Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine embryonale Fibroblasten herzustellen, die geeignet sind, humane embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst jedes Embryo getrennt und der Kopf sowie die roten Organe entfernt werden. Anschließend wird das Gewebe fein zerkleinert und verdaut.

Anschließend werden die Zellen ausplattiert, mit drei bis vier Embryonen pro Kolben, und vermehrt. Schließlich werden die inaktivierten Mythe zur Herstellung des konditionierten Mediums verwendet. Letztendlich kommt e LSA zum Einsatz, um die optimale Konzentration von aktivem In im konditionierten Medium nachzuweisen, das das undifferenzierte Wachstum pluripotenter Stammzellen unterstützt.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Verfahren standardisiert werden muss, um hochwertige embryonale Mausfibroblasten zu erzeugen, die das undifferenzierte Wachstum sowohl humaner embryonaler Stammzellen als auch induzierter pluripotenter Stammzellen ermöglichen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Isolierung und Dissektion des Embryos schwer zu erlernen sind, weil der Umgang mit dem Mausembryo bestimmte manuelle Fähigkeiten erfordert. Die Durchführung der Methode demonstriert Dr. Justina Suk, eine Postdoktorandin in meinem Labor, sowie die Doktorandin Caterina Dres.

Nachdem eine trächtige Maus am 13. oder 14. Tag post coitum getötet und die Uterushörner herauspräpariert wurden, spült man diese kurz in 70 %igem Ethanol und legt sie unter aseptischen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube in ein Falcon-Röhrchen mit PBS. Die Uterushörner werden in eine Petrischale gegeben und jedes Embryo wird von seiner Plazenta und der embryonalen Hülle getrennt. Kopf und rote Organe werden entfernt, die verbleibenden Embryostücke mit PBS gewaschen und mit einem sterilen Rasiermesser in eine saubere Petrischale überführt.

Schließlich das Gewebe fein hacken, bis es pipettierbar wird. Danach ein Milliliter 0,05 %iger Trypsin in EDTA und 100 K-Einheiten pro Embryo an DNase I hinzufügen. Anschließend das Gewebe in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach jeweils fünfminütiger Inkubation die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lösen. Die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von etwa einem Volumen frisch zubereitetem meth.Medium inaktivieren. Die Zellen fünf Minuten bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in warmem Meth-Medium. Bereiten Sie 0,2 % Gelatin-beschichtete Kolben vor und inkubieren Sie sie mindestens zwei Stunden lang. Platten Sie die Zellen von etwa drei bis vier Embryonen bei Raumtemperatur in jeden 0,2 % Gelatin-beschichteten Kolben aus. Die Fibroblasten sind die einzigen Zellen, die in der Lage sind, an die gelatinbeschichteten Kolben zu binden.

Nach etwa 24 Stunden, wenn die Zellen 80 bis 90 % Konfluenz erreicht haben, einige Zellen bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Die verbleibenden Zellen zur späteren Verwendung bis Passage drei oder Passage vier weiterkultivieren. Um Fütterungszellen mit den Passage-drei-Passage-vier-Maßstäben vorzubereiten, beginnen Sie damit, T150-Flaschen mit 0,2 % Gelatine zu beschichten und mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Vermischen Sie Mitomycin C mit PBS und filtrieren Sie die Lösung durch einen Spritzenfilter. Aspirieren Sie das Medium von den Meth und waschen Sie sie mit PBS ohne Calcium oder Magnesium. Geben Sie 20 Milliliter Medium, das 10 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C enthält, auf die Maths und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Als Nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und trypsieren sie. Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen in Meth-Medium, zentrifugieren sie anschließend und resuspendieren sie in warmem Meth-Medium. Impfen Sie die Zellen mit einer Dichte von 56.000 Zellen pro Quadratzentimeter in T-150-Flaschen aus und inkubieren Sie sie über Nacht am Tag nach der Aussaat der Meth-Zellen.

Ersetzen Sie das Kulturmedium durch HESC-unbedingtes Medium, ergänzt mit frischen vier Nanogramm pro Milliliter FGF zwei, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. 24 Stunden später sammeln Sie das konditionierte Medium aus den Kolben und ersetzen es durch frisches HESC-Medium. Lagern Sie das gesammelte Medium bei minus 20 Grad Celsius.

Wiederholen Sie die Sammlung insgesamt sechs Tage lang nach der sechsten Sammlung. Vereinigen Sie das gesamte Medium und filtrieren Sie es. Anschließend lagern Sie es in Aliquots zu je 50 Milliliter bei minus 80 Grad Celsius ein.

Um die aktive Form von a im konditionierten Medium zu messen, bringen Sie alle Proben und Reagenzien auf Raumtemperatur. Verdünnen Sie den aktiven a-Antikörper in PBS mit 1 % BSA und geben Sie 100 Mikroliter in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Inkubieren Sie nach 24 Stunden über Nacht bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBST. Anschließend blockieren Sie die Vertiefungen eine Stunde bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine aktive Standardkurve vor, die sieben Verdünnungen und eine Blindprobe umfasst, mit einem Arbeitsbereich von 0,25 bis 32 Nanogramm pro Milliliter.

Geben Sie Duplikate der Standards und Proben in die Vertiefungen und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBST. Fügen Sie anschließend einen biotinylierten sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Anschließend die Vertiefungen dreimal mit PBST waschen und Streptavidin-HRP hinzufügen. Nach dem Mischen und Zugabe des Substrats die Platte zum Lichtschutz abdecken und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 100 Mikroliter Stopplösung zu jeder Vertiefung geben und vorsichtig mischen.

Schließlich stellen Sie den Mikroplattenreader auf vier 50 Nanometer mit Wellenlängenkorrektur bei fünf 40 oder fünf 70 Nanometern ein und bestimmen die optische Dichte für jede angezeigte Vertiefung. Hier ist die typische Morphologie undifferenzierter hES-Zellen, die in Gegenwart von Fütterungszellen in konditioniertem Medium und definiertem Medium kultiviert wurden. In diesen Beispielen werden hiPSCs in Gegenwart von Fütterungszellen kultiviert.

Diese Bilder zeigen die Morphologie von Mythen und inaktivierten Fütterzellen, die zur Herstellung von konditioniertem Medium verwendet werden. Im Allgemeinen sollten die Zellen 24 Stunden nach der Isolierung konfluent sein und zum Einfrieren oder zur Vermehrung bereitstehen. Manchmal kann es jedoch zwei bis drei Tage dauern, bis konfluente Kulturen erreicht sind.

Das konditionierte Medium sollte aus Zellen der vierten Passage und nicht später gewonnen werden. Dies ist entscheidend, da primäre Zellen nur vier bis fünf Passagen lang vermehrt werden können, bevor die Seneszenz einsetzt. Das in a aktive Zytokin gilt als einer der wichtigsten Faktoren, die von Fütterungszellen zur Unterstützung des undifferenzierten Wachstums pluripotenter Zellen sezerniert werden.

Die Messung des Aktivitätsgrads von mets in einem konditionierten Medium, wie hier gezeigt, ist ein praktischer quantitativer Test, um die Qualität von mets zu überwachen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Isolierung von embryonalen Mausfibroblasten in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Tiere im Voraus zu züchten und alle Instrumente vorab vorzubereiten und zu autoklavieren.