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Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexuelle Entwicklung und Ascosporenausschleuderung in Fusarium graminearum

Full Text

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08:20 min

March 29, 2012

DOI: 10.3791/3895-v

Brad Cavinder¹, Usha Sikhakolli², Kayla M. Fellows³, Frances Trail^2,4

¹Genetics Program,Michigan State University, ²Department of Plant Biology,Michigan State University, ³Human Biology Program,Michigan State University, ⁴Department of Plant Pathology,Michigan State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Sexuelle Kreuze und Isolierung von rekombinanten Nachkommen sind wichtige Werkzeuge für die Forschung Fadenpilz,

Transcript

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu lernen, wie man die Parathesieentwicklung erzeugt und manipuliert und die APO-Entladung in Kultur fragt. Dies wird erreicht, indem zunächst die Kultur induziert und aktiv wächst, um die sexuelle Entwicklung zu initiieren. Der zweite Schritt besteht darin, auf aktive Sporenentladung zu testen, dann werden rekombinante Parathesien erzeugt.

Der letzte Schritt besteht darin, die Nachkommen auf Phänotypen zu untersuchen, die darauf hinweisen, ob eine Rekombination stattgefunden hat oder nicht. Letztendlich können die Ergebnisse verwendet werden, um nach Mutanten in der sexuellen Entwicklung zu suchen oder mehrere Mutationen innerhalb eines Stammes zu erzeugen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte schwer zu beschreiben sind und obwohl sie einfach sind, müssen sie präzise durchgeführt werden, um eine optimale Sporenentladung und eine konsistente Parathesieproduktion zu erzielen.

Beginnen Sie mit der Zentrierung der Karottenschnecke in einer sechs Zentimeter großen Petrischale mit einem fruchtbaren Stamm von f gramin. Aronstab inkubiert die inokulierten Schalen unter hellem Standard-Commercial. Verwenden Sie Leuchtstofflampen bei Raumtemperatur.

Lassen Sie die Pilze drei bis fünf Tage lang wachsen, bis das Myzel den äußeren Rand der Schale erreicht hat. An der Kapuze. Kratzen Sie vorsichtig mit dem sterilen Zahnstocher über die Oberfläche der Kultur, um das oberirdische Myzel zu entfernen.

Tragen Sie dann einen Milliliter Tensid auf die Schnecke auf und reiben Sie es mit dem gebogenen oder bauchigen Ende eines sterilen Glasstabes in die Oberfläche. Ohne Auftragen von Perfil. Stellen Sie die Platten wieder unter die Lampen.

Nach 24 Stunden sollte die Oberfläche der Platten glänzend aussehen. Wenn die Myzelien wieder auftreten und die Oberfläche abkratzen, tragen Sie die Tween 60-Lösung erneut auf und baden Sie sie für weitere 24 Stunden in Licht. Beobachten Sie nun eine Woche lang die Entwicklung der Parathesie.

Junge Parathesien sind als schwarze Körner auf der Schneckenoberfläche sichtbar. Im Vergleich zur reifen Parathesie. Es sollte fast keine oberflächlichen Myzelien vorhanden sein.

Am siebten Tag sammeln sich reife Sporen auf dem Plattendeckel an, und am neunten Tag sind die Sporen so dicht, dass sie ohne Vergrößerung sichtbar sind. Um das Zwischenstadium zu ernten, kratzen Sie die Parathesie vorsichtig mit einem Skalpell über die Oberfläche der Schnecke und übertragen Sie die Parathesie in ein Kryoröhrchen. Das Röhrchen kann dann sechs Tage nach dem Auftragen des Tensids für die RNA-Extraktion schockgefrostet werden.

Schneide mit einem Holz, einem Burschen oder einem Skalpell einen Kreis mit einem Durchmesser von einem Zentimeter aus der Schnecke aus. Schneiden Sie den Kreis in zwei Hälften und montieren Sie die Hälften auf einen Objektträger. Richten Sie die Stücke so aus, dass die Oberfläche mit den Fruchtkörpern senkrecht zur Oberfläche des Objektträgers steht, und die Sporen werden über die gesamte Länge des Objektträgers abgefeuert. Wenn zu diesem Zeitpunkt ein Acro-Sporeninhibitor gewünscht wird, tragen Sie ihn auf die Rückseite des Schneckenblocks auf.

Diese Technik kann verwendet werden, um Chemikalien auf Entladungshemmer und genetische Mutanten auf den Verlust der Fähigkeit, Sporen abzufeuern, zu untersuchen, wir haben beides erfolgreich getan. Inkubieren Sie den Objektträger nun über Nacht in einer einfachen, beleuchteten Befeuchtungskammer mit Raumtemperatur. Wenn die Fruchtkörper ausbrechen, sammeln sich Sporen auf dem Objektträger an und werden dort am Morgen sichtbar sein.

Angesammelte Sporen können nun vom Objektträger abgewaschen, in einem sauberen Geschirr gesammelt und quantifiziert werden. Beginnen Sie damit, eine genetische Kreuzung zwischen zwei Stämmen von Raupenwurz zu etablieren, indem Sie sie auf gegenüberliegenden Seiten einer Karottenschnecken-Petrischale impfen. Wie zuvor beschrieben, züchten Sie die Pilze, bis Hyphien die Oberfläche ausgefüllt haben.

Kratzen Sie die oberirdischen Teile ab und tragen Sie T zwischen 60 Lösung auf. Markieren Sie in diesem Szenario die Platte, an der sich die Hyphie treffen. Bring die Kulturen zurück ans Licht und brüte sie etwa sieben Tage lang aus, wenn sich die Parathesie entwickelt hat und Siri beginnt, sich aus der Parathesie entlang der Schnittstelle zwischen den Kulturen zu bilden.

Diese Technik kann verwendet werden, um mehrere Mutationen zu einem Stamm zu kombinieren. Es ist auch erwähnenswert, dass sowohl "Maschen Plus" als auch "Maschen Minus" ausgewählt werden können, was dies zu einem sehr nützlichen auswählbaren Markierer macht. Bringen Sie unter dem Präpariermikroskop die Parathesie entlang des Schnittpunkts der beiden Kulturen ins Blickfeld.

Finde dann das Sear-Auge. Tauchen Sie nun eine sterilisierte Insektennadel in steriles Wasser und berühren Sie die Nadel mit einer Seröse, die sich an der Grenze zwischen den Kulturen gebildet hat. Die SRIs sollten an der Feuchtigkeit des Stifts haften.

Spülen Sie dann die Spitze des Stifts mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser ab, das in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen enthalten ist. Brennen Sie den Stift ab, befeuchten Sie ihn erneut und nehmen Sie einen anderen Sru. Wähle zwischen drei und fünf Siri aus und übertrage sie alle in ihre eigene Tube.

Nun kurz vortexen. Jede Röhre enthält die aufgehängte Siri für jede Röhre. Verteilen Sie 60 Mikroliter Sporensuspension auf einer neun Millimeter großen Petrischale.

Inkubieren Sie die Platten mit MMTS-Medium bei Raumtemperatur mit oder ohne Licht und lagern Sie die verbleibende Sporensuspension bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Nach drei bis fünf Tagen erscheinen sehr kleine Kolonien auf der Platte. Ein Phänotyp kann unter dem Mikroskop bewertet werden.

Gestrickte negative Kolonien haben eine spärlichere Hyphy als gestrickte positive Kolonien. Entsorgen Sie die Platten mit nur einem der Phänotypen. Die Siri aus rekombinanter Parathesie weisen beide Kolonie-Phänotypen in etwa gleichem Verhältnis auf.

Bewahren Sie diese Platten auf. Manchmal ergeben sich andere Phänotypen aufgrund der Segregation anderer Faktoren, wie z. B. Kolonien, die zu Lagerzwecken zwischen gestrickt positiv und gestrickt negativ liegen, übertragen Sie die Kolonien von den rekombinanten Platten auf eine V-Acht- oder Karottenschneckenplatte, um die Studie fortzusetzen, indem Sie andere Phänotypen untersuchen: Platten Sie die Kolonien auf der Schnecke von Chap X Dock und auf Platten mit PDA, die Chlorat enthalten. Parathesien wurden zu einem schwarzen, samtartigen Rasen ohne Myzelien oder Sporen gezüchtet.

24 Stunden nach dem Auftragen von Tween hatte die Oberfläche der Schnecke einen leichten Glanz. Wenn Myzelien wieder aufgetreten wären, wäre die Platte möglicherweise nicht genug abgekratzt worden, um die Entwicklung einer Parathesie zu induzieren. Mehrere Schneckenblöcke mit Fruchtkörpern eines Wildtyp-Stammes wurden aufgestellt, um ihre Sporen zur Beobachtung auf Objektträger zu schießen.

Das Feuern wurde vorbereitet, die richtige Beleuchtung wurde vorbereitet. Parathesien, die zu jung oder zu alt waren, feuerten oft nicht. Als sie zu alt war, erschienen zahlreiche Hyphyien auf der Oberfläche der Kultur, die ihr einen weißlichen Farbton verliehen.

Wenn sie zu jung waren, feuerten die Fruchtkörper nicht, und das Experiment wurde wiederholt. 24 Stunden später, als 10 Siri aus einer Kreuzung entnommen wurden, waren mindestens sechs typischerweise rekombinant, wie durch eine Mischung aus gestrickten negativen und gestrickten positiven Phänotypen bewertet wurde. In seltenen Fällen verhinderte eine Mutation die Paarung eines Stammes.

Wenn einer der Elternteile einen offensichtlichen Wachstumsphänotyp aufwies, dann waren mehr als zwei Phänotypen in den Kolonien auf MMTS vorhanden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, mit einer Kultur zu beginnen, die gut gepflegt und nicht sequentiell im Laufe der Zeit übertragen wurde. Beginnen Sie immer mit einer Kultur, die aus einem stabilen Gefrierschrank gezüchtet wurde.

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