Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

Demonstration einer raschen quantitativen Assay der Hemmung der Blutgerinnung durch den niedrigen Molekulargewicht-Heparin, Enoxaparin. Der Beitrag von Enoxaparin durch Entfernen seinen Einfluss durch Verdauung mit Heparinase beurteilt. Eine umfassendere Beschreibung des Tests wird in unserer veröffentlichten Papier detailliert.

Einleitend verweisen wir hier auf publizierte Arbeiten über den zeitlichen Verlauf der Plasmaspiegel des niedermolekularen Heparins Enoxaparin beim Menschen. Wir demonstrieren heute unsere Ergebnisse mit einem schnellen Point-of-Care-Assay für niedermolekulares Heparin. In diesem Fall handelt es sich um Enoxaparin.

Die auf dieser Folie gezeigten Ergebnisse zeigen die Plasmakonzentration bei Patienten, die das Medikament chronisch einmal täglich erhalten haben, 40 Milligramm pro Tag, und die Zeit, die die letzte Verabreichung bis zum weiteren Verschwinden gekostet hat, kann dann sehen, dass etwa vier Stunden nach der Verabreichung eine Spitzenkonzentration von 0,4 internationalen Einheiten pro ML erreicht wird. und dieses Niveau liegt innerhalb des therapeutischen Bereichs des Arzneimittels. Ein Punkt von besonderem Interesse ist jedoch auch, wie viel 12 Stunden nach der Verabreichung verbleibt, da es eine klinisch anerkannte Richtlinie gibt, dass man mindestens 12 Stunden nach der Verabreichung von niedermolekularem Heparin, in diesem Fall Enoxaparin, warten sollte, bevor man sich einem besonders invasiven Eingriff unterzieht, der zu einem Blutungsrisiko führen kann. Für uns ist interessant, dass zu diesem Zeitpunkt noch eine deutlich nachweisbare Menge vorhanden ist, und darauf haben wir uns in einigen unserer Studien konzentriert, wie wir zeigen werden.

In dieser Arbeit wird auch die Tatsache vorgestellt, dass Personen mit Nierenfunktionsstörung im Laufe des Zeitverlaufs erheblich höhere Spiegel des Arzneimittels aufweisen, und wir sehen, dass die 12-Stunden-Richtlinie im Falle eines Patienten mit Nierenfunktionsstörung oder wie es bei einer Frau, die schwanger ist, oder bei Patienten, die fettleibig sind, sehr unzureichend sein könnte. Ich möchte die Forscher vorstellen, die an diesem Projekt am New York Medical College beteiligt waren. Mein Name ist Mario Osa.

Ich bin hier Professor für Pharmakologie. Ich bin Dr. Surya Patula, außerordentlicher Professor für klinische Anästhesiologie am New York Medical College. Mein Name ist Keshar Kal.

Ich studiere Medizin im dritten Jahr. Dies ist das Gerät, das wir für diese Assays verwenden. Das Gerät wird von der Omicron Corporation hergestellt.

Es kann entweder netz- oder batteriebetrieben verwendet werden, und ist somit in diesem Sinne wirklich ein Point-of-Care-Modus. Das Gerät verfügt über zwei thermostatisch gesteuerte Kompartimente, die wir sowohl für eine Vorinkubation der Proben in der Vorbereitung auf den eigentlichen Assay als auch für den Gerinnungsassay selbst verwenden. Ein wesentliches Merkmal des Assays ist die Verwendung eines hochgereinigten, kommerziell erhältlichen Präparats der Heparinase.

Diese haben wir vom Siemens-Konzern erworben. Es wird in einer sehr stabilen Form geliefert und ist in Kochsalzlösung oder jeder wässrigen Lösung leicht löslich. Die Verwendung von Heparin ACE ist in unserem Ansatz besonders wertvoll, da wir so den Gerinnungswert des Patienten ermitteln können.

In Abwesenheit jeglichen Einflusses von Heparin, Heparin, ACE ist in der Lage, niedermolekulares Heparin und unfraktioniertes Heparin vollständig abzubauen, aber unser besonderes Interesse gilt hier dem niedermolekularen Heparin und dem Abbau bis zur Inaktivität und der Erzeugung eines Wertes für die Gerinnungszeit in Abwesenheit jeglichen Einflusses von Heparin. Was wir hier veranschaulichen, ist der zeitliche Verlauf des Abbaus von niedermolekularem Heparin, in diesem Fall Enoxaparin durch Heparinase. Die Daten sind als Prozentsatz der Ausgangszeit aufgetragen, so dass wir hier sehen, dass Enoxaparin bei einem Anti-10 hinzugefügt wurde.

Eine internationale Einheit pro ML bewirkt eine Verlängerung der Gerinnungszeit des Blutes um ca. 50%. Nach unterschiedlichen Inkubationsperioden mit Heparinase bei 37 Grad Celsius sehen wir dann den Zeitaufwand für die Wiederherstellung der Gerinnungszeiten zu Studienbeginn. Mit anderen Worten, der vollständige Abbau von Enoxaparin bis zur Inaktivität.

In Bezug auf die gerinnungshemmende Wirkung sehen wir das bereits nach eineinhalb Minuten. Es gibt im Wesentlichen eine 100%ige Wiederherstellung der anfänglichen Gerinnungszeit. Nach der Überprüfung dieses Zeitverlaufs entschieden wir uns für eine fünfminütige Inkubation als Standard vor der Inkubation des Blutes vor der Messung der Gerinnungszeit.

Die Analyseröhrchen für diesen Point-of-Care-Assay wurden gegenüber der Art und Weise, wie wir sie vom Hersteller erhalten, leicht modifiziert. Diese Röhrchen enthielten ursprünglich den Aktivator Kaolin, das zur Messung der aktivierten Gerinnungszeit vorhanden ist. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung der Tube ohne Aktivator ihre Empfindlichkeit erheblich erhöht.

Wir haben dies unseren minimal aktivierten Assay genannt, weil wir der Meinung sind, dass die einzig mögliche Aktivierungsquelle jetzt die Glasoberfläche des Röhrchens und vielleicht der Magnet wäre. Der Magnet ist der wesentliche Bestandteil des automatisierten Assays. Diese Röhren rotieren in den Röhrenvertiefungen, und wenn der Magnet von einem Dichteklumpen eingeschlossen wird, was zu seinem Bewegungsverlust führt, wird dies erkannt und signalisiert den Abschluss der Koagulation.

Wir untersuchten den Assay auch mit der Omikron-aktivierten partiellen Thrombo-Platin-Zeitpatrone. Die Untersuchung wird auf die gleiche Weise durchgeführt. In diesem System ist etwas mehr Aktivierung vorhanden.

Unser erster Schritt besteht darin, die Lilien-Heparinase so zu rekonstituieren, wie wir sie in ihrem Fläschchen erhalten. Wir geben 0,25 ml Kochsalzlösung in das Fläschchen und warten dann etwa 20 Sekunden bis zur vollständigen Auflösung. Als nächstes aspirieren wir den gesamten Inhalt des Fläschchens in eine Tuberkulinspritze und gewinnen in diesem nächsten Schritt in der Regel etwa 0,2 ml zurück.

Zusätze für die Vorinkubation werden zu frisch entnommenen Blutproben gegeben, die Enoxaparin in drei ml Vacutainer-Röhrchen enthalten. Die erste Auflage repräsentiert die Heparinase und die wird zu diesem Zeitpunkt gemischt. Im Folgenden handelt es sich um die Zugabe von 0,2 ml Kochsalzlösung zu dem Röhrchen, das Enoxaparin, aber keine Heparinase für ein vergleichbares VO-Gesamtvolumen enthält.

Wir nutzen den eingebauten Timer des Instruments, um die 300 Sekunden herunterzuzählen. Das sind fünf Minuten Vorinkubation. Die Vakuumröhren werden entfernt, wenn die Vorinkubation abgeschlossen ist.

Der letzte Schritt ist der Transfer von zwei ml der vorinkubierten Proben in unsere minimal aktivierten Analyseröhrchen. Diese Röhrchen sind mit hundert Mikrolitern 0,25 molaren Calciumchlorid vorgefüllt, um die Gerinnung einzuleiten. Diese erste Röhre ist diejenige, die mit Heparinase vorinkubiert wurde.

Die zweite Probe enthält Enoxaparin, aber keine Heparinase. Die Timer drücken die abgelaufene Zeit seit der Zugabe von Calciumchlorid aus, und wir können jetzt sehen, dass die erste Probe vollständig ist. Das ist das obere Fläschchen mit 200 Sekunden, das für den Abschluss der Gerinnung erforderlich ist.

Die Probe, die keine Heparinase enthielt, wird länger fortgesetzt und ist jetzt fertig. Dies ist eine Simulation unseres typischen Ergebnisses mit Blut, das mit 0,4 internationalen Einheiten Enoxaparin pro ml gespickt ist. Das ist etwa eine Verkürzung der Gerinnungszeit um 45 Sekunden bei dieser Konzentration von Enoxaparin oder eine Verringerung der Gerinnungszeit um 18 %.

Wie zu sehen ist, ist die Gerinnungserkennung automatisiert und die Zeiten bleiben auf dem Gerät erhalten, bis die Inspektion abgeschlossen ist. Wir sollten erwähnen, dass wir diesen Assay tatsächlich in einer niedrigeren Konzentration von als 0,1 internationalen Einheiten Enoxaparin pro ml getestet haben. Wie wir in der Einleitung erwähnt haben, handelt es sich hierbei um die Konzentration, die 12 Stunden nach einer typischen therapeutischen Dosis von Enoxaparin vorhanden sein kann.

Auch in dieser Konzentration konnten wir zuverlässig nachweisen.