Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu erklären, wie endotheliale koloniebildende Zellen oder e FCKW aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnen werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus dem Nabelschnurblut plattiert und dann die Kolonieauswüchse von E-FCKW kloniert und expandiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in vitro mit einer neuartigen Einzelzell-Assay-Technik auf klonales proliferatives Potenzial zu charakterisieren.

Schließlich werden die Zellen in einem in vivo gefäßbildenden Assay durch die Herstellung und Implantation von E-FCKW-haltigen Gelen in Nod-Skid-Mäusen charakterisiert. Letztendlich kann die in vivo Bildung von de novo mit Wirtsblut gefüllten Gefäßen durch h und e Färbung der ECFC mit zellulären Implantaten bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass diese Methoden die Untersuchung des proliferativen Potenzials von Endothelzellen auf Einzelzellebene ermöglichen.

Die Implikationen dieser Technik könnten auf die Suche nach diagnostischen und therapeutischen Instrumenten für Krankheiten wie die wilde arterielle Störung (pAVK) ausgeweitet werden, da diese Technik es uns ermöglicht, das proliferative Potenzial und die genetische Kapazität der Endothelzellen eines Patienten zu untersuchen. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, fügen Sie einen Milliliter Rattenschwanzkollagen hinzu, geben Sie einen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte ein und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht am Tag des Eingriffs, aliquotieren Sie das Nabelschnurblut in 15-Milliliter-Einheiten in konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 20 Milliliter PBS in jedes Röhrchen und pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab.

Ziehen Sie anschließend 15 Milliliter fial PA in eine Pipette, setzen Sie die Spitze der Pipette auf den Boden des Röhrchens mit verdünntem Blut und legen Sie das Alpac-Zentrifugieren Sie vorsichtig unter die Alpac-Zentrifuge, zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 740-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur, ohne dass die Verzögerungsbremse eingestellt ist. Verwenden Sie nach der Zelltrennung eine Transferpipette, um die trübe Schicht aus mononukleären Zellen niedriger Dichte zu entfernen, die sich an der Grenzfläche zwischen dem Fial-Peak und dem verdünnten Plasma befindet. Die gesammelten Zellen werden in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern E GM two Medium gegeben und die mononukleären Zellen 10 Minuten lang bei 515 mal G bei Raumtemperatur mit der Bremseinstellung mit hoher Verzögerung pelletiert, den Überstand vorsichtig aspiriert und verworfen.

Nach dem Waschen der pelletierten Zellen mit EGM zwei zweimal resus suspendieren Sie sie mononukleäre Zellen in EGM zwei bei 1,25 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie nun vier Milliliter der mononukleären Zellsuspension in jede Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte und inkubieren Sie die Zellen, bis sich am ersten Tag Kolonien bilden. Entfernen Sie nach der Inkubation das verbrauchte Medium langsam mit einer Pipette aus den Vertiefungen, ohne die locker anhaftenden Zellen zu stören.

Geben Sie dann vorsichtig vier Milliliter E GM zwei in die Vertiefungen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Die Kolonien treten in der Regel zwischen dem fünften und 14. Tag am Tag vor dem Eingriff auf. Bei 50 Mikrolitern Rattenschwanzkollagen.

Geben Sie wie zuvor eins in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte am Tag des Eingriffs über Nacht. Beginnen Sie mit dem Waschen von Zellen, die nur zwei- bis dreimal zweimal mit PBS durchlaufen wurden. Nach dem Aspirieren der letzten PBS-Wäsche legen Sie einen sterilen, mit Gel beschichteten Klonierungszylinder um jede Kolonie und drücken Sie jeden Zylinder mit einer sterilen Pinzette fest gegen die Platte.

Geben Sie zwei bis drei Tropfen warmes Triple E Express in jeden Klonierungszylinder und inkubieren Sie die Zylinder drei bis fünf Minuten lang, bis sich die Zellen zu lösen beginnen. Nachdem die Zellen begonnen haben, sich bei etwa 250 Mikrolitern EGM abzulösen, werden zwei in die Mitte des Zylinders geleitet und auf und ab pipettiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Übertragen Sie nun die Einzelzellsuspension aus jedem Klonierungszylinder separat in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen.

Infizieren Sie die Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit EGFP-exprimierenden Lentiviren und sammeln Sie die Zellen, die EGFP exprimieren, durch Fluoreszenzzytometrie. Inkubieren Sie dann die EEG-FP-positiven Zellen und das zweite EGM in den mit Kollagen beschichteten Platten. Wenn die E-FCKW fertig sind, sammeln Sie sie mit der Auslösung E express, wie gerade gezeigt, und reann Sie die Zellen und e GM zwei Medium auf eine Endkonzentration von etwa 10 bis zum sechsten Zellen pro Milliliter.

Sortieren Sie dann mit einem Durchflusssortierer mit einer niedrigen Durchflussrate von 20 Zellen pro Sekunde eine einzelne EGP-positive ECFC pro Vertiefung in die zuvor vorbereitete kollagenbeschichtete 96-Well-Platte, passen Sie das endgültige Volumen jeder Vertiefung mit EGM zwei bis etwa 200 Mikroliter pro Vertiefung an. Verwenden Sie dann ein inverses Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung nur eine Zelle enthält. Inkubieren Sie die Platte über einen Zeitraum von zwei Wochen mit zwei Medienwechseln am 14. Tag der Kultur.

Waschen Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern PBS, bevor Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 100 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd fixieren. Für e FCKW, die kein EGFP exprimieren, fügen Sie Cyt-Reagenz, einen grün fluoreszierenden Kernfarbstoff, nach der para-Formaldehyd-Fixierung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Anzahl der expandierten Endothelzellen sichtbar zu quantifizieren, wie hier gezeigt: Vertiefungen mit einer Endothelzellzahl von zwei bis 50 gelten als Endothelzellcluster.

Vertiefungen mit 51 bis 2000 Zellen sind FCKW mit niedrigem proliferativen Potential und Vertiefungen mit 2001 oder mehr gelten als e-FCKW mit hohem proliferativen Potential. Nach dem Ablösen der Zellen mit Triple E Express wie zuvor erhalten Sie eine lebensfähige Zellzahl der Zellkultur mittels Hämo, Zytometer und Trianblau. Übertragen Sie 2,4 Millionen lebensfähige Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen dann durch Zentrifugation, während die Zellen heruntergeschleudert werden.

Mischen Sie die Komponenten für die Gelmatrix gründlich und stellen Sie dann den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,4 ein, während Sie die Lösung auf Eis halten. Nach dem Verwerfen des Überstands das Pellet in 360 Mikrolitern warmem e GM zwei resuspendieren. Geben Sie dann 840 Mikroliter der Gelmatrixlösung zu den Zellen und mischen Sie die Lösung vorsichtig, bis die Zellen vollständig im Gel suspendiert sind. Übertragen Sie diese einen Milliliter zellularisierte Gelsuspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Platte, bis das Gel polymerisiert.

Decken Sie das Gel dann vor der Inkubation über Nacht am nächsten Tag und unmittelbar vor der Implantation vorsichtig mit zwei Millilitern warmem EGM zwei ab. Verwenden Sie eine Irisschere, um das Gel in zwei gleiche Stücke zu zerlegen, und geben Sie die Gelstücke wieder in dieselbe Kulturvertiefung, die e GM zwei Medium enthält. Nach Bestätigung der Sedierung durch Zehenkneifen rasieren Sie den Unterbauch eines fünf bis sechs Wochen alten anästhesierten Nickers, schieben Sie die Maus und reinigen Sie die Operationsstelle gründlich, indem Sie Alkohol- und Betadin-Pads rotieren.

Als nächstes machen Sie mit einer sterilen, scharfen Irisschere einen etwa fünf Millimeter großen Schnitt im unteren Quadranten des Bauches, wodurch der subkutane Raum zwischen der Haut und dem Bauchmuskel freigelegt wird. Stumpf. Präparieren Sie die Hautschicht vom Bauchmuskel in zwei verschiedenen Bereichen des Bauches, um 15 bis 20 Millimeter breite Taschen zu schaffen, von denen eine über dem oberen Bauchquadranten und die andere in einen anderen Bereich des Bauches führt. Dann heben Sie die Hautschicht an und verhätscheln Sie einfach bis zum Schnitt.

Führen Sie ein halbes Stück des Gels in eine Bauchtasche und das andere halbe Stück Gel in die andere Bauchtasche ein. Nachdem die Gele eingelegt wurden, verschließen Sie jeden Schnitt mit zwei bis drei Stichen mit fünf oh Polypropylen-Nähten auf einer Schneidenadel. Beschriften Sie die Käfigkarten und führen Sie eine postoperative Überwachung und Analgesie gemäß den institutionellen und protokollarischen Anforderungen durch.

Nachdem Sie das Tier am 14. Tag der Implantation getötet haben, tupfen Sie den Bauch der Maus mit Alkoholtupfern ab und schneiden Sie die Haut, die an der ursprünglichen Schnittlinie verhätschelt ist. Dann werden die Hautlappen an die wahrscheinliche Stelle der Gele verhätschelt. Schneidet umlaufend um die Gele herum, um jedes Implantat zu entfernen, und setzt dann die herausgeschnittenen Implantate in das Zinkfixiermittel ein.

Mit dieser ECFC-Ableitungstechnik haben wir das Auswachsen der primären Koloniebildung bereits am fünften Tag beobachtet. Man beachte die Kopfsteinpflaster-Morphologie dieser fünf ECFC-Kulturen, die durch die Pfeilspitzen angedeutet sind. Expandierte Kolonien exprimieren endotheliale Antigene, aber keine hämatopoetischen Antigene.

Wie in dieser repräsentativen in vitro phänotypischen Bewertung von endothelialen und hämatopoetischen Zellen gezeigt, hat die Immunphänotypisierung gezeigt, dass e FCKW endotheliale Antigene wie CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four und NRP two exprimieren, aber keine hämatopoetischen Antigene, CD 45, CD 14, CD 11 BC Kit, CXCR four oder CD 1 33. Wichtig ist, dass, wie in diesem Balkendiagramm dargestellt, expandierte Kolonien eine vollständige Hierarchie des klonalen proliferativen Potenzials auf Einzelzellebene aufweisen, die von Clustern von zwei bis 50 Zellen bis hin zu Kolonien von mehr als 2001 reicht. Diese Mikroskopaufnahmen von Kolonien, die mit Cyt, einem grün fluoreszierenden Kernfarbstoff, gefärbt wurden, wurden erhalten, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene E-FCKW 14 Tage lang auf Einzelzellebene kultiviert wurden.

Darüber hinaus bilden e-FCKW humanisierte Blutgefäße, die bei der Implantation in immundefiziente Mäuse mit roten Blutkörperchen des Wirts durchblutet sind. Bei dieser h und e Färbung von aus Nabelschnurblut gewonnenen ECFC, die CELLULARIZE Gel-Implantate enthalten, können Mikrogefäße beobachtet werden, die mit roten Blutkörperchen des Wirts gefüllt sind, die sich im Kollagen-Fibronektin-Gel nach 14 Tagen nach der Implantation gebildet haben. Hier bestätigt die Anti-Human-CD 31-Färbung in Braun die menschliche Herkunft dieser Gefäße zusätzlich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man FCKW aus menschlichem Nabelschnurblut gewinnt und wie man ECFC-Kolonien nach ihrer Entwicklung klont, erweitert und ihre Funktionalität charakterisiert. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im vaskulären Endothel, um das endotheliale klonale proliferative Potenzial und die genetische Kapazität von Endothelzellen zu erforschen, die aus mehreren Quellen gewonnen werden.