Name: Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Expression und Reinigung von CFTR-Protein in Saccharomyces cerevisiae mit GFP-Tagging. Diese Methode ermöglicht die Produktion von Milligramm-Mengen für die Mukoviszidose-Forschung und Arzneimittelscreening.

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Wir danken der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) zur Finanzierung dieser Arbeit durch seine 3D-Struktur CFTR Consortium (Grant Number FORD08XX0). Wir erkennen den enormen Beitrag von allen Kolleginnen und Kollegen innerhalb des Konsortiums zu dieser Arbeit, insbesondere in der Gestaltung der CFTR-Gene. Wir erkennen auch die wertvollen Beiträge von Drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Griechenland), Mark Young (University of Cardiff, UK) und David Drew (Imperial College, London, UK) in den frühen Phasen der Arbeit. Besonders danken wir Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Vorbereitung der Medien und Puffer <ol><li> YNB: Für einen Liter, auszusetzen 6,9 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und 0,77 g komplette Ergänzung Mischung ohne Uracil in 1 l Wasser. Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> YNBA: Für 400 ml, 2,76 g auszusetzen Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 0,38 g komplette Ergänzung Mischung ohne Uracil und 8g bakteriologischer Agar in 350 ml Wasser. Autoklaven. Mix 8 g Glukose mit 50 ml Wasser und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Sterilisieren durch einen 0,2 um Filter und Ergänzungen der YNBA während der Agar geschmolzen ist. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> 20% Glucose-Medium: Für 500 ml, mischen 100 g Glukose mit 500 ml YNB und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Fahren Sie durch einen 0,2 um Filter in eine sterile Flasche Duran. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> 20% Galactose-Medium: Für 2 Liter, 400 g Galaktose mischen mit 2l YNB und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Fahren Sie durch einen 0,2 um Filter in ein steriles Duran Flasche. Lagerung bei Raumtemperaturtur. </li><li> Protease-Inhibitor Aktien: CFTR ist sehr anfällig für Proteolyse 4. Die Autoren fanden folgende Inhibitoren wirksam zu sein in der Einschränkung der Proteolyse, obwohl Leser zugeschnitten diese Liste wünschen, können ihren eigenen Anforderungen gerecht zu werden. Shop in 100 ul Aliquots bei -20 ° C bis Frost-Tau-Probleme zu reduzieren. Alle Inhibitoren sollte aus den Stammlösungen der Konzentration arbeiten, wie unten verdünnt werden: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Inhibitor </td><td> Stoffkonzentration </td><td> Stoffaufbereitung </td><td> Arbeitskonzentration </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> Auflösen 48mg in 1 ml destilliertem Wasser </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidin </td><td> 300 mM </td><td> Auflösen 36mg in 1 ml destilliertem Wasser </td><td> 0,3 mM </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> 4 mM </td><td> Man löst 2,5 mg in 1 ml trockenem DMSO </td><td> 4 uM </td></tr><tr><td> E-64 </td><td> 7 mM </td><td> Man löst 2,5 mg in 1 ml destilliertem Wasser </td><td> 7 uM </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> 20 mM </td><td> Man löst 10 mg in 1 ml destilliertem Wasser </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> 15 mM </td><td> Man löst 10 mg in 1 ml trockenem DMSO </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> Auflösen 174mg in 1ml trockenem DMSO </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): Man löst 154 mg Dithiothreitol in 1 ml destilliertem Wasser. Lagerung bei -20 ° C. Verwenden Sie bei einer Verdünnung von 1:1000 in Puffer angegeben. </li><li> EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g Ethylendiamintetraessigsäure mit 100 ml Wasser. In 10 N NaOH tropfenweise, bis das gesamte EDTA wurde gelöst und der pH-Wert 8 erreicht. Machen Sie bis zu 200 ml mit Wasser und fahren durch einen 0,2 um Filter in eine sterile Flasche Duran. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M Sorbit, 1 mM EDTA): Man löst 18,17 g Tris-Base in 350 ml Wasser und pH auf 7,4 durch Zugabe von HCl. In 51,35 g Sorbit und machen Volumen bis zu 500 ml mit Wasser. Autoklaven. 1 ml EDTA-Stammlösung und lagern bei 4 ° C. </li><li> CFTR-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v Glycerol): Man löst 6,06 g Tris-Base in 500 ml Wasser. Der pH-Wert bis 8 mit HCl, 100 ml Glycerin und auf 1 L mit Wasser. Autoklavieren und bei 4 ° C. </li><li> 2x Last Farbstoff: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% Glycerin, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% Bromphenolblau, 4% SDS, 0,05 M DTT. Machen Sie 10 ml, portionieren und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Screening Transformanten Dieses Protokoll geht davon aus, dass der CFTR-GFP-Fusion 8His Gens in einen Hefe-Plasmid stromabwärts zu einer GAL1 Galaktose-Promotor (Abb. 1) und wurde eingefügt, dass das Plasmid wurde in FGY217 Zellen, ein PEP4 Deletionsmutante von S. cerevisiae 10 umgewandelt worden </em&gt;. Die Zellen können auf YNBA Platten gezüchtet und gespeichert werden, mehrere Wochen bei 4 ° C Für eine längere Lagerung sollten Glycerol Stocks gemacht werden und bei -80 ° C. Verfahren zur Klonierung und Transformation im Detail von Drew et al. (2008) 10 beschrieben. <ol><li> Wählen 5-10 gut getrennte Kolonien aus einer Transformation Platte. Übertragen Sie jede Kolonie eine separate sterile 50 ml Falcon-Röhrchen mit 9 ml YNB und 1 ml 20% Glucose-Medium. Für diesen Schritt ist es wichtig, um eine Endkonzentration von 2% Glucose (w / v) in der Kultur, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten haben. Wachsen Sie über Nacht für 16 Stunden bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator. </li><li> Machen Glycerin Aktien für jede der abgeschirmten Kolonien. Aseptisch 0,8 ml der Übernacht-Kulturen bis 0,2 ml steriles Glycerin in etikettierten Flaschen mit Schraubverschluss, kurz vortexen und Speicher bei -80 ° C </li><li> Verdünnen Sie die verbleibenden Kulturen über Nacht zu einem endgültigen Volumen von 50 ml in YNB, darunter 250 ul 20% Glucose-Medium.Für diesen Schritt ist es wichtig, um die Glucosekonzentration auf etwa 0,1% (w / w) in der Kultur zu schwächen, weil die hohe Glukose GAL1-Promotors 10 unterdrücken kann. Wachsen Kulturen in etikettierten 250 ml Erlenmeyerkolben Kolben mit Schikanen zu einer OD 600 von 0,7-0,8 bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator. </li><li> Induzieren die Kulturen durch Zugabe von 5 ml 20% Galactose-Medium pro Flasche und wachsen auf 16 Stunden. </li><li> Bestätigen Sie die Expression von CFTR mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nehmen Sie 100 ul der Kultur und der Zugabe von 100 ul Glycerin zu Zelle Mobilität in Lösung zu begrenzen. Analyse Zellen in einem Delta Vision RT Wiederherstellung Mikroskop (oder ähnlich), mit blauem Laser unter einem FITC-Filters (Anregungswellenlänge von 490 nm und Emissionswellenlänge von 528-538 nm). Positiv Expression des CFTR-GFP-Fusionsprotein sichtbar sein soll als ein Ring der Fluoreszenz an der Plasmamembran der Hefezellen. Nicht transformierte Hefezellen kann als Kontrolle verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie dieKulturen in 50ml Falcon-Röhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 xg, 4 ° C für 10 Minuten in einer Tischzentrifuge. Während die Zentrifuge läuft, bereiten Sie 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel mit etwa 500 ul säuregewaschen Glasperlen und auf Eis stellen. Die Überstände verwerfen und Pellet resuspendieren gegenseitig in 500-800 ul eiskaltem CRB mit Protease-Inhibitoren. Übertragen Sie die Suspensionen zu den Mikrozentrifugenröhrchen mit den Perlen und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Lyse der Zellen durch kräftiges Schütteln / Vortexen jedes Mikrozentrifugenröhrchen für 10 Perioden von 30 Sekunden, ruhen auf dem Eis zwischen den Perioden. Ein BeadBeater als Alternative eingesetzt werden können, z. B. ein Mini BioSpec BeadBeater für 3 min betrieben. </li><li> Die Röhrchen in ein Tisch-Mikrozentrifuge und Zentrifuge bei 3500 xg, 4 ° C für 5 Minuten. Die Überstände, die das rohe Membran Bevölkerung zu Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis zu reinigen. Fügen Sie 500 ul frisches Eis-cold CRB mit Protease-Inhibitoren in jedes Röhrchen und wiederholen Sie den Vorgang, um die Membranen anreichern. </li><li> Sammeln Sie die Rohöl-Membranen durch Spinnen bei maximaler Geschwindigkeit, 4 ° C in einer Tischzentrifuge Mikrozentrifuge für 2 Stunden. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren jedes Pellet in 50 ul eiskaltem Puffer CFTR. </li><li> In sauberen Mikrozentrifugenröhrchen, Mix 15 ul jeder Federung mit 15 ul 2x Last Farbstoff durch Auf-und Abpipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nicht kochen die Proben, da dies CFTR und andere Membranproteine ​​verursachen wird der SDS-unlösliche Aggregate bilden und auch denaturieren, die das GFP-Tag. </li><li> Laden der Proben mit PageRuler Zzgl. vorgefärbten Proteinstandards (Fermentas) auf ein 4-20% Tris / Glycin-Gradienten-Gel (NuSep) und führen bei 150 V für 40 Minuten oder bis der Farbstoff-vorne an der Unterseite des Gels ist. </li><li> Identifizieren der höchsten exprimierenden Zellen durch In-Gel-Fluoreszenz. In einen Fluoreszenz-Bildgebungsvorrichtung, wie beispielsweise einem Taifun Scanner. Scannen Sie das Gel usingen die blauen Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 526 nm. Das CFTR-GFP-Fusion sichtbar sein soll bei ca. 220 kDa. Es wird auch eine schwach fluoreszierenden Bande sichtbar bei etwa 70 kDa, die wahrscheinlich eine intrinsische Hefe FAD-enthaltende Membran-Protein (wie Succinat-Dehydrogenase Untereinheit A) 11,12 sein. </li><li> Färben des Gels mit Coomassie, entfärben und scannen Sie das Gel zum Vergleich mit dem Fluoreszenz-Scan über eine komfortable Bildbetrachtung Software-Paket. Die Coomassie-gefärbten Gel ermöglicht eine relative Bewertung von CFTR-GFP-Expression, die in unterschiedlichen klonalen Linien nach der Normalisierung für die Menge an Gesamtprotein auf jeder Spur des Gels geladen. </li><li> Streak aus dem höchsten exprimierenden Zelllinie aus seiner Glycerin Lager (2,2) auf eine frische YNBA Platte und inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage. Diese Platte kann dann gelagert werden bis zu 2 Wochen bei 4 ° C </li></ol> 3. Großflächige Fermenter Culture <ol><li> Planen Vorkulturen für den Fermenter. Kratzen Sie einen 1cm 2 Fläche von Zellen aus dem YNBA Platte (2,13) ​​in eine sterile Schleife und in den 45 ml YNB und 5 ml 20% Glucose-Medium, so dass die OD 600 ungefähr 0,1 ist. Wachsen Sie in 250 ml Erlenmeyer Kolben mit Schikanen bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator bis die OD 600 erreicht 1. </li><li> Teilen Sie die Kultur zwischen zwei 2 l-Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen jeweils das 450 ml YNB und 25 ml 20% Glucose Medium. Wachsen diese auf 250 UpM, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator bis die OD 600 1,2 erreicht. </li><li> Während diese Vorkulturen wachsen, richten Sie den Fermenter. Machen 11.2l von YNB wie in 1.1 beschrieben, lösen sich aber eine zusätzliche 8,28 g und 0,95 g YNB drop out Ergänzung für den Zusatz von Glycerin bei Induktion zu kompensieren. Aseptisch die 11,2 l YNB und 75 ml 20% Glucose-Medium in ein steriles 20l Fermentergefäß und stellen Sie die Betriebstemperatur zu30 ° C </li><li> Aseptisch den Vorkulturen auf den Fermenter und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf ca. 800 Umdrehungen pro Minute und dass die Temperatur bei 30 ° C Druckluft sollte bei ca. 15 dm 3 min -1 fließen. Sobald die Fermenterkultur erreicht eine OD 600 von 1,2, induziert durch Zugabe von 1,5 l aseptisch YNB 20% Galaktose-Lösung und 1,2 l Glycerin. Reduzieren der Temperatur auf 25 ° C wachsen und die Kultur für 16 Stunden. </li><li> Übertragen Sie die Fermenterinhalt in gekühlte Zentrifuge 1l Töpfe auf dem Eis mit Hilfe einer Schlauchpumpe. Ernten der Zellen mittels Zentrifugation bei 3.500 × g, 4 ° C für 30 Minuten in einer großen Kapazität Rotor (zB 6 Liter). Die Zellen in 150 ml eiskaltem CRB mit Protease-Inhibitoren. Von nun an sollten alle Arbeiten bei 4 ° C durchgeführt werden </li><li> Lyse der Zellen durch Durchleiten durch einen Constant Systems Zelle Unterbrecher in 4 Durchläufen bei 25, 30, 32 und 35 kPa, Sammeln des Lysats auf Eis in jedem Fall. Alternativ können Sie einen Wulst Beater (Biospec) mit einem gleichen Volumen von sauer gewaschene 0,5 mm Glasperlen und für 3 Minuten bei voller Leistung bewegen. Übertragen des Lysats auf 50ml Falcon-Röhrchen und Pellet die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3.500 × g, 4 ° C für 15 Minuten in einer Tischzentrifuge. </li><li> Den Überstand in Zentrifugenröhrchen gekühlt. Zentrifugieren bei 14000 × g, 4 ° C für 30 Minuten in einer Zentrifuge zu entfernen, Mitochondrien. </li><li> Überstand in gekühlten Ultrazentrifuge Röhren. Zentrifuge bei 200.000 × g, 4 ° C für 90 Minuten in einer Ultrazentrifuge zur Mikrosomen sammeln. </li><li> Vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen und fügen 2ml eiskaltem CFTR-Puffer mit Protease-Inhibitoren und 1 mM DTT in jedes Röhrchen. Vorsichtig resuspendieren Pellets mit einem Pinsel, füllen Sie jedes Röhrchen mit Puffer-und CFTR-Mix mit einem Vortexer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200.000 xg, 4 ° C für 60 Minuten in der Ultrazentrifuge, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Pellets in 2 ml eiskaltem Puffer CFTR wi-ten Protease-Inhibitoren (Kein DVB-T) mit einem Pinsel. </li><li> Pool die resuspendierten Mikrosomen auf das Endvolumen auf 50 ml mit CFTR-Puffer und gut mischen. Reservieren Sie ein 1 ml Aliquot für SDS-PAGE-Gel-Analyse, wie in 2.9 beschrieben - 2,11. Die Mikrosomen kann nun in flüssigem Stickstoff gefroren und dann bei -80 ° C bis zum Gebrauch. </li><li> Lithium-perfluorooctonoate Säure (LiPFO), tetradecanoly-lyso-Phosphatidylglycerin (LPG14), n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM): CFTR aus Mikrosomen mit einer der folgenden Reinigungsmittel extrahiert werden. Mische die Mikrosomen mit CFTR-Puffer, Protease-Inhibitoren und 5% Detergens (w / w). Wenn DDM verwendet wird, auch hinzufügen, 300 mM NaCl in den Puffer. Schütteln bei 4 ° C für 15 Minuten auf einem Rohr Rotator. </li><li> Zentrifugation der Proben bei 100.000 × g, 4 ° C für 1 Stunde in einer Ultrazentrifuge. Bewahren Sie den Überstand und nehmen einen kleinen Aliquot für SDS-PAGE-Gel-Analyse. CFTR kann nun aus dem Material solublised durch immobilisierte Metall gereinigt werdenAffinitätschromatographie gefolgt von Größenausschlusschromatographie. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Transformation von Hefe mit dem CFTR-enthaltenden Plasmid ist nicht zu 100% effizient. Ein Vertreter kleinen Bildschirm des CFTR-Expression in ausgewählten Kolonien aus einer Transformation Experiment wird etwa 1 zu 4 Kolonien die das Protein exprimieren nachgeben. Ein typisches Ergebnis von einem Bildschirm von 5 Kolonien von einer Platte aufgenommen ist in Panel A Abb. 3. Eine der Kolonien zeigt ein hohes Maß an Expression des CFTR-GFP-Fusionsprotein, die typischerweise verläuft zwischen der 250 kDa und 130 kDa-Marker, wie gezeigt. Die CFTR-GFP-Fluoreszenz Ebenen werden jedoch unterschiedlich Experimente, mit Kolonie 4 in Abb. 3, aus denen mindestens 10-fach höhere Fluoreszenz als die intrinsische Fluoreszenz-Bande bei etwa 70kDa. Wenn Expression von CFTR-GFP-Fluoreszenz zu geben weniger als die 70 kDa Bande erscheinen, dann ist es wohl wert, neu zu verwandeln und die Auswahl einer Koloniemit einem höheren CFTR-GFP-Expression. Wie in gezeigt. 3A, ist es unwahrscheinlich, auch mit einer hohen Expression des CFTR-GFP, dass die CFTR-GFP-Band wird erkennbar sein im Zellextrakt durch Coomassie-Färbung. Nach der Auswahl Kolonien wurden in größerem Umfang Experimente angebaut worden, Mikrosomen und isoliert, die Anwesenheit von CFTR-GFP innerhalb der Mikrosomen wird zu beurteilen sein, wie in Abb. 3B. Die Ergebnisse dieses Experiments sind wichtig, nicht nur die Effizienz der Induktion der Expression bewerten, sondern auch um sicherzustellen, dass die Mikrosomen wurden sorgfältig und hergestellt, dass die Proteolyse minimiert wurde. Die Ergebnisse sind in gezeigt. 3B implizieren, dass in diesem Experiment das CFTR-GFP-Expression etwas niedriger (wie beurteilt bezogen auf die intrinsische 70kDa Bande) als in der kleinen Experiment in Panel A dargestellt jedoch dieser Eindruck durch die Überbelichtung des Fluoreszenz-Detektor in dieser vorgespannt ist Messung. Das lag daran, der Experimentator war checking auf das Vorhandensein von proteolytischen Fragmenten des CFTR-Konstrukt. Es gibt einige Hinweise in diesem Experiment für einige fluoreszierende proteolytische Fragmente zwischen den 130 kDa und 100 kDa Markern, aber diese sind sehr schwach im Vergleich zu dem in voller Länge CFTR-GFP-Band. Mit der Protease-Inhibitoren hier beschrieben, finden wir wenig Beweise für den proteolytischen Abbau von CFTR nach dem Aufbrechen der Zellen. Wenn bedeutende Proteolyse beobachtet wird, empfehlen wir, dass frisches Protease-Inhibitor-Stammlösungen. Wir haben auch gefunden, dass kommerzielle Protease Inhibitor Cocktail-Tabletten weniger wirksam sind für dieses System. Das Wachstum von Zellen über 16 Stunden (nach Induktion), zur Auferstehung des CFTR verringerten Ausdruck zu geben, wie in Abbildung 4 dargestellt. Dies ist wahrscheinlich auf den Umsatz des Proteins, vielleicht wegen Hochregulierung des Hefe-Protein-Qualitätskontrolle Maschinen 6-9,13. Es ist daher ratsam, CFTR-Expression kontrollieren nach Induktion mit Galaktose, wenn möglich, als die optimale Zeit zu ernten die Zellen may variieren von einem Labor zum anderen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Abbildung 1. Das CFTR-Konstrukt-haltigen Hefeplasmid. Die CFTR-GFP-Fusion wird in 8His der 2μ p424GAL1 Expressionsvektor inseriert wird, unter der Kontrolle eines Galactose (GAL1)-Promotor. Der Vektor enthält auch einen Selektionsmarker Uracil (URA) und ein Ampicillin-Resistenzgen (Amp). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein Flussdiagramm mit einer Zusammenfassung der visualisierten Protokoll. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter SDS-PAGE-Gele von CFTR Expression und Reinigung. Tafel A zeigt fünf zufällig ausgewählten Transformantenkolonien (Spuren 1-5), die für die CFTR Expression gescreent. Tafel B zeigt Mikrosomen, die aus einem 15l ferm isoliert wurdenGeben Kultur. Tafel C zeigt gereinigt murinen CFTR nach der zweistufigen Reinigung mittels Affinitätschromatographie durch Größenausschlusschromatographie gefolgt erhalten. Alle Gele werden unter Beleuchtungsbedingungen Anregung der Fluoreszenz aus der GFP-Domäne (links) und nach Coomassie-Färbung (rechts) gezeigt. Die relativen Positionen der Molekulargewichtsmarker sind auf der linken (kDa) angegeben. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Daten für die Expression des CFTR in Hefe. Abbildung A zeigt eine zeitliche Verlauf der CFTR Expression nach Induktion mit Galactose. Zellextrakte wurden durch SDS-PAGE analysiert, und die GFP-Fluoreszenz für die CFTR-GFP-Protein-Bande wurde integriert. Tafel B zeigt typische Ergebnisse für die Fluoreszenzmikroskopie von GFP-exprimierenden Zellen 16 Stunden nach der Induktion. Typischerweise exprimieren nur ein Bruchteil der Zellen CFTR auf hohem Niveau.

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<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Papier stellt ein Verfahren für die Expression von murinem CFTR-Protein in Hefezellen, welche die Forschung an Mukoviszidose sollte zu erleichtern. Ziel ist es, dieses Papier mit der Veröffentlichung des murinen CFTR-DNA-Konstrukt, das erhältlich sein wird durch die Mukoviszidose-Stiftung (Link <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Andere Orthologe sollten verfügbar sein später. Die Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-enthaltenden Vektor ist einfach, aber es ist wichtig zu screenen Kolonien, die hohe Konzentrationen von CFTR. Variable Expression kann von mehreren Faktoren ergeben, aber die Anzahl der Kopien des Plasmids pro Zelle wahrscheinlich für eine beträchtliche Unterschiede. Kritische hier beschriebenen Schritte sollte es die Produktion von CFTR-exprimierenden Hefezellen und CFTR-haltigen mikrosomalen Membranen. Nachdem die Transformation, Wachstum, Ernte und Lyse von Hefezellen wurden gemeistert, purifTZBEREICH des Proteins möglich sein sollte, und in Abbildung 3 haben wir ein Beispiel für die Reinheit, die erreichbar sein sollten in diesem Fall als nützliche Benchmark gegeben. Es ist nicht unsere Absicht, in dieser Handschrift, um detaillierte Methodik für die Reinigung des Proteins liefern. Es gibt jedoch einige kritische stromabwärtigen Reinigungsschritte, die spezifisch für die S.cerevisae Expressionssystem, wie Zell-Lyse und Aufreinigung Mikrosomen sind, und diese sind im Detail in dieser Handschrift aufgenommen. Es sollte erwähnt werden, jedoch, dass abgesehen von den beiden Methoden, die wir verwendet haben, können alternative Hefezelle Aufschlussverfahren eingesetzt werden, wie die Verwendung eines Französisch Druckzelle werden. Das rekombinante Protein eine TEV-spaltbare C-terminalen GFP-Domäne, die das Protein nach der Induktion verfolgt werden (Abb. 4) ermöglicht. Hefe haben einen intrinsischen 70kDa Protein (wahrscheinlich Succinatdehydrogenase 12), dass fluoresziert unter den gleichen Bedingungen 11, und damit ein sinnvoller inter bieteninterne Kalibrierung Maß für die relative Expression von CFTR in Ganzzellextrakten oder Mikrosomen (Abb. 3). Es ist klar, aus den Daten in 4 gezeigt, dass der Zeitpunkt der Zellernte nach Induktion mit Galactose von entscheidender Bedeutung ist. Ausbeuten von CFTR Tropfen steil nach etwa 16 Stunden der Induktion, so dass es wird praktisch kein nachweisbares CFTR in Hefe-Zellen nach 24 Stunden der Induktion. Die Ausbeute an gereinigtem Protein ist etwa 1-2mg CFTR-Protein pro 15 Liter-Fermenter Kultur. Die Wiederherstellung kann etwa 70% der gesamten CFTR-GFP-Protein bis zu der Mikrosomen Stadium davon ausgegangen werden, und etwa 25% Gewinnung von gereinigtem Protein. Charakterisierung des S. cerevisiae-ausgedrückt CFTR ist im Gange. Wie in ersichtlich. 4, kann das Protein die Stelle in der Zelle durch Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet werden. Obwohl ein Großteil der Fluoreszenz in der Umgebung der Peripherie der Zelle als erwarteten 10 gefunden wird, wird etwas von dem Protein ein punktförmiges Körperregion, entweder in odergerade innerhalb der Plasmamembran, die möglicherweise durch das Recycling durch einen späten Golgi / endosomalen Weg 14 oder vielleicht einem Fach hinter der Knospung der Vesikel von der ER 4 CFTR konnte. Die Behandlung mit PNGaseF, ein Enzym, das Proteine ​​deglycosylates, zeigten eine minimale Änderung in der Migration des CFTR-Protein-Bande auf SDS-PAGE, was bedeutet, dass es glykosyliert ist oder eine minimale Glykosylierung 15. Versuche über die Phosphorylierung des Proteins sind im Gange. In einigen der Wasch bisher getesteten, zeigt das gereinigte Protein ATPase-Aktivität (dh durch ein CFTR-spezifischer Inhibitor inhibiert 16) mit Raten, die ähnlich zu den zuvor veröffentlichten 2,15 sind. Messung der CFTR-Kanal Aktivität erforderlich Rekonstitution des gereinigten Proteins, das eine letzten Reinigungsschritt in einem Reinigungsmittel, das eine relativ hohe kritische Mizellenkonzentration (CMC) 17 weist bedeuten würde. Hefe-Mikrosomen containing CFTR kann mit verschiedenen üblicherweise eingesetzten Reinigungsmittel 18, einschließlich Detergenzien wie Dodecylmaltosid 2, die im Allgemeinen gelten als &quot;mild&quot; solublised werden. Doch die meisten hohen CMC Waschmittel haben sich als ineffizient für solubilsation, so weit, was darauf hindeutet, dass der Austausch in dieser Waschmittel in einem späten Stadium in irgendeiner Reinigungsschema sollte erwogen werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Kein Katalog </td></tr><tr><td> FGY217 S. cerevisiae Stamm mit pep4 Deletion 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Füllen Ergänzung Mischung ohne Uracil </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Bakteriologischer Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-Galactose </td><td> Fischer </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fischer </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-Butan (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl Fluorid (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidinhydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Fischer </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fischer </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-Sorbit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler vorgefärbten Plus-Protein-Standards </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep Tris-Gly 4-20% Gradientengele </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instant-Blau Coomassie Stain </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Glasperlen, gewaschen Säure </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml steriles Falcon Tubes </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlSterile Fläschchen mit Schraubverschluss </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Sterile Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Sterile 2l Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Sarstedt </td><td> 72,695 </td></tr><tr><td> 0,2 um Spritzenfilter </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge Rohre </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1l Zentrifuge Töpfe </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital Schüttelinkubator mit Temperaturregelung </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT Restaurierung Mikroskop </td><td> Applied Vision </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Tisch-Mikrozentrifuge </td><td> Fischer </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex-Mischer </td><td> Star-Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Trio Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 Abbildungssystem </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> 20l Fermentationsbehälter und Steuereinheit </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Constant Systems Zelle Disruptor </td><td> Constant Systems </td><td></td></tr><tr><td> BeadBeater Zelle Disruptor </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-BeadBeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti Rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression und reinigung des cystic fibrosis transmembrane conductance regulatorprotein in saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) ist ein Chlorid-Kanal, die im Fall einer Mutation entstehen Mukoviszidose in humans.There geben können, ist daher ein großes Interesse in diesem Protein, aber die Bemühungen um die Struktur und Aktivität zu untersuchen haben, durch die Schwierigkeit behindert worden Expression und Aufreinigung von ausreichenden Mengen des Proteins 1-3. Wie viele &quot;schwierige&quot; eukaryotischen Membranproteine, ist Ausdruck in einer schnell wachsenden Organismus wünschenswert, aber eine Herausforderung, und in der Hefe S. cerevisiae, so weit geringe Mengen erhalten und einen schnellen Abbau des rekombinanten Proteins wurde 4-9 beobachtet. Proteine, die in der Verarbeitung von rekombinanten CFTR in Hefe beteiligt wurden 6-9 beschrieben. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Expression des CFTR in Hefe und dessen Reinigung in signifikanten Mengen. Das Protokoll beschreibt, wie die früheren Proteolyse Probleme überwunden werden können und wie Expression vonCFTR läßt sich durch Änderung der Bedingungen und Zellwachstum durch die Kontrolle der Induktionsbedingungen verbessert werden, insbesondere die Zeit vor der Zellernte. Die reagants mit diesem Protokoll (murine CFTR-exprimierenden Hefezellen oder Hefeplasmide) wird über den US-Cystic Fibrosis Foundation, die die Forschung gefördert hat, verteilt werden assoziiert. Ein Artikel beschreibt das Design und die Synthese des CFTR in diesem Bericht verwendeten Konstrukt wird getrennt veröffentlicht (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, unveröffentlicht). In diesem Artikel erklären wir Ihnen, unsere Verfahren beginnend mit der Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-Konstrukt - haltigen Hefe-Plasmid (Abb. 1). Das Konstrukt ist ein grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Sequenz fusioniert am C-Terminus CFTR und folgt dem System von Drew et al. (2008) 10. Das GFP erlaubt die Expression und Reinigung von CFTR zu relativ leicht verfolgt werden. Die JoVE visualisiert Protokollol endet nach der Herstellung von Mikrosomen, die aus den Hefezellen, obwohl wir auch einige Vorschläge zur Reinigung des Proteins aus den Mikrosomen sind. Leser können auf Wunsch ihre eigenen Änderungen der Mikrosomen Reinigungsverfahren, abhängig von den endgültigen Experimente mit dem Protein und der lokalen Einrichtung steht, um sie durchgeführt werden hinzuzufügen. Die Hefe exprimierten CFTR-Protein teilweise gereinigt werden, indem Metallionen-Affinitätschromatographie unter Verwendung einer intrinsischen Polyhistidin-Tag Reinigung. Nachfolgende Größenausschlusschromatographie ergibt ein Protein, das als&gt; 90% rein, wie durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung des Gels beurteilt wird.

Versuche, die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) in Ausdruck<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Haben, bis jetzt, ergab relativ geringe Mengen an Protein. Dieses Protokoll und die damit verbundenen Reagenzien über die Mukoviszidose-Stiftung verteilt sollte ermöglichen die Herstellung von Milligramm-Mengen dieser &quot;schwierigen&quot; eukaryontischen Membranprotein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Der cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ist ein Chloridkanal, der bei Mutationen zu Mukoviszidose führen kann in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Milligramm-Mengen des CFTR-Proteins in Charmy Visier zu exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst TRANSFORMANT-Kolonien für Wachstums- und Expressionsversuche in 50 Milliliter Zellkulturen ausgewählt werden. Anschließend werden die Zellen lysiert und CFTR-exprimierende Kolonien identifiziert.Danach werden die Kolonien mit der höchsten CFTR-Expression in einer 15-Liter-Fermenterkultur vermehrt. Schließlich werden die Zellen lysiert und Mikrosomen, die CFTR enthalten, präpariert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Expression und Extraktion von GFP-gefusioniertem CFTR mittels In-Gel-Fluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur CFTR-Expression liegt darin, dass sie einen einfachen eukaryotischen Wirt verwendet, der kostengünstig, schnell und leicht zu kultivieren ist. Er verfügt über einen grün fluoreszierenden Protein-Tag, der eine schnelle Überwachung der Expressionslevel ermöglicht. Schließlich werden die molekularbiologischen Arbeitsschritte bei diesem Verfahren minimiert. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mukoviszidose beantworten, beispielsweise bezüglich der biophysikalischen Eigenschaften des CFTR-Proteins. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie der Mukoviszidose hinein, da sie neue Wirkstoff-Screenings auf Basis des gereinigten Proteins ermöglichen könnte. Neue Wirkstoffkategorien könnten entstehen, die direkt mit dem Protein interagieren.Der primäre Defekt bei Mukoviszidose sollte spezifischer sein und möglicherweise weniger pleiotrope Effekte aufweisen. Darüber hinaus ist die Reinigung großer Mengen des Proteins wichtig, um eine Struktur des CFTR mit hoher Auflösung zu erhalten. Die auf der Proteinstruktur basierende Arzneimittelentwicklung sollte bestehende Medikamente verbessern und möglicherweise zur Entdeckung neuer Arzneimittel führen.Die Veröffentlichung dieses Artikels und des zugehörigen Videos steht in Verbindung mit der Bereitstellung von DNA oder transformierten Zellen durch die Cystic Fibrosis Foundation. Falls Sie diese Materialien erhalten möchten, wenden Sie sich bitte an Elizabeth Joof von der Cystic Fibrosis Foundation. Sie müssen eine Vereinbarung zum Materialtransfer abschließen.Diese Methode kann Einblicke in die Verwendung eines GFP-Tags für die Expression von Membranproteinen geben, wie sie von David Drew und seinen Kollegen am Imperial College London eingeführt wurde. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten mit der Transformation haben. Die Effizienzen können gering sein, und der Zeitpunkt der Zellernte ist entscheidend, um gute Expressionsniveaus zu erzielen.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst während eines Besuchs von David Drew und seinen Kollegen in unserem Labor. Sie führten Strukturuntersuchungen an Membranproteinen durch, die sie mittels dieses Systems aus Hefe exprimiert und gereinigt hatten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Zelltransformation, das Zellwachstum nach Induktion und die Mikrosomenisolierung schwierig sind, insbesondere da die Veröffentlichung an die Freigabe eines Reagenzes gekoppelt ist.Das Video wird zudem dazu beitragen, das Protokoll zu standardisieren, damit verschiedene Labore ihre Ergebnisse miteinander vergleichen können. Diese Prozedur wird von Tracy Remington und Natasha Kant demonstriert, die beide Doktorandin in unserem Labor sind. Liam o Ryan, der weitere Ko-Autor der Publikation, befindet sich derzeit in Neuseeland und konnte an der Demonstration nicht teilnehmen. Nach der Transformation des s visi-Stamms FGY 2 1 7 mit einem Hefe-Plasmid, das das C-F-T-R-G-F-P-Acht-hiss-Gen kodiert, wählen Sie fünf bis zehn gut getrennte Kolonien von einer Transformationsplatte aus.Überführen Sie jede Kolonie in ein separates steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das neun Milliliter Hefe-Stickstoff-Basen- oder YNB-Medium und ein Milliliter Glukose enthält. Kultivieren Sie die Ansätze über Nacht für 16 Stunden bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem orbital schüttelnden Inkubator, um Glycerin-Kulturen für jede der untersuchten Kolonien anzulegen. Geben Sie unter aseptischen Bedingungen 0,8 Milliliter der Übernachtkulturen zu 0,2 Milliliter sterilem Glycerin in beschrifteten Schraubglasgefäßen hinzu.Vortex kurz an und lagere bei minus 80 Grad Celsius. Verdünne die verbleibenden Übernachtkulturen auf ein Endvolumen von 50 Millilitern in YMB mit 250 Mikrolitern Glucose-Medium. Kultiviere die Ansätze in beschrifteten 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Baffeln bis zu einem OD 600 von 0,7 bis 0,8 bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem orbital schüttelnden Inkubator. Induziere die Kulturen durch Zugabe von fünf Millilitern Galactose-Medium zu jedem Kolben. Senke die Inkubatortemperatur auf 25 Grad Celsius und kultiviere über Nacht für 16 Stunden.Überführen Sie die Kulturen in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C für 10 Minuten in einer Tischzentrifuge, während die Zentrifuge läuft. Bereiten Sie 2-Milliliter-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die etwa 300 µL saure gewaschene Glaskugeln enthalten, und stellen Sie sie auf Eis.Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren Sie jedes Pellet erneut in 800 µL eiskaltem Zell-Resuspendierpuffer oder CRB mit Proteaseinhibitoren. Überführen Sie die Suspensionen in die Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie sie auf Eis. Belasten Sie die Zellen in einem Mini-Bead-Beater und lassen Sie diesen drei Minuten lang laufen.Die Röhrchen in eine Tischzentrifuge geben und bei 3.500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände, die die Membranen enthalten, in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis stellen. Die rohen Membranen durch Zentrifugation bei maximaler Drehzahl für zwei Stunden bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge sammeln.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 µL Eis-CFTR-Puffer in sauberen Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jeweils 15 µL der Suspension mit 15 µL 2×-Ladepuffer durch Pipettieren gemischt.Die Proben nicht erhitzen, da dies dazu führt, dass CFTR und andere Membranproteine SDS-unlösliche Aggregate bilden und außerdem den GFP-Tag denaturieren. Die Proben sowie einen vorgefärbten Proteinstandard auf ein 4–20 %iges Tris-Glycin-Gradienten-Gel laden und 40 Minuten lang bei 150 Volt laufen lassen. Nach der Durchführung der In-Gel-Fluoreszenz zur Identifizierung der am stärksten exprimierenden Zellen und der Bestätigung der Expression durch Kumasi-Färbung die am stärksten exprimierende Zelllinie aus ihrem Glycerinansatz auf eine frische YNBA-Platte ausstreichen und zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren.Bewahren Sie die Platte bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius auf, um Vorkulturen für den Fermentor vorzubereiten. Verwenden Sie eine sterile Öse, um einen quadratischen Bereich von einem Zentimeter Zellen von der A-Y-N-B-A-Platte abzukratzen, und geben Sie diesen in 45 Milliliter YMB sowie fünf Milliliter Glucose-Medium, um einen OD 600 von etwa 0,1 zu erreichen. Kultivieren Sie die Ansätze bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator, bis der OD 600 den Wert 1 erreicht.Teilen Sie die Kultur auf zwei zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit Schüttlösen auf, von denen jeder 450 Milliliter YMB-Medium und 25 Milliliter Glukose enthält. Kultivieren Sie das Medium über Nacht bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator, bis die OD 600 den Wert 1,2 erreicht. Um den Fermenter vorzubereiten, stellen Sie 11,2 Liter YNB her und fügen Sie zusätzlich 8,28 Gramm YNB sowie 0,95 Gramm Drop-out-Zusatz hinzu, um die Zugabe von Glycerin bei der Induktion auszugleichen.Fügen Sie anschließend unter aseptischen Bedingungen 11,2 Liter YNB und 75 Milliliter Glucose-Medium einem sterilen 20-Liter-Fermentor zugeben und die Betriebstemperatur auf 30 Grad Celsius einstellen. Danach die Vorkulturen aseptisch dem Fermentor hinzufügen. Die Rührgeschwindigkeit auf etwa 800 U/min einstellen und den Druckluftstrom auf etwa 15 Kubikdezimeter pro Minute regulieren.Wenn die Kultur einen OD 600 von 1,2 erreicht hat, induzieren Sie durch aseptisches Hinzufügen von 1,5 Litern Galactose-Medium und 1,2 Litern Glycerin. Senken Sie die Temperatur auf 25 Grad Celsius und lassen Sie die Kultur 16 Stunden lang unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wachsen. Überführen Sie die Kultur in gekühlte Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation 30 Minuten lang bei 3.500 ×g und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 150 Milliliter eiskaltem Microzone-Resuspensionspuffer oder MRB mit Proteaseinhibitoren und einem Millimolar DTT. Führen Sie ab diesem Punkt alle Arbeitsschritte bei vier Grad Celsius durch. Lysieren Sie die Zellen mit einem Zellzerstörer.Überführen Sie dann die Lysate in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und pelletieren Sie den Zelltrümmern durch Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C für 15 Minuten. Um Mitochondrien zu entfernen, überführen Sie das Überstand in gekühlte Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 14.000 × g und 4 °C für 30 Minuten. Um anschließend Mikrosomen zu gewinnen, überführen Sie das Überstand in gekühlte Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 200.000 × g und 4 °C für 90 Minuten.Den Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen und zwei Milliliter eiskaltes CFTR-Puffer mit Proteaseinhibitoren und ein Millimolar DTT zu jedem Röhrchen hinzufügen. Die Pellets vorsichtig mit einem Pinsel erneut suspendieren. Danach jedes Röhrchen mit CFTR-Puffer auffüllen und die Suspension 60 Minuten bei 100.000 × g und 4 °C zentrifugieren.Entsorgen Sie das Überstandsmittel und wiederholen Sie den Resus-Suspensionsprozess mit einem Pinsel in zwei Milliliter eiskaltem CFTR-Puffer mit Proteaseinhibitoren und einer Millimolar DTT. Lösen Sie die resuspendierten Mikrosomen auf, stellen Sie dann das Endvolumen mit CFTR-Puffer auf 50 Milliliter ein und mischen Sie gründlich. Heben Sie eine Aliquotprobe von einem Milliliter für die SDS-Gelelektrophorese auf und lagern Sie die Mikrosomen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Extraktion von CFTR aus den Mikrosomen benötigt werden.Siehe den schriftlichen Protokoll. Die Transformation von Hefe mit dem Plasmid, das CFTR enthält, ist nicht zu 100 % effizient. Eine repräsentative Kleinmaßstab-Analyse der CFTR-Expression in ausgewählten Kolonien eines Transformationsversuchs führt dazu, dass etwa jede vierte Kolonie das dargestellte Protein exprimiert.Hier sind die Ergebnisse einer Analyse von fünf Kolonien, die von einer Platte entnommen wurden. Eine Kolonie zeigt eine starke Expression des C-F-T-R-G-F-P-Fusionsproteins. Die C-F-T-R-G-F-P-Fluoreszenzintensitäten variieren beträchtlich zwischen Experimenten, wobei Kolonie vier mindestens zehnmal höhere Fluoreszenz als das intrinsische fluoreszierende Band bei etwa 70 Kilodalton aufweist.Auch bei einer hohen Expression von C-F-T-R-G-F-P, wie links dargestellt, ist es unwahrscheinlich, dass das C-F-T-R-G-F-P-Band im Zelllysat durch Kumasi-Färbung, wie rechts zu sehen, sichtbar ist. Diese Abbildung zeigt das Vorhandensein von C-F-T-R-G-F-P in Mikrosomen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind nicht nur wichtig, um die Effizienz der Expressioninduktion zu beurteilen, sondern auch, um zu überprüfen, ob die Mikrosomen sorgfältig aufgereinigt wurden und Proteolyse minimiert wurde.Wie hier gezeigt, führt das Wachstum der Zellen über 16 Stunden hinaus zu einer Abnahme der CFTR-Expression. Dies liegt wahrscheinlich an dem Umsatz des Proteins, möglicherweise infolge einer Hochregulierung der Hefe-Protein-Qualitätskontrollmaschinerie.Daher empfiehlt es sich, die CFTR-Expressionsniveaus nach der Induktion mittels In-Gel-Fluoreszenz und fluoreszenzbildgebender Verfahren zu überwachen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Zellwachstum mittels OD600-Messungen zu kontrollieren. Probieren Sie zunächst alles im kleinen Maßstab aus, bevor Sie hochskalieren, und überprüfen Sie die Proteinexpression in Abhängigkeit von der Zeit. Nach der Induktion kann die optimale Zeit zum Ernten der Zellen je nach Labor variieren.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Milligramm-Mengen des CFTR-Proteins in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Mit dieser Methode kann das CFTR-Protein aus den Hefe-Mikrosomen gereinigt und anschließend einer weiteren biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung unterzogen werden. Nach ihrer Entwicklung durch David Drew und seine Mitarbeiter ebnete diese Technik den Weg für eine verbesserte Expression eukaryotischer Membranproteine.Wir hoffen, dass diese Arbeit die Forschung zur Mukoviszidose beeinflussen wird, indem sie es Laboren weltweit ermöglicht, CFTR mithilfe eines kostengünstigen und einfachen Expressionssystems herzustellen. Diese Arbeit wäre ohne die Unterstützung der Cystic Fibrosis Foundation und natürlich unserer Kollegen im CFTR-3D-Strukturkonsortium nicht möglich gewesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit rekombinanten Organismen streng reguliert ist und dass Verfahrensweisen für Handhabung und Entsorgung vor Beginn der Arbeiten von der zuständigen Aufsichtsbehörde genehmigt werden müssen.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes...

In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Dieser Artikel beschreibt ein FRET-basiertes Flow-Zytometrie-Protokoll zur Quantifizierung der Protein-Selbstmontage in s. cerevisiae- und HEK293T-Zellen.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Erfahren Sie die Expression und Reinigung von CFTR-Protein in Saccharomyces cerevisiae mit GFP-Tagging. Diese Methode ermöglicht die Produktion von Milligramm-Mengen für die Mukoviszidose-Forschung und Arzneimittelscreening.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

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