die Apparatur, die wir für diese Assays verwenden. Die Apparatur wird von der Omicron Corporation hergestellt.Er kann entweder netzbetrieben oder mit Batterie betrieben werden und ist daher in diesem Sinne wirklich ein Point-of-Care-Gerät. Die Vorrichtung verfügt über zwei thermostatisch geregelte Kammern, die wir für eine Vorinkubation der Proben während der Vorbereitung des eigentlichen Assays sowie für den Gerinnungsassay selbst nutzen. Ein wesentliches Merkmal des Assays ist die Verwendung einer hochreinen, im Handel erhältlichen Heparinase-Zubereitung.Wir haben dies von der Firma Siemens bezogen. Es liegt in einer sehr stabilen Form vor und ist leicht löslich in Kochsalzlösung oder jeder anderen wässrigen Lösung. Die Verwendung von Heparin-ACE ist in unserem Ansatz besonders wertvoll, da sie es uns ermöglicht, den Ausgangswert der Gerinnung des Patienten zu ermitteln.Ohne jeglichen Einfluss von Heparin kann ACE niedermolekulares Heparin und unfraktioniertes Heparin vollständig abbauen, doch unser besonderes Interesse gilt hier dem niedermolekularen Heparin, das inaktiviert werden soll, um einen Wert für die Gerinnungszeit ohne jeglichen Einfluss von Heparin zu erhalten. Dargestellt wird hier der zeitliche Verlauf des Abbaus von niedermolekularem Heparin, in diesem Fall Enoxaparin durch Heparinase. Die Daten sind als Prozentsatz der Ausgangs-Schnittzeit dargestellt, sodass wir hier sehen, dass Enoxaparin in einer Menge von einem Anti-10 zugegeben wurde.Internationale Einheiten pro ml verursachen eine etwa 50 %ige Verlängerung der Blutgerinnungszeit. Danach beobachten wir nach unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Heparinase bei 37 Grad Celsius, wie lange die Wiederherstellung der Ausgangsgerinnungszeiten dauert. Mit anderen Worten: den vollständigen Abbau von Enoxaparin bis zur Inaktivität.Hinsichtlich der antikoagulativen Wirkung sehen wir, dass bereits nach anderthalb Minuten im Wesentlichen eine 100 %ige Wiederherstellung der Ausgangswerte der Gerinnungszeit erreicht ist. Nach Prüfung dieses Zeitverlaufs entschieden wir uns dafür, fünf Minuten Inkubationszeit als Standardvorinkubation des Blutes vor der Messung der Gerinnungszeit zu verwenden.Die Teströhrchen für diesen Point-of-Care-Test wurden geringfügig gegenüber der Form, in der wir sie vom Hersteller erhalten, verändert. Diese Röhrchen enthielten ursprünglich den Aktivator Kaolin, der für die Bestimmung der aktivierten Gerinnungszeit vorgesehen ist. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung des Röhrchens ohne Aktivator die Empfindlichkeit erheblich steigert.Wir bezeichnen dies als unseren minimal aktivierten Assay, da wir der Ansicht sind, dass die einzige mögliche Aktivierungsquelle nun die Glasoberfläche des Röhrchens und möglicherweise der Magnet sein könnte. Der Magnet ist der wesentliche Bestandteil des automatisierten Assays. Diese Röhrchen rotieren in den Röhrchenbrunnen, und wenn der Magnet durch ein Gerinnsel einer bestimmten Dichte eingefangen wird, wodurch seine Bewegung verloren geht, wird dies erfasst und signalisiert das Ende der Gerinnung.Wir haben das Assay auch mit der Omicron-Aktivierten partiellen Thromboplastinzeit-Kartusche untersucht. Das Assay wird auf identische Weise durchgeführt. In diesem System ist eine geringfügig stärkere Aktivierung vorhanden.Unser erster Schritt besteht darin, die Lilien-Heparinase wiederherzustellen, da wir sie in ihrem Fläschchen erhalten. Wir geben 0,25 ml Kochsalzlösung in das Fläschchen und lassen anschließend etwa 20 Sekunden für eine vollständige Auflösung. Danach saugen wir den gesamten Inhalt des Fläschchens in eine Tuberkulinspritze auf, wobei wir im nächsten Schritt gewöhnlich etwa 0,2 ml zurückgewinnen.Zusätze für die Vorinkubation werden frisch entnommenen Blutproben mit Enoxaparin in Dreimilliliter-Vakutainer-Röhrchen hinzugefügt. Die erste Zugabe betrifft Heparinase und erfolgt zeitgleich mit dem Mischen. Danach folgt die Zugabe von 0,2 ml Kochsalzlösung zu dem Röhrchen mit Enoxaparin, jedoch ohne Heparinase, um ein vergleichbares Gesamtvolumen VO zu erreichen.Wir verwenden den integrierten Timer des Geräts, um die 300 Sekunden rückwärts zu zählen. Das entspricht fünf Minuten Vorinkubation. Die Vakuumröhren werden entfernt, sobald die Vorinkubation abgeschlossen ist.Der letzte Schritt besteht darin, zwei ml der vorinkubierten Proben in unsere minimal aktivierten Testr&ouml;hrchen zu &uuml;bertragen. Diese R&ouml;hrchen sind mit hundert Mikrolitern 0,25-molarer Calciumchloridl&ouml;sung vorbef&uuml;llt, um die Gerinnung einzuleiten. Dieses erste R&ouml;hrchen wurde zuvor mit Heparinase vorinkubiert.Die zweite Probe enth&auml;lt Enoxaparin, jedoch kein Heparinase. Die Timer zeigen die verstrichene Zeit seit der Zugabe von Calciumchlorid an, und wir k&ouml;nnen nun sehen, dass die erste Probe fertig ist. Das ist das obere Gef&auml;&szlig; mit 200 Sekunden, die f&uuml;r den Abschluss der Gerinnung ben&ouml;tigt wurden.Die Probe, die keine Heparinase enthält, benötigt eine längere Zeit und ist nun abgeschlossen. Dies ist eine Simulation unseres typischen Ergebnisses mit Blut, das mit 0,4 internationalen Einheiten Enoxaparin pro ml versetzt wurde. Das entspricht einer Verkürzung der Gerinnungszeit um etwa 45 Sekunden bei dieser Enoxaparin-Konzentration oder einer Abnahme der Gerinnungszeit um 18 %.Wie zu sehen ist, erfolgt die Gerinnungserkennung automatisch, und die Zeiten werden am Gerät gespeichert, bis die Untersuchung abgeschlossen ist. Wir sollten erwähnen, dass wir diesen Assay tatsächlich bei einer niedrigeren Konzentration von 0,1 internationalen Einheiten Enoxaparin pro ml getestet haben. Wie wir in der Einleitung angemerkt haben, entspricht dies der Konzentration, die 12 Stunden nach einer typischen therapeutischen Dosis Enoxaparin vorhanden sein könnte.Wir konnten bei dieser Konzentration ebenfalls zuverlässig nachweisen.

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