Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entnahme von Proben in Kryoboxen und Kryofläschchen aus Duo-Tanks, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt sind, mit einem einfach zu konstruierenden Gerät zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein oder zwei Gefriergestelle aus dem Macher entfernt werden, um Platz zum Manövrieren zu schaffen, und das Gerät vertikal in den Macher eingesetzt wird. Der zweite Schritt besteht darin, mit dem Gerät vorsichtig an der Unterseite des Machers entlang zu kratzen.

Ziehen Sie als Nächstes das Gerät aufrecht an den Wänden des Machers entlang Um die Gefrierbox aus dem Tank zu schöpfen, besteht der letzte Schritt darin, die von der Unterseite des Machers entnommene Box zu greifen und die entfernten Gefriergestelle wieder einzusetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Dekantieren, dem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Riegel, besteht darin, dass sie eine einfache, sichere und schnelle Alternative bietet, die die Integrität der Probe bewahrt und von einem einzigen Bediener durchgeführt werden kann. Um mit der Montage des kryotoleranten Geräts zu beginnen, verwenden Sie eine Zange, um eine Seite einer dreiseitigen starken Krawatte zu glätten, um eine LHA-starke Krawatte herzustellen.

Wie hier zu sehen, können die Maße der starken Krawatte in Abhängigkeit vom Durchmesser des Halses des Machers gewählt werden. Es sollten zwei solcher starken Verbindungen hergestellt werden, damit das Gerät fünfeinhalb mal fünfeinhalb Zoll große Kryoboxen abrufen kann. Befestigen Sie diese mit einem starken TST-Bindeband mit einer Kronenschraube, einer Unterlegscheibe und einer Schraube, um die Basis der Kryoschaufel zu bilden.

Das Gerät sollte nun so aussehen, wie hier zu sehen. Richten Sie nun mit einer Schlitzplatte die Schlitze an der starken Krawattenspanne mit den Schlitzen an einem Ende der Schlitzplatte aus. Befestigen Sie dann die beiden zusammen mit Hillman-Schrauben und Muttern.

Bohren Sie Löcher für die Befestigung, wenn die Schlitzplatte und die starken Anker keine vorgebohrten Löcher haben. Auf Wunsch kann ein Griff geformt werden, indem das andere Ende der Schlitzplatte gebogen und mit Schaumstoff umwickelt wird. Um das Gerät besser greifen zu können, achten Sie darauf, den Schaum vor dem Wasserklatschen zu entfernen.

Das kryotolerante DIY-Entnahmegerät kann auch für die Entnahme von Kryo-Fläschchen angepasst werden. Dabei wird der flache Boden durch ein Edelstahlsieb ersetzt, das für das Herausschöpfen von Fläschchen aus der Flüssigkeit modifiziert wurde. Um mit der Montage zu beginnen, lösen Sie zuerst die Kronenmuttern und -schrauben und befestigen Sie die starke Reifent-T-Spanne an der Schlitzplatte.

Bevor Sie dann das Edelstahlsieb an der Schlitzplatte befestigen, biegen Sie den Hals des Siebes vorsichtig mit Hilfe einer Zange, um den Boden in einem Winkel auszurichten, der einer Schöpfkelle ähnelt. Wenn das verwendete Sieb mit einer Lippe geliefert wird, verwenden Sie eine Zange, um die Lippe nach unten zu biegen. Dies erleichtert das Manövrieren mit dem Gerät.

Richten Sie das Loch am Griff des Siebs an den Löchern an der Schlitzplatte aus und befestigen Sie das Sieb mit Hillman-Muttern und -Schrauben. Bohren Sie Löcher, wenn das Sieb nicht mit vorgebohrten Löchern geliefert wird. Um mit dem Abrufen von Kryoboxen von einem Macher zu beginnen, ziehen Sie zuerst Kryohandschuhe an.

Entfernen Sie dann ein bis zwei Gefriergestelle vom Macher, um Spielraum für das Manövrieren mit dem Gerät zu schaffen. Verwenden Sie als Nächstes das aufrechte, kryotolerante DIY-Rückholgerät, das mit der starken Krawattenbasis ausgestattet ist, um vorsichtig an der Unterseite des Machers entlang zu kratzen und die Box einzusammeln, und lassen Sie sie in den Boden des Machertanks fallen. Ziehen Sie anschließend das Gerät aufrecht an den Wänden des Machers entlang, um die Gefrierbox aus dem Tank zu schöpfen.

Beachten Sie, dass das Gerät senkrecht gehalten und gerade nach oben gezogen werden sollte, um zu verhindern, dass die Box wieder in den Macher rutscht. Um Kryo-Fläschchen zu entnehmen, verwenden Sie die Kryo-Schaufel mit einem Sieb, um den Boden des Machers vorsichtig abzukratzen, ähnlich wie bei der Kryobox-Entnahme, ziehen Sie das Gerät aufrecht und greifen Sie die im Sieb gesammelten Fläschchen. Eine große Herausforderung bei Genexpressionsstudien besteht darin, dass die Qualität der RNA von den Lagerbedingungen sowohl für gefrorene Gewebeproben als auch für extrahierte RNA abhängt.

Diese Abbildung zeigt den Einfluss der Probenhandhabung auf die Integrität der Gesamt-RNA Die Gesamt-RNA aus derselben Gewebequelle wurde vor dem Experiment einer unterschiedlichen Probenhandhabung unterzogen intakte Gesamt-RNA-Menge, RNA-Vorbereitungsrate zeigt klare ribosomale 28 s und 18 s RNA-Banden mit der ribosomalen 28-s-RNA-Bande, etwa doppelt so intensiv wie die ribosomale 18-s-RNA-Bande. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die RNA intakt ist. Die Bahnen drei und vier zeigen Proben mit signifikanter Degradation aufgrund wiederholter teilweiser Auftauung durch kurzfristige Entnahmen vom Ausführenden, wodurch eine Langzeitlagerung mit periodischem Umfüllen aufgrund der Notwendigkeit der Entnahme der heruntergefallenen Fläschchen auf Kartons modelliert wird.

Proben, die mit dem DIY-Gerät im Doer-Service gelagert werden und somit kein teilweises Auftauen vorliegen, enthalten jedoch intakte RNA auf Bahn zwei. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben aus dem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dvar entnehmen können, ohne es dekantieren zu müssen.