Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Milligramm-Mengen des CFTR-Proteins in Charmy Visier zu exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst TRANSFORMANT-Kolonien für Wachstums- und Expressionsversuche in 50 Milliliter Zellkulturen ausgewählt werden. Anschließend werden die Zellen lysiert und CFTR-exprimierende Kolonien identifiziert.

Danach werden die Kolonien mit der höchsten CFTR-Expression in einer 15-Liter-Fermenterkultur vermehrt. Schließlich werden die Zellen lysiert und Mikrosomen, die CFTR enthalten, präpariert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Expression und Extraktion von GFP-gefusioniertem CFTR mittels In-Gel-Fluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur CFTR-Expression liegt darin, dass sie einen einfachen eukaryotischen Wirt verwendet, der kostengünstig, schnell und leicht zu kultivieren ist. Er verfügt über einen grün fluoreszierenden Protein-Tag, der eine schnelle Überwachung der Expressionslevel ermöglicht. Schließlich werden die molekularbiologischen Arbeitsschritte bei diesem Verfahren minimiert.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mukoviszidose beantworten, beispielsweise bezüglich der biophysikalischen Eigenschaften des CFTR-Proteins. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie der Mukoviszidose hinein, da sie neue Wirkstoff-Screenings auf Basis des gereinigten Proteins ermöglichen könnte. Neue Wirkstoffkategorien könnten entstehen, die direkt mit dem Protein interagieren.

Der primäre Defekt bei Mukoviszidose sollte spezifischer sein und möglicherweise weniger pleiotrope Effekte aufweisen. Darüber hinaus ist die Reinigung großer Mengen des Proteins wichtig, um eine Struktur des CFTR mit hoher Auflösung zu erhalten. Die auf der Proteinstruktur basierende Arzneimittelentwicklung sollte bestehende Medikamente verbessern und möglicherweise zur Entdeckung neuer Arzneimittel führen.

Die Veröffentlichung dieses Artikels und des zugehörigen Videos steht in Verbindung mit der Bereitstellung von DNA oder transformierten Zellen durch die Cystic Fibrosis Foundation. Falls Sie diese Materialien erhalten möchten, wenden Sie sich bitte an Elizabeth Joof von der Cystic Fibrosis Foundation. Sie müssen eine Vereinbarung zum Materialtransfer abschließen.

Diese Methode kann Einblicke in die Verwendung eines GFP-Tags für die Expression von Membranproteinen geben, wie sie von David Drew und seinen Kollegen am Imperial College London eingeführt wurde. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten mit der Transformation haben. Die Effizienzen können gering sein, und der Zeitpunkt der Zellernte ist entscheidend, um gute Expressionsniveaus zu erzielen.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst während eines Besuchs von David Drew und seinen Kollegen in unserem Labor. Sie führten Strukturuntersuchungen an Membranproteinen durch, die sie mittels dieses Systems aus Hefe exprimiert und gereinigt hatten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Zelltransformation, das Zellwachstum nach Induktion und die Mikrosomenisolierung schwierig sind, insbesondere da die Veröffentlichung an die Freigabe eines Reagenzes gekoppelt ist.

Das Video wird zudem dazu beitragen, das Protokoll zu standardisieren, damit verschiedene Labore ihre Ergebnisse miteinander vergleichen können. Diese Prozedur wird von Tracy Remington und Natasha Kant demonstriert, die beide Doktorandin in unserem Labor sind. Liam o Ryan, der weitere Ko-Autor der Publikation, befindet sich derzeit in Neuseeland und konnte an der Demonstration nicht teilnehmen. Nach der Transformation des s visi-Stamms FGY 2 1 7 mit einem Hefe-Plasmid, das das C-F-T-R-G-F-P-Acht-hiss-Gen kodiert, wählen Sie fünf bis zehn gut getrennte Kolonien von einer Transformationsplatte aus.

Überführen Sie jede Kolonie in ein separates steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das neun Milliliter Hefe-Stickstoff-Basen- oder YNB-Medium und ein Milliliter Glukose enthält. Kultivieren Sie die Ansätze über Nacht für 16 Stunden bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem orbital schüttelnden Inkubator, um Glycerin-Kulturen für jede der untersuchten Kolonien anzulegen. Geben Sie unter aseptischen Bedingungen 0,8 Milliliter der Übernachtkulturen zu 0,2 Milliliter sterilem Glycerin in beschrifteten Schraubglasgefäßen hinzu.

Vortex kurz an und lagere bei minus 80 Grad Celsius. Verdünne die verbleibenden Übernachtkulturen auf ein Endvolumen von 50 Millilitern in YMB mit 250 Mikrolitern Glucose-Medium. Kultiviere die Ansätze in beschrifteten 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Baffeln bis zu einem OD 600 von 0,7 bis 0,8 bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem orbital schüttelnden Inkubator. Induziere die Kulturen durch Zugabe von fünf Millilitern Galactose-Medium zu jedem Kolben. Senke die Inkubatortemperatur auf 25 Grad Celsius und kultiviere über Nacht für 16 Stunden.

Überführen Sie die Kulturen in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C für 10 Minuten in einer Tischzentrifuge, während die Zentrifuge läuft. Bereiten Sie 2-Milliliter-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die etwa 300 µL saure gewaschene Glaskugeln enthalten, und stellen Sie sie auf Eis.

Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren Sie jedes Pellet erneut in 800 µL eiskaltem Zell-Resuspendierpuffer oder CRB mit Proteaseinhibitoren. Überführen Sie die Suspensionen in die Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie sie auf Eis. Belasten Sie die Zellen in einem Mini-Bead-Beater und lassen Sie diesen drei Minuten lang laufen.

Die Röhrchen in eine Tischzentrifuge geben und bei 3.500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände, die die Membranen enthalten, in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis stellen. Die rohen Membranen durch Zentrifugation bei maximaler Drehzahl für zwei Stunden bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge sammeln.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 µL Eis-CFTR-Puffer in sauberen Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jeweils 15 µL der Suspension mit 15 µL 2×-Ladepuffer durch Pipettieren gemischt.

Die Proben nicht erhitzen, da dies dazu führt, dass CFTR und andere Membranproteine SDS-unlösliche Aggregate bilden und außerdem den GFP-Tag denaturieren. Die Proben sowie einen vorgefärbten Proteinstandard auf ein 4–20 %iges Tris-Glycin-Gradienten-Gel laden und 40 Minuten lang bei 150 Volt laufen lassen. Nach der Durchführung der In-Gel-Fluoreszenz zur Identifizierung der am stärksten exprimierenden Zellen und der Bestätigung der Expression durch Kumasi-Färbung die am stärksten exprimierende Zelllinie aus ihrem Glycerinansatz auf eine frische YNBA-Platte ausstreichen und zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Bewahren Sie die Platte bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius auf, um Vorkulturen für den Fermentor vorzubereiten. Verwenden Sie eine sterile Öse, um einen quadratischen Bereich von einem Zentimeter Zellen von der A-Y-N-B-A-Platte abzukratzen, und geben Sie diesen in 45 Milliliter YMB sowie fünf Milliliter Glucose-Medium, um einen OD 600 von etwa 0,1 zu erreichen. Kultivieren Sie die Ansätze bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator, bis der OD 600 den Wert 1 erreicht.

Teilen Sie die Kultur auf zwei zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit Schüttlösen auf, von denen jeder 450 Milliliter YMB-Medium und 25 Milliliter Glukose enthält. Kultivieren Sie das Medium über Nacht bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator, bis die OD 600 den Wert 1,2 erreicht. Um den Fermenter vorzubereiten, stellen Sie 11,2 Liter YNB her und fügen Sie zusätzlich 8,28 Gramm YNB sowie 0,95 Gramm Drop-out-Zusatz hinzu, um die Zugabe von Glycerin bei der Induktion auszugleichen.

Fügen Sie anschließend unter aseptischen Bedingungen 11,2 Liter YNB und 75 Milliliter Glucose-Medium einem sterilen 20-Liter-Fermentor zugeben und die Betriebstemperatur auf 30 Grad Celsius einstellen. Danach die Vorkulturen aseptisch dem Fermentor hinzufügen. Die Rührgeschwindigkeit auf etwa 800 U/min einstellen und den Druckluftstrom auf etwa 15 Kubikdezimeter pro Minute regulieren.

Wenn die Kultur einen OD 600 von 1,2 erreicht hat, induzieren Sie durch aseptisches Hinzufügen von 1,5 Litern Galactose-Medium und 1,2 Litern Glycerin. Senken Sie die Temperatur auf 25 Grad Celsius und lassen Sie die Kultur 16 Stunden lang unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wachsen. Überführen Sie die Kultur in gekühlte Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation 30 Minuten lang bei 3.500 ×g und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 150 Milliliter eiskaltem Microzone-Resuspensionspuffer oder MRB mit Proteaseinhibitoren und einem Millimolar DTT. Führen Sie ab diesem Punkt alle Arbeitsschritte bei vier Grad Celsius durch. Lysieren Sie die Zellen mit einem Zellzerstörer.

Überführen Sie dann die Lysate in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und pelletieren Sie den Zelltrümmern durch Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C für 15 Minuten. Um Mitochondrien zu entfernen, überführen Sie das Überstand in gekühlte Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 14.000 × g und 4 °C für 30 Minuten. Um anschließend Mikrosomen zu gewinnen, überführen Sie das Überstand in gekühlte Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 200.000 × g und 4 °C für 90 Minuten.

Den Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen und zwei Milliliter eiskaltes CFTR-Puffer mit Proteaseinhibitoren und ein Millimolar DTT zu jedem Röhrchen hinzufügen. Die Pellets vorsichtig mit einem Pinsel erneut suspendieren. Danach jedes Röhrchen mit CFTR-Puffer auffüllen und die Suspension 60 Minuten bei 100.000 × g und 4 °C zentrifugieren.

Entsorgen Sie das Überstandsmittel und wiederholen Sie den Resus-Suspensionsprozess mit einem Pinsel in zwei Milliliter eiskaltem CFTR-Puffer mit Proteaseinhibitoren und einer Millimolar DTT. Lösen Sie die resuspendierten Mikrosomen auf, stellen Sie dann das Endvolumen mit CFTR-Puffer auf 50 Milliliter ein und mischen Sie gründlich. Heben Sie eine Aliquotprobe von einem Milliliter für die SDS-Gelelektrophorese auf und lagern Sie die Mikrosomen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Extraktion von CFTR aus den Mikrosomen benötigt werden.

Siehe den schriftlichen Protokoll. Die Transformation von Hefe mit dem Plasmid, das CFTR enthält, ist nicht zu 100 % effizient. Eine repräsentative Kleinmaßstab-Analyse der CFTR-Expression in ausgewählten Kolonien eines Transformationsversuchs führt dazu, dass etwa jede vierte Kolonie das dargestellte Protein exprimiert.

Hier sind die Ergebnisse einer Analyse von fünf Kolonien, die von einer Platte entnommen wurden. Eine Kolonie zeigt eine starke Expression des C-F-T-R-G-F-P-Fusionsproteins. Die C-F-T-R-G-F-P-Fluoreszenzintensitäten variieren beträchtlich zwischen Experimenten, wobei Kolonie vier mindestens zehnmal höhere Fluoreszenz als das intrinsische fluoreszierende Band bei etwa 70 Kilodalton aufweist.

Auch bei einer hohen Expression von C-F-T-R-G-F-P, wie links dargestellt, ist es unwahrscheinlich, dass das C-F-T-R-G-F-P-Band im Zelllysat durch Kumasi-Färbung, wie rechts zu sehen, sichtbar ist. Diese Abbildung zeigt das Vorhandensein von C-F-T-R-G-F-P in Mikrosomen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind nicht nur wichtig, um die Effizienz der Expressioninduktion zu beurteilen, sondern auch, um zu überprüfen, ob die Mikrosomen sorgfältig aufgereinigt wurden und Proteolyse minimiert wurde.

Wie hier gezeigt, führt das Wachstum der Zellen über 16 Stunden hinaus zu einer Abnahme der CFTR-Expression. Dies liegt wahrscheinlich an dem Umsatz des Proteins, möglicherweise infolge einer Hochregulierung der Hefe-Protein-Qualitätskontrollmaschinerie.

Daher empfiehlt es sich, die CFTR-Expressionsniveaus nach der Induktion mittels In-Gel-Fluoreszenz und fluoreszenzbildgebender Verfahren zu überwachen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Zellwachstum mittels OD600-Messungen zu kontrollieren. Probieren Sie zunächst alles im kleinen Maßstab aus, bevor Sie hochskalieren, und überprüfen Sie die Proteinexpression in Abhängigkeit von der Zeit. Nach der Induktion kann die optimale Zeit zum Ernten der Zellen je nach Labor variieren.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Milligramm-Mengen des CFTR-Proteins in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Mit dieser Methode kann das CFTR-Protein aus den Hefe-Mikrosomen gereinigt und anschließend einer weiteren biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung unterzogen werden. Nach ihrer Entwicklung durch David Drew und seine Mitarbeiter ebnete diese Technik den Weg für eine verbesserte Expression eukaryotischer Membranproteine.

Wir hoffen, dass diese Arbeit die Forschung zur Mukoviszidose beeinflussen wird, indem sie es Laboren weltweit ermöglicht, CFTR mithilfe eines kostengünstigen und einfachen Expressionssystems herzustellen. Diese Arbeit wäre ohne die Unterstützung der Cystic Fibrosis Foundation und natürlich unserer Kollegen im CFTR-3D-Strukturkonsortium nicht möglich gewesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit rekombinanten Organismen streng reguliert ist und dass Verfahrensweisen für Handhabung und Entsorgung vor Beginn der Arbeiten von der zuständigen Aufsichtsbehörde genehmigt werden müssen.