Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu erläutern, wie endotheliale Kolonie-bildende Zellen oder eCFCs aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnen werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus dem Nabelschnurblut ausplattiert werden, gefolgt von der Klonierung und Expansion von Kolonieauswüchsen der eCFCs. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in vitro mittels einer neuartigen Einzelzell-Assay-Technik zur klonalen proliferativen Kapazität zu charakterisieren.

Schließlich werden die Zellen in einem in-vivo-Gefäßbildungsassay charakterisiert, indem Gele, die EPCs enthalten, in NOD/SCID-Mäusen produziert und implantiert werden. Letztendlich kann die in-vivo-Bildung neuer, vom Wirt gebildeter, blutgefüllter Gefäße durch H-und-E-Färbung der EPC-haltigen zellulären Implantate bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die Untersuchung des proliferativen Potenzials endothelialer Zellen auf Einzelzellniveau ermöglichen.

Die Implikationen dieser Technik könnten dahingehend erweitert werden, diagnostische und therapeutische Werkzeuge für Erkrankungen wie periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAD) zu finden, da diese Technik es uns ermöglicht, das proliferative Potenzial und das Differenzierungspotenzial der endothelialen Zellen eines Patienten zu untersuchen. Vor Beginn des Verfahrens ein Milliliter Rattenschwanzkollagen, Typ I, in jede Vertiefung einer sechswelligen Zellkulturplatte geben und die Platte am Tag des Verfahrens über Nacht inkubieren. Danach das Nabelschnurblut in Portionen von 15 Milliliter in 50-Milliliter-Konischzentrifugenröhrchen abfüllen. Anschließend 20 Milliliter PBS zu jedem Röhrchen hinzufügen und die Mischung mehrmals auf- und abpipettieren.

Als Nächstes 15 Milliliter Fial-PA in eine Pipette aufziehen, die Pipettenspitze auf den Boden des Röhrchens mit verdünntem Blut bringen und vorsichtig unter die Fial-PA-Schicht pipettieren. Die Röhrchen 30 Minuten bei 740 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren, ohne die Verzögerungsbremse einzuschalten. Nach der Zellseparation die trübe Schicht aus mononukleären Zellen geringer Dichte, die sich an der Grenzfläche zwischen Fial-PA und verdünntem Plasma befindet, mit einer Transferpipette entfernen. Die gesammelten Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas mit 10 Milliliter EGM-2-Medium überführen und die mononukleären Zellen 10 Minuten bei 515 × g bei Raumtemperatur mit starker Verzögerungsbremse pelletieren. Vorsichtig den Überstand abpipettieren und verwerfen.

Danach die pelletierten Zellen zweimal mit EGM zwei waschen, anschließend die mononukleären Zellen in EGM zwei auf 1,25 × 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Nun vier Milliliter der mononukleären Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Kollagen beschichteten Platte pipettieren und die Zellen inkubieren, bis sich am ersten Tag Kolonien gebildet haben. Nach der Inkubation das verbrauchte Medium langsam mit einer Pipette aus den Vertiefungen entfernen, wobei die locker anhaftenden Zellen nicht gestört werden dürfen.

Dann vorsichtig vier Milliliter E GM zwei in die Vertiefungen geben und die Platte in den Inkubator zurückstellen. Kolonien erscheinen typischerweise zwischen Tag fünf und 14, dem Tag vor dem Verfahren. Bei 50 Mikrolitern Rattenschwanzkollagen.

Tragen Sie je einen Typ in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte wie zuvor auf und inkubieren Sie die Platte am Tag des Verfahrens über Nacht. Beginnen Sie damit, Zellen, die nur zwei- bis dreimal passagiert wurden, zweimal mit PBS zu waschen. Nach dem Absaugen des letzten PBS-Waschschritts platzieren Sie einen sterilen, gelbeschichteten Klonierungszylinder um jede Kolonie und drücken jeden Zylinder mit sterilen Pinzetten fest gegen die Platte.

Geben Sie zwei bis drei Tropfen warmes Triple-E-Express in jeden Klonierungszyliner und inkubieren Sie die Zylinder drei bis fünf Minuten lang, bis die Zellen beginnen, sich abzulösen. Sobald die Zellen sich abzulösen beginnen, geben Sie etwa 250 Mikroliter EGM-2-Medium in die Mitte des Zylinders und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Überführen Sie nun die Einzelzell-Suspension aus jedem Klonierungszyliner getrennt in ein individuelles Mikrozentrifugenröhrchen.

Infizieren Sie die Zellen in einer 6-Loch-Platte mit EGFP-exprimierenden Lentiviren und sammeln Sie die EGFP-exprimierenden Zellen mittels fluoreszierender Zytometrie. Inkubieren Sie anschließend die EGFP-positiven Zellen und EGM-2 in kollagenbeschichteten Platten. Wenn die E-CFCs bereit sind, sammeln Sie sie mit TripE Express, wie gerade gezeigt, und resuspendieren Sie die Zellen in EGM-2-Medium auf eine Endkonzentration von etwa 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Danach mithilfe eines Flusszytometers mit einer niedrigen Flussrate von 20 Zellen pro Sekunde jeweils eine einzelne EGP-positive ECFC pro Vertiefung in die zuvor vorbereitete, mit Kollagen beschichtete 96-Loch-Platte sortieren und das Endvolumen jeder Vertiefung mit EGM-2 auf etwa 200 Mikroliter pro Vertiefung anpassen. Anschließend ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop verwenden, um sicherzustellen, dass sich in jeder Vertiefung nur eine Zelle befindet. Die Platte über einen Zeitraum von zwei Wochen inkubieren, wobei am 14. Tag der Kultur zwei Mediumwechsel durchgeführt werden.

Waschen Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern PBS, bevor Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten fixieren. Bei eCFCs, die kein EGFP exprimieren, geben Sie nach der Fixierung mit Paraformaldehyd das Cyt-Reagenz, einen grün fluoreszierenden nukleären Farbstoff, hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Anzahl der expandierten endothelialen Zellen sichtbar zu quantifizieren, wie hier gezeigt; Vertiefungen mit einer Anzahl endothelialer Zellen von zwei bis 50 gelten als Endothelzellcluster.

Gruben mit 51 bis 2000 Zellen weisen ein geringes proliferatives Potenzial auf und gelten als eCFCs mit geringem proliferativen Potenzial; Gruben mit 2001 oder mehr Zellen gelten als eCFCs mit hohem proliferativen Potenzial. Nach dem Lösen der Zellen mit Triple-E wie zuvor beschrieben, ermitteln Sie mittels Hämocytometer und Trypanblau die Anzahl lebensfähiger Zellen der Zellkultur. Überführen Sie 2,4 Millionen lebensfähige Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, während die Zellen abzentrifugiert werden.

Mischen Sie die Bestandteile für die Gelmatrix gründlich und stellen Sie den pH-Wert unter Rühren mit Natronlauge auf 7,4 ein, wobei die Lösung auf Eis gehalten wird. Nach dem Absaugen des Überstandes resuspendieren Sie das Pellet in 360 Mikrolitern warmem eGM2. Geben Sie anschließend 840 Mikroliter der Gelmatrixlösung zu den Zellen und mischen Sie die Lösung vorsichtig, bis die Zellen gleichmäßig in dem Gel suspendiert sind. Überführen Sie diese ein Milliliter umfassende zellhaltige Gelsuspension in eine Vertiefung einer 12-Loch-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Platte, bis das Gel polymerisiert ist.

Dann vor der Übernachtung am nächsten Tag vorsichtig das Gel mit zwei Millilitern warmem EGM zwei bedecken und unmittelbar vor der Implantation. Mit Iris-Scheren das Gel in zwei gleiche Stücke zerschneiden und die Gelstücke in dasselbe Kulturwell enthalten e GM zwei Medium zurückführen. Nach Bestätigung der Sedierung durch Zehenquetschung den Unterbauch einer fünf bis sechs Wochen alten anästhesierten nod, skid Maus rasieren und den Operationsbereich durch abwechselndes Rotieren von Alkohol- und Betadine-Pads gründlich reinigen.

Als Nächstes einen etwa fünf Millimeter langen Schnitt im unteren Quadranten des Bauches mit sterilen, scharfen Iris-Scheren führen, wodurch der subkutane Raum zwischen Haut und Bauchmuskulatur freigelegt wird. Die Dermalis von der Bauchmuskulatur in zwei verschiedenen Bereichen des Bauches stumpf dissezieren, um 15 bis 20 Millimeter breite Taschen zu bilden, eine führt in den oberen Bauchquadranten, die andere in einen weiteren Bereich des Bauches. Anschließend die Dermalis direkt neben der Schnittstelle anheben.

Legen Sie ein halbes Gel-Stück in eine Bauchtasche und das andere halbe Gel-Stück in die andere Bauchtasche. Nachdem die Gele eingesetzt wurden, verschließen Sie jeden Schnitt mit zwei bis drei Stichen unter Verwendung von 5-0-Polypropylen-Nähten an einer Skalpellnadel. Beschriften Sie die Käfigkarten und führen Sie die postoperative Überwachung und Analgesie gemäß den institutionellen und protokollbasierten Anforderungen durch.

Nach der Tötung des Tieres am 14. Tag nach der Implantation den Bauch der Maus mit Alkoholtupfern abwischen und die Haut entlang der ursprünglichen Schnittlinie einschneiden. Anschließend Hautlappen um die wahrscheinliche Position der Gele herum entfernen. Um die einzelnen Implantate herum kreisförmig schneiden, um sie zu entnehmen, und die entnommenen Implantate in den Zinkfixator legen.

Mit dieser ECFC-Differenzierungstechnik haben wir eine Auswanderung der primären Koloniebildung bereits am fünften Tag beobachtet. Beachten Sie die kieselsteinartige Morphologie dieser ECFC-Kulturen am fünften Tag, wie durch die Pfeilspitzen angezeigt. Ausgebreitete Kolonien exprimieren endotheliale Antigene, jedoch keine hämatopoetischen Antigene.

Wie in dieser repräsentativen in-vitro-phenotypischen Beurteilung von endothelialen und hämatopoetischen Zellen gezeigt, hat die Immunphänotypisierung ergeben, dass eKBFs endotheliale Antigene wie CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, flick1, flip4 und NRP2 exprimieren, jedoch keine hämatopoetischen Antigene wie CD45, CD14, CD11b, c-Kit, CXCR4 oder CD133. Wichtig ist, dass – wie in diesem Balkendiagramm dargestellt – expandierte Kolonien eine vollständige Hierarchie klonaler proliferativer Potenziale auf Einzelzellniveau aufweisen, die von Zellhaufen mit zwei bis 50 Zellen bis hin zu Kolonien mit mehr als 2001 Zellen reichen. Diese Mikroaufnahmen von Kolonien, die mit Cyt, einem grün fluoreszierenden Kernfarbstoff, gefärbt wurden, entstanden, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene eKBFs 14 Tage lang auf Einzelzellniveau kultiviert worden waren.

Außerdem bilden eKZK humanisierte Blutgefäße aus, die bei Implantation in immundefiziente Mäuse mit Wirtserythrozyten durchströmt werden. Bei dieser H-und-E-Färbung von aus Nabelschnurblut stammenden eKZK-haltigen CELLULARIZE-Gel-Implantaten sind Mikrogefäße zu erkennen, die sich im Kollagen-Fibronektin-Gel nach 14 Tagen Implantationszeit gebildet haben und mit Wirtserythrozyten gefüllt sind. Hier bestätigt die anti-humanen CD31-Färbung in Braun zusätzlich den humanen Ursprung dieser Gefäße.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eCFCs aus menschlichem Nabelschnurblut gewinnt sowie die Klonierung, Expansion und Charakterisierung der Funktionalität von ECFC-Kolonien nach ihrer Entwicklung durchführt. Diese Technik ebnete den Forschern im Bereich des vaskulären Endothels den Weg, um das endotheliale klonale Proliferationspotenzial und die genetische Kapazität von Endothelzellen, die aus verschiedenen Quellen gewonnen wurden, zu untersuchen.