Name: Sexuelle Entwicklung und Ascosporenausschleuderung in Fusarium graminearum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Induktion sexueller Entwicklung und Sporenausschleuderung bei Fusarium graminearum. Diese Techniken ermöglichen genetische Kreuzungen und Mutanten-Screening für die pilzbiologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (MCB-0923794 bis FT) unterstützt.

1. Producing Perithecien <ol><li> Zentrale inokulieren Karotten-Agar 10 in einer 6,0 cm Durchmesser Petrischale mit einer fruchtbaren Stamm von F. graminearum (PH empfehlen-1). </li><li> Ort beimpften Schalen unter hellen Leuchtstoffröhren bei Raumtemperatur (18-24 ° C) und erlauben zu wachsen, bis Myzel den äußeren Rand der Petrischale (3-5 Tage) erreicht hat. Kommerzielle Haushalt Leuchtstoffröhren arbeiten für die Stimulierung Fruchtkörper Bildung und Entladung in Ordnung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Luftmycelien mit einem sterilen Zahnstocher. </li><li> Verteilen 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq an der Oberfläche mit einem sterilen Glas Hockeystick oder abgerundeten Ende einer sterilen Glasstab. </li><li> Zurück Platten ans Licht. Fügen Sie nicht zu Parafilm Platten. </li><li> Nach 24 Stunden sollte die Oberfläche der Platten haben ein glänzendes Aussehen. Wenn Myzelien erscheint wieder, kratzen Oberfläche und erneut bewerben Tween-60-Lösung. </li><li> Beobachten Sie die Entwicklung der Perithecien in der nächsten Woche. Die intermediären Stufen derPerithecium Entwicklung kann durch sanftes Abkratzen der Oberfläche des Agar und Flash zur RNA-Extraktion (1) gefroren geerntet werden. </li><li> Reifen Sporen werden auf dem Deckel der Platte bis zum Tag 7 ansammeln. Zunächst werden diese nur sichtbar, unter einem Binokular, sondern von Tag 9, sie werden um eine ausreichende Dichte angesammelt haben, so dass sie mit bloßem Auge. </li></ol> 2. Ascosporenausschleuderung Assay <ol><li> Am Tag 6 nach der Anwendung von Tween-Lösung, schneiden Sie ein 1 cm Durchmesser Kreise aus dem Agar mit einem Holz-Bohrer. Alternativ kann ein Skalpell verwendet, um eine ähnlich große Segment entfernt werden. Der Kreis kann in zwei Hälften geschnitten und jede Hälfte platziert auf einem Objektträger. </li><li> Orient die Stücke so dass die Oberfläche mit den Fruchtkörper senkrecht zu der Oberfläche der Folie, und die Sporen sind über die gesamte Länge des Schiebers gebrannt. </li><li> Legen Sie den Objektträger in einer feuchten Kammer über Nacht unter Beleuchtung. Die Sporen werden auf akkumulierender Schieber und sichtbar für das bloße Auge am nächsten Morgen (Abbildung 2). </li><li> Kumulierte Sporen können aus der Folie mit Wasser gewaschen und quantifiziert werden, falls gewünscht. </li><li> Mögliche Sporenemission Inhibitoren können, indem sie in der Rückseite des Agarblock bei der Montage des Assays getestet werden. Einige Ionenkanal-Inhibitoren, die Entladung zu verringern wurden bereits mit dieser Technik 15 getestet. </li></ol> 3. Erzeugung von rekombinanten Nachkommen <ol><li> Initiieren Sie durch Impfen Karotten-Agar mit zwei Stämme von F. überqueren graminearum (ein Nit + und ein nit-), indem die Impfung Punkte auf gegenüberliegenden Seiten der Petrischale. </li><li> Sobald Hyphen haben die Oberfläche gefüllt, abkratzen Antenne Teil und gelten Tween-60-Lösung wie oben beschrieben. Verwenden Sie einen Marker, um auf der Seite der Petrischale, wo die Hyphen erfüllen beachten. </li><li> Zurück Kulturen zu Licht und inkubieren bis Perithecien entwickelt haben, und cirrhi haben seinPistole aus der Perithecien entlang der Schnittlinie zwischen den beiden Kulturen zu bilden. </li><li> Unter dem Binokular, bringen in den Blick der Perithezien entlang der Schnittlinie der beiden Kulturen. Mit Hilfe eines Insekts Pin, sterilisiert und in sterilem Wasser getaucht, berühren Sie eine Cirrus entlang dieser Grenze leicht mit der Spitze des Stifts. Die Feuchtigkeit auf den Stift sollte es den Cirrus, um den Stift zu halten. </li><li> Spülen Sie die Spitze des Stifts mit der Cirrus darauf in 200 ul sterilem Wasser in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Sporen abwaschen. </li><li> Flamme der Stift, befeuchten Sie es erneut und wählen Sie ein anderes Cirrus. Haupt 10-15 cirrhi, und jeden in einem separaten Röhrchen Wasser. </li><li> Vortexen Röhrchen mit cirrhi suspendiert. </li><li> Entfernen 60 ul der Sporensuspension mit einer Pipette und auf MMTS Medium 1 in einer 9 cm-Petrischale. Verbreiten Sie mit einer sterilen Hockeyschläger. Der verbleibende Sporensuspension kann bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden und bei Bedarf erneut ausplattiert. </li><li> Incubate bei Raumtemperatur (Licht nicht notwendig) für 3-5 Tage, bis sehr kleine Kolonien erscheinen (Abbildung 3). Es werden zwei Arten von Phänotypen zu den Kolonien. Die NIT-Kolonien haben spärlicher als die Hyphen Nit +-Kolonien. Cirrhi von rekombinantem Perithecien zeigen beide Phänotypen Kolonie in etwa gleichen Anteil. Entsorgen Sie die Platten mit Kolonien von nur einem einzigen Phänotyp auf sie. Beachten Sie, dass manchmal mehr als zwei Phänotypen durch Segregation von anderen Faktoren zur Folge haben. </li><li> Bewegen Sie Kolonien auf V8-oder Karotten-Agar für die Lagerung. Test-Kolonien auf Czapek Dox-Agar &#39;s (die nit-Stämme nicht auf Czapek Dox die wachsen) und auf PDA mit Chlorat (0,5 M Kaliumchlorat; die Nit +-Stämme nicht auf PDA mit Chlorat wachsen), um die richtige Phänotyp zu bestätigen. Untersuchen Sie diese Kolonien für die gewünschten Qualitäten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Producing Perithezien Das Ziel ist, einen Rasen habenPerithezien ohne Myzelien oder Sporen sichtbar. Die Oberfläche der Kultur erscheint wie in schwarzem Samt (Abbildung 1). Nach 24 Stunden nach der Anwendung der Tween die Oberfläche des Agar sollte eine leichte Glanz. Wenn Myzelien wieder auftauchen, dann kann die Platte nicht gekratzt haben genug zu Perithecium Entwicklung zu induzieren. Ascosporenausschleuderung Immer in Ihrer Assay mehrere Blöcke von Agar bieten von der Wildtyp-Stamm. Wenn diejenigen, die nicht tun, Feuer, dann ist entweder Ihre Perithezien sind zu jung oder zu alt. Wenn sie zu alt sind, können zur Hyphen wird über die Oberfläche der Kultur gibt es eine weißliche Farbe angezeigt. Ist dies nicht der Fall, können sie zu jung sein, und der Test sollte in 24 Stunden erneut versucht werden. Gelegentlich haben Kulturen nicht gut zu entladen, und das Experiment muss wiederholt werden. Achten Sie darauf, Sie führen den Test unter den richtigen Lichtverhältnissen. Rekombinante Nachkommen <p class="jove_content"&gt; Rekombinante sollte Perithezien bilden die Mehrheit der Perithezien entlang der Schnittlinie zwischen den beiden Stämmen. Wir verarbeiten in der Regel 10 cirrhi aus einer Kreuzung und mindestens 4-6 derer sein sollte rekombinantes. In seltenen Fällen verhindert, dass eine Mutation eines Stammes aus der Paarung. Wenn ein Elternteil eine aberrante Wachstum Phänotyp, dann mehr als 2 Phänotypen können unter den Kolonien auf MMTS vorhanden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Abbildung 1. Stadien der Entwicklung Perithecium auf Karotten-Agar. Linke, 72 h nach der Anwendung von Tween. Beachten Sie, rotes Pigment und sehr junge Perithecien sichtbar als schwarze Körner auf der Oberfläche. Richtig, bei 144 h, haben reifen Perithecien gebildet. Beachten Sie nahezu vollständigen Fehlen von oberflächlichen Myzelien in beiden Kulturen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Abbildung 2. Discharge-Test. Die orangefarbene Karotte Agarpfropfen ist so ausgerichtet, that Sporen zwangsweise aus dem reifen Perithecien auf seiner Oberfläche entladen kann auf der Oberfläche des Objektträgers zu akkumulieren. 15 Stunden Akkumulations-Zeit. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Abbildung 3. Unterschiede im Wachstum zwischen Nit + und Nit-Kolonien auf selektiven MMTS Medium. Die NIT-Kolonien (Pfeilspitzen) sind kleiner. Die Nit +-Kolonien (Pfeile) zeigen ein robustes Wachstum. Foto nach 7 Tagen genommen.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

F. graminearum ist besonders gut auf das Studium der Fruchtkörper Entwicklung aufgrund der Verfügbarkeit eines gut kommentierten Genoms (angepasst <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> , 4), und die Verfügbarkeit eines Affymetrix- Basis Microarray-6. Dies hat die Fähigkeit, Gene, die für Sporenemission 7,11,3 identifizieren erleichtert. Die hier vorgestellten Methoden wird es der Forscherin, auf einer bestimmten Reihe von Entwicklungsstadien und Funktionen für die genetische Analyse der Fruchtkörper von F. konzentrieren graminearum. Die Verfahren sind ebenfalls leicht an erhältlichen Pilze, die Früchte in Kultur induziert werden kann, und kann als Standard für die Entwicklung in einer Vielzahl anderer Pilz Fruchtkörper Typen verwendet werden. Die Fähigkeit, eine Spore Brennen Phänotyp beurteilen kann bei Arten, wo Sporen sind klein und schwer zu sehen, wie subtil <em&gt; F. graminearum. Die Sammlung von Sporen auf einen sauberen Objektträger erleichtert sowohl die visuelle Beurteilung und quantitative Bewertung, als Sporen aus können Sie die Folie gewaschen und quantifiziert. Einige Pilzarten produzieren einen Schleim, die ihre Sporen und die Sporen können nicht abgespült werden umgibt, muss aber mikroskopisch gezählt werden, da sie auf der Folie bleiben. Wir haben das gefunden um wahr zu sein von Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum PH-1-Stamm </td><td> Fungal Genetics Stock Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Czapek Dox-Agar die </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Kaliumchlorat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexuelle entwicklung und ascosporenausschleuderung in fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum hat sich zu einem Modellsystem für Studien in der Entwicklung und Pathogenität der Fadenpilze. F. graminearum am leichtesten produziert Fruchtkörper, genannt Perithezien, auf Karotten-Agar. Perithecien enthalten zahlreiche Gewebearten, in bestimmten Phasen der Entwicklung Perithecium produziert. Dazu gehören (in der Reihenfolge ihres Auftretens) Bildung der Perithecium Initialen (was Anlass zu der ascogenen Hyphen), die Außenwand, Paraphysen (sterile Myzelien, die das Zentrum des Perithecium besetzen, bis die Asci entwickeln), die Asci, und die Ascosporen innerhalb der Asci 14. Die Entwicklung jedes dieser Gewebe wird von ungefähr 24 Stunden getrennt und war die Grundlage der Transkriptom-Studien während der sexuellen Entwicklung 12,8. Siehe Hallen et al. (2007) für eine ausführliche Beschreibung der Entwicklung, darunter Aufnahmen von jeder Etappe. Hier präsentieren wir die Methoden zur Erzeugung und Ernte von synchronenly Entwicklung von Rasenflächen Perithezien für zeitliche Untersuchungen der Genregulation, Entwicklung und physiologischen Prozessen. Obwohl diese Methoden sind speziell auf die mit F. verwendet werden geschrieben graminearum, können die Techniken für eine Vielzahl von anderen Pilzen verwendet werden, vorausgesetzt, dass Fruchtkörper in Kultur induziert werden und es gibt synchron zur Entwicklung. Vor kurzem haben wir dieses Protokoll angepasst, um die sexuelle Entwicklung von F. untersuchen verticillioides. Obwohl einzelne Perithecien müssen Hand in dieser Art aufgenommen werden, weil ein Rasen entwickeln Perithezien nicht induziert werden konnte, arbeitete das Verfahren auch zur Untersuchung von Entwicklung (Sikhakolli und Trail, unveröffentlicht). Die wichtigste Funktion von Pilzfruchtkörper ist die Verbreitung der Sporen. In vielen der Arten der Ascomycota (Ascus Herstellung Pilze), werden die Sporen aus dem Ascus gedreht, aufgrund der Erzeugung der Turgordruck im Ascus, Antreiben Ausstoßen von Sporen (und epiplasmic Fluid) durch diePore ​​in der Spitze 2,7 Ascus. Unsere Untersuchungen der gewaltsamen Sporenemission haben in der Entwicklung eines &quot;Sporenausstoß Assay&quot;, die wir verwenden, um auf Mutationen in den Prozess Bildschirm führte. Hier präsentieren wir Ihnen die Details dieses Tests. F. graminearum ist homothallischen, und somit kann Fruchtkörper in der Abwesenheit eines kompatiblen Partner bilden. Der Vorteil ist, dass homothallism Kreuzung ist nicht notwendig, Nachkommen homozygot für ein bestimmtes Merkmal, eine Facette, die die Untersuchung der sexuellen Entwicklung ermöglicht hat bei dieser Art 14,7 erzeugen. Allerdings haben heterothallisch Stämme wurden generiert, die für das Überschreiten der 5,9 verwendet werden. Es ist auch möglich, homothallischen Stämme kreuzen, um Mutanten für mehrere Gene in einem Stamm 1 zu erhalten. Dies wird durch coinoculating einer Petrischale mit 2 Stämmen durchgeführt. Entlang der Treffpunkt, wird die Mehrheit der Perithezien rekombinant sein (vorausgesetzt, die eine Mutation in einem der Elternstämme nicht hemmtAuskreuzung). Als Perithecien Alter, verströmen sie Ascosporen en masse statt gewaltsam entladen sie. Die resultierenden Sporen Exsudat (eine so genannte Cirrus) liegt an der Spitze des Peritheciums und kann leicht für die Rückgewinnung von einzelnen Sporen entfernt werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Identifizierung von rekombinantem Perithecien und die Gewinnung von rekombinanten Nachkommen zu erleichtern.

Sexuelle Kreuze und Isolierung von rekombinanten Nachkommen sind wichtige Werkzeuge für die Forschung Fadenpilz,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Die Techniken, die notwendig erfolgreiche Durchführung dieser Prozesse vorgestellt werden.

Sexuelle Entwicklung und Ascosporenausschleuderung in Fusarium graminearum</em

*Fusarium graminearum* hat sich zu einem Modellsystem für Studien zur Entwicklung und Pathogenität von filamentösen Pilzen entwickelt. *F. graminearum* produziert am leichtesten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu lernen, wie man die Entwicklung von Parathesien erzeugt und manipuliert sowie die APO-Ausschüttung in der Kultur untersucht. Dies wird erreicht, indem zunächst die sexuelle Entwicklung durch Induktion und aktives Kultivieren der Kultur eingeleitet wird. Im zweiten Schritt wird die aktive Sporenfreisetzung nachgewiesen, woraufhin rekombinante Parathesien erzeugt werden.Der letzte Schritt besteht darin, die Nachkommen auf Phänotypen zu untersuchen, die anzeigen, ob eine Rekombination stattgefunden hat. Letztendlich können die Ergebnisse dazu verwendet werden, Mutanten in der sexuellen Entwicklung zu identifizieren oder mehrere Mutationen innerhalb eines Stammes zu erzeugen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte schwer zu beschreiben sind und präzise durchgeführt werden müssen, um eine optimale Sporenfreisetzung und eine konsistente Produktion von Parathesien zu erzielen, obwohl sie einfach erscheinen.Beginnen Sie mit der zentralen Inokulation eines Karottenaugers in einer sechs Zentimeter großen Petrischale mit einem fruchtbaren Stamm von f. graminearum. Inkubieren Sie die beimpften Schalen unter hellem, handelsüblichem fluoreszierendem Licht bei Raumtemperatur.Lassen Sie die Pilze drei bis fünf Tage wachsen, bis das Myzel den äußeren Rand der Schale erreicht hat. Unter dem Abzug kratzen Sie vorsichtig die Oberfläche der Kultur mit dem sterilen Abstrichstäbchen ab, um die Luftmycelien zu entfernen.Dann ein Milliliter Tensid auf die Schnecke auftragen und mit dem gebogenen oder kugelförmigen Ende eines sterilen Glasstabs in die Oberfläche einreiben. Ohne Perfil aufzutragen. Die Platten anschließend wieder unter die Beleuchtung stellen.Nach 24 Stunden sollte die Oberfläche der Platten glänzend erscheinen. Falls Mycelien erneut auftreten, erneut abkratzen, Oberfläche behandeln, Tween-60-Lösung erneut auftragen und für weitere 24 Stunden dem Licht aussetzen. Beobachten Sie nun die Entwicklung der Parästhesien eine Woche lang.Junge Parathesien sind als schwarze Körner auf der Oberfläche des Augers sichtbar. Im Vergleich zu reifen Parathesien sollten nahezu keine oberflächlichen Mycelien vorhanden sein.Am siebten Tag sammeln sich reife Sporen auf dem Deckel der Petrischale an, und am neunten Tag sind die Sporen so dicht, dass sie ohne Vergr&ouml;&szlig;erung sichtbar sind. Um das Zwischenstadium zu gewinnen, kratzen Parathesien vorsichtig die Oberfl&auml;che des Bohrers mit einem Skalpell ab und &uuml;berf&uuml;hren die Parathesien in ein Kryor&ouml;hrchen. Das R&ouml;hrchen kann anschlie&szlig;end sechs Tage nach Auftragen des Tensids f&uuml;r die RNA-Extraktion schockgefroren werden.Schneiden Sie mit einem Holzbohrer, Bohrer oder Skalpell einen Kreis mit einem Durchmesser von einem Zentimeter aus dem Bohrkern aus. Teilen Sie den Kreis der Länge nach und montieren Sie die Hälften auf einem Glasobjektträger, sodass die Oberfläche mit den Fruchtkörpern senkrecht zur Oberfläche des Objektträgers steht und die Sporen entlang der Länge des Objektträgers abgeschossen werden. Falls zu diesem Zeitpunkt ein Acro-Sporeninhibitor gewünscht ist, tragen Sie ihn auf die Rückseite des Bohrkernstücks auf.Mithilfe dieser Technik können Chemikalien auf entladungshemmende Wirkung getestet und genetische Mutanten auf den Verlust der Sporenfreisetzungs-Fähigkeit untersucht werden; beides haben wir erfolgreich durchgeführt. Inkubieren Sie nun die Objektträger über Nacht in einer einfachen, beleuchteten Kammer bei Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit. Während die Fruchtkörper ausschießen, sammeln sich Sporen auf dem Objektträger und sind am nächsten Morgen sichtbar.Angesammelte Sporen können nun von dem Objektträger abgewaschen, in einer sauberen Schale gesammelt und quantifiziert werden. Beginnen Sie mit dem Aufbau einer genetischen Kreuzung zwischen zwei Stämmen von f gramine arum, indem Sie diese auf gegenüberliegenden Seiten einer Karotten-Agar-Platte beimpfen. Wie zuvor beschrieben, kultivieren Sie die Pilze, bis die Hyphien die Oberfläche vollständig besiedelt haben.Entfernen Sie die oberirdischen Teile ab und geben Sie T zwischen 60 Lösung hinzu. Markieren Sie in diesem Fall die Stelle auf der Platte, an der die Hyphen zusammentreffen. Stellen Sie die Kulturen wieder ins Licht und inkubieren Sie sie etwa sieben Tage lang, bis die Parathesien entwickelt sind und Siri aus den Parathesien entlang der Schnittstelle zwischen den Kulturen zu bilden beginnen.Mithilfe dieser Technik können mehrere Mutationen in einen einzigen Stamm kombiniert werden. Es ist außerdem erwähnenswert, dass sowohl knit plus als auch knit minus als sehr nützliche selektierbare Marker ausgewählt werden können. Bringen Sie unter dem Stereomikroskop die Parästhesie entlang der Schnittstelle der beiden Kulturen in den Sichtbereich.Danach das Sear-Auge finden. Anschließend einen sterilisierten Insektennadel in steriles Wasser eintauchen und die Nadel an eine am Rand zwischen den Kulturen gebildete seröse Stelle bringen. Die SRIs sollten an der Feuchtigkeit der Nadel haften bleiben.Anschließend spülen Sie die Spitze des Öse in 200 Mikrolitern steriler Wasser, die sich in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen befinden. Glühen Sie die Öse ab, befeuchten Sie sie erneut und entnehmen Sie eine weitere sru. Entnehmen Sie zwischen drei und fünf Siri und überführen Sie sie jeweils in ein eigenes Röhrchen.Vortexen Sie nun kurz. Jedes Rohr enthält suspendierte Siri für jedes Rohr. Verteilen Sie 60 Mikroliter Sporensuspension auf einer neun Millimeter großen Petrischale.Mit MMTS-Medium die Platten bei Raumtemperatur mit oder ohne Licht inkubieren und die restliche Sporensuspension bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius lagern. Nach drei bis fünf Tagen erscheinen sehr kleine Kolonien auf der Platte. Ein Phänotyp kann unter dem Mikroskop erfasst werden.Negativ kolonien weisen eine geringere Hyphen-Dichte auf als positiv kolonien. Verwerfen Sie die Platten, auf denen nur eines der beiden Phänotypen vorliegt. Die Kolonien aus rekombinanter Parathesie zeigen beide Koloniephänotypen in annähernd gleichen Anteilen.Bewahren Sie diese Platten auf. Manchmal treten andere Phänotypen aufgrund der Segregation weiterer Faktoren auf, wie beispielsweise Kolonien, die für Lagerungszwecke zwischen knit-positiv und knit-negativ liegen. Übertragen Sie die Kolonien von den rekombinanten Platten auf eine V-eight- oder Karottenbohrerplatte, um die Untersuchung fortzusetzen, indem Sie andere Phänotypen analysieren. Impfen Sie die Kolonien auf Chap-X-docks Bohrerplatte und auf Platten mit PDA, die Chlorat enthalten. Parathesia wurden zu einem schwarz-velvetartigen Rasen ohne jegliches Mycel oder Sporen kultiviert.24 Stunden nach der Anwendung von Tween wies die Oberfläche des Bohrers einen leichten Glanz auf. Falls Mycelien erneut aufgetreten waren, war die Platte möglicherweise nicht ausreichend abgeschabt worden, um die Entwicklung von Parästhesien auszulösen. Mehrere Bohrerblöcke mit Fruchtkörpern eines Wildtyp-Stamms wurden so eingerichtet, dass sie ihre Sporen auf Objektträger abfeuerten, um diese zu beobachten.Die richtige Beleuchtung zum Auslösen wurde vorbereitet. Parathesien, die zu jung oder zu alt waren, feuerten oft nicht. Wenn sie zu alt waren, erschienen zahlreiche Hyphen auf der Oberfläche der Kultur, wodurch sie einen weißlichen Farbton erhielt.Wenn die Fruchtkörper zu jung waren, lösten sie kein Abfeuern aus, und das Experiment wurde wiederholt. 24 Stunden später, wenn 10 Siri aus einem Kreuzungsansatz gewonnen wurden, waren typischerweise mindestens sechs rekombinant, wie durch eine Mischung aus strick-negativen und strick-positiven Phänotypen bestimmt. Gelegentlich verhinderte eine Mutation, dass ein Stamm sich verpaarte.Wenn einer der Eltern einen offensichtlichen Wachstumsphänotyp aufwies, waren mehr als zwei Phänotypen unter den Kolonien auf MMTS vorhanden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mit einer Kultur zu beginnen, die gut gepflegt wurde und nicht über längere Zeit hinweg sequenziell übertragen wurde. Beginnen Sie stets mit einer Kultur, die aus einem stabilen Gefriersockel gezüchtet wurde.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in Gibberella zeae, ein Verfahren für die Sammlung unter sterilen Bedingungen gefilmt wird, um ein Höchstmaß an Informationen für die Protokoll-Beschreibung zu generieren. Dies sollte die Reproduzierbarkeit der Experimente, ein entscheidender Aspekt, wenn sie voll Genom Expressionsprofil Tests durchgeführt werden.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Wir bieten eine reproduzierbare Basismethode für die Langzeitmikroskopie des sexuellen Lebenszyklus der Spalthefe an. Mit geringfügigen Anpassungen, die beschrieben werden, ermöglicht das vorgestellte Protokoll die Fokussierung der Forschung auf verschiedene Schritte des Fortpflanzungsprozesses.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

Probleme bei der Verarbeitung biologischer Proben für die Rasterelektronenmikroskopie umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus feuchten Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Kostengünstige und relativ schnelle Protokolle, die sich für die Vorbereitung anspruchsvoller Proben wie Blütenmeristeme, Oomycetenzysten und Pilze (Agaricales) eignen, werden hier zusammengestellt und detailliert beschrieben.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll für die Induktion der Paarung von P. blakesleeanus vor.

Sexuelle Kreuzungen mit dem Mucoromyceten Phycomyces blakesleeanus

Brusttumor-Zellen, die Luciferase werden subkutan in Mäuse implantiert und visualisiert mit Hilfe der optischen Bildgebung, das Tumorwachstum und die Entwicklung nicht-invasiv in einer Längsschnittstudie zu überwachen.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

Technik für die Visualisierung des schlagenden Herzens in Larven und erwachsene...

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

Erfahren Sie Methoden zur Induktion sexueller Entwicklung und Sporenausschleuderung bei Fusarium graminearum. Diese Techniken ermöglichen genetische Kreuzungen und Mutanten-Screening für die pilzbiologische Forschung.

Sexuelle Entwicklung und Ascosporenausschleuderung in Fusarium graminearum

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