Name: Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Lernen Sie die sichere Rückgewinnung von kryokonservierten Proben aus flüssigem Stickstoff mit einer selbstgebauten Vorrichtung. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Einzelnutzerbetrieb und bewahrt die Probenintegrität.

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DIY kryogenen Rückholvorrichtung hatte im Laufe der Projekte &quot;Modellierung bakterieller Proteinprenylierung in eukaryotischen Zellen mit Hilfe der Bioinformatik und molekulare Ansätze&quot; von Mary Louise Andrews Award for Cancer Research Program, Virginia Akademie der Wissenschaften gefördert &quot;, physiologische Bedeutung von RNA-Editing in Plasma getestet Dendritische Zellen &quot;von The Thomas F. Jeffress und Kate Miller Jeffress Memorial Trust und Staatsvertrages 16.740.11.0364 (Ministerium für Wissenschaft und Bildung, Russland) gesponsert. Wir möchten Beth Eom für die Unterstützung bei der RNA-Integrität Experiment danken.

1. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoboxen <ol><li> Mit einer Zange, entzerrt einer Seite des 3-seitig Strong-Tie (1A), um einem L-förmigen Strong-Tie in 1B gezeigt ist. Hinweis: Die Abmessungen der Strong-Tie kann in Abhängigkeit von dem Durchmesser des Halses des Dewar werden . </li><li> Befestigen Sie zwei so starke Bindungen zu einer-Strong-Tie Band T (Abbildung 2) mit GABELKOPFSCHRAUBE Mutter, Scheibe und Schraube, um die Basis zu bilden Cryoscoop wie in Abbildung 3 (AB) gezeigt. Hinweis: Zwei starke Bindungen werden zur Abfrage von ermöglichen 5 ½ Zoll x 5 ½ Zoll Cryoboxen. </li><li> Mit Hilfe eines geschlitzten Platte (Abb. 4), richten Sie die Steckplätze auf der Strong-Tie T Gurt mit den Schlitzen an einem Ende der geschlitzten Platte und sichern Sie die beiden zusammen mit Hilfe von Hillman Mutter und Schrauben (Abbildung 5). Hinweis: Wenn die geschlitzten Platte und die starke Bindung nicht zusammenmich mit vorgebohrten Löchern, müssen Sie haben Löcher gebohrt, mit Hartmetall-Bohrer. </li><li> Biegen des anderen Endes der Schlitzplatte mit Hilfe der Zange, so wie in 6 gezeigt. (Dieser Schritt ist optional). </li><li> Wickeln Sie den Griff mit Schaumstoff, besser begreifen, wenn das Gerät in flüssigem Stickstoff, wie in Abbildung 6 dargestellt. (Optional) Hinweis: Entfernen Sie den Schaum vor dem Autoklavieren. </li></ol> 2. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoröhrchen Die Cryotolerant DIY Abruf kann auch für das Abrufen von Kryoröhrchen angepasst werden. Dabei ersetzt die flache Basis mit einem Sieb aus Edelstahl, wie gezeigt verändert für Aushöhlungen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff (Abbildung 7). <ol><li> Lösen Sie die Krone Muttern und Bolzen Befestigung des Strong-Tie T Trageriemen an der geschlitzten Platte. </li><li> Vor dem Anbringen des Edelstahlsieb an der Schlitzplatte, sanft beugen den Halsdas Sieb mit Hilfe der Zange zu orientieren die Basis in einem Winkel zu einer Schöpfkelle (Abbildung 8) ähneln Hinweis: Wenn das Sieb kommt mit einer Lippen-, Zange verwenden, um die Lippe bücken, das macht das Manövrieren mit dem Gerät erleichtern.. </li><li> Richten Sie das Loch am Griff des Filters zusammen mit den Löchern auf der geschlitzten Platte und sichern Sie das Sieb mit Hilfe von Hillman Muttern und Schrauben wie in Abbildung 8 dargestellt. Hinweis: wenn das Sieb nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie zu arrangieren, um Löcher mit Hartmetall-Bohrer gebohrt haben. </li></ol> 3. Abrufen und Kryoröhrchen Kryoboxen Von Dewar <ol><li> Um zu beginnen, auf Tieftemperatur-Handschuhe an und entfernen Sie 1 oder 2 Gefriergestelle aus dem Dewar, um Platz zum Manövrieren zu ermöglichen. </li><li> Vorsichtig entlang der Unterseite des Dewar mit dem aufrechten Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung mit Strong-Tie T Gurt Basis (Abbildung 5) ausgerüstet kratzen und sammeln Sie die Box fallen auf den Boden des Tanks Dewar. Hinweis: Flüssiger Stickstoff siedet sofort bei Kontakt mit einer wärmeren Objekt, das Objekt in umhüllenden Isolierschicht Stickstoffgas (Leidenfrosteffekt). Um das Gerät vor zu kühlen, um Abrufen von Proben, langsam Tauchen Sie das Gerät in das Dewar und erlauben flüssigem Stickstoff, um das Gerät ausreichend abkühlen, bevor Sie mit dem obigen Schritt. </li><li> Ziehen Sie das Gerät aufrecht an den Wänden des Dewar, um die Tiefkühltruhe aus dem Tank zu schaufeln. </li><li> Besorgen Sie sich die Box aus dem Boden des Dewar abgerufen. </li><li> Zum Abrufen von Kryoröhrchen, sanft kratzen den Boden des Dewar mit dem cryoscoop mit einem Sieb (Abbildung 9) ausgestattet. </li><li> Ähnlich wie bei Kryobox Retrieval, ziehen Sie das Gerät aufrecht und ergreifen Sie die Fläschchen im Sieb aufgefangen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Eine große Herausforderung in der Genexpression Studien ist, dass die Qualität der RNA von den Lagerbedingungen abhängigfür die beiden eingefrorenen Gewebeproben extrahiert und RNA-4. Abbildung 10 zeigt die Wirkung der Handhabung der Proben auf die Integrität von Gesamt-RNA. Gesamt-RNA aus dem gleichen Gewebe Quelle (menschliche Fettgewebe) wurde zu verschiedenen Probenhandhabung unterzogen. Vor dem Experiment zeigt intakte Gesamt-RNA-Präparat klar 28S und 18S rRNA-Banden mit der 28S-rRNA-Band etwa doppelt so intensiv wie die 18S-rRNA-Bande (Abbildung 10, Spur 1). Dieses Verhältnis von 2:1 (28S: 18S) ist ein Indiz dafür, dass die RNA intakt ist, während partiell abgebauten RNA erscheint als ein Abstrich oder seine 28S: 18S Intensitätsverhältnis fährt von 2.01 5. Lanes 3-4 zeigt RNA-Proben mit einem signifikanten Abbau. Diese RNA-Proben wurden wiederholt auftauen teilweise durch kurzfristige Abfragen im Dewar (Methode A) unterzogen, wodurch die Modellierung der Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren wegen Notwendigkeit der Rückholung der gefallenen Flaschen und Kisten (Abbildung 10, Lane 4.3 ). Allerdings Proben in Dewar gewartet gespeichertVerwendung DIY Vorrichtung (Verfahren B) und somit keine teilweise Abtauung enthalten intakte RNA (10, Spur 2). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Abbildung 1. A) Die Bemessungsgrundlage besteht aus zwei 3-seitige Strong-Tie von Dimensionen gezeigt. Jeder Strong-Tie enthält eine große vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und mehrere kleinere Löcher (kleiner Pfeil) auf jeder Seite. Dies bietet eine Option, damit die Befestigung mit Mutter und Bolzen. Auch die kleineren Löcher ermöglichen die schnelle Ableitung von flüssigem Stickstoff während Probe Abruf. B) Eine Seite von jedem der starken Bindung mit Hilfe einer Zange, um L-förmigen Strong-Tie gerichtet ist. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> 2. Strong-Tie T Riemen verwendet wird, um die starken-Bindungen aneinander zu befestigen. Wie Strong-Tie, hat T-Gurt ein großer vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und zwei kleinere Löcher (small Pfeil) an jeder Ecke. Dies ermöglicht die Sicherung starke-ten entlang der Länge des T - Strap mit Muttern und Bolzen. Es ermöglicht auch Befestigungs-T-Gurt an den geschlitzten Platte. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Abbildung 3. A) Jeder Strong-Tie wird an einer Ecke des T-Gurt befestigt, über seine Länge mit Krone Bolzen Muttern, Bolzen und Unterlegscheiben. B) Zwei starke-schaften sind benachbart aneinander befestigt werden, um abzurufen 5 ½ Zoll x 5 ½ in. Cryoboxen. Für kleinere Cryoboxen wie 2 Zoll x 2 Zoll, kann ein einzelner Strong-Tie direkt an die geschlitzte Platte befestigt werden, ohne eine T-Riemen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schlitz flache Platte als Griff dient. Länge der Schlitzplatte hängt von der Tiefe des Dewar. In diesem Fall wurde 4 Fuß von geschlitzten Platte verwendet. Die Dicke der geschlitzten Platte ist entscheidend, seit dünne geschlitzte Platten (&lt;14 Manometer) machen das Gerät fadenscheinigen beim Abrufen von Proben aus flüssigem Stickstoff gefüllten Dewar. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Bild 5. Der flache Boden, bestehend aus starken Bindungen und T Gurt wird dann an einem Ende der geschlitzten Platte befestigt ist. Die größere Bohrung auf dem verbleibenden Ecke des T Gurt wird mit dem Schlitz auf der flachen Platte ausgerichtet und befestigt mit Hex-Schraube und Mutter. Dieses Gerät kann nun verwendet werden, um Cryoboxen von Dewar abzurufen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> 6. Ein Ende des geschlitzten flachen Platte gebogen ist und mit einer Zange mit Schaum bedeckt besser zu greifen besonders bei tiefen Dewars, wie im vorliegenden Fall gezeigt wird. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schmutzfänger mit Drahtgitter und Edelstahl-Griffwird verwendet, um Kryoröhrchen von Dewar abzurufen. Wenn der Griff nicht mit einem Schlitz versehen ist, mit Hartmetall-Bit-Bohrer wird zum Bohren eines Lochs erforderlich. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Abbildung 8. Um das Abrufen Kryoröhrchen zu erleichtern, ist Sieb entlang des Halses mit einer Zange zu Kelle geformten Sieb bekommen gebogen. Wenn Sieb mit Lippe wie in diesem Fall vorgesehen ist, kann Zangen verwendet werden, um es zu biegen. Dadurch wird sichergestellt, Sieb nicht innerhalb der Dewar verfangen. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Abbildung 9. Schmutzfänger an den geschlitzten flache Platte an einem Ende befestigt mit Hex-Schraube und Mutter. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> Abbildung 10. Die Integrität der Probe von Gesamt-RNA zu unterschiedlichen Umgang mit den Proben unterworfen. Um zu untersuchen, wie RNA-Qualität durch Probenhandhabung c ist betroffenie Bedingungen, wurde eine Reihe von RNA-Proben aus der gleichen Quelle zwei Methoden der Handhabungen unterworfen. Methode A bestand aus Lagerung von RNA in Dewar-Probe unterzogen, um Abfragen mit DIY-Gerät, damit kein teilweiser auftauen. Verfahren B aus der Lagerung von RNA in Dewar einer wiederholten teilweisen Abtauung durch kurzfristige Abfragen im Dewar, damit Modellierung Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren zum Abrufen gefallen Proben. Gesamt-RNA-Integrität wurde dann durch Gelelektrophorese analysiert. Lane1: Probe vor der Lagerung in Dewar, Spur 2: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode A, Spur 3, 4: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode B, M: 100 bp Leiter.

<ol><li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKittel%2C+P+%22Advances+in+Cryogenic+Engineering%22">Advances in Cryogenic Engineering</a>. , Springer. 41(1996).</li>
<li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdeskuty%2C+FJ+%22Stewart+Safety+in+the+handling+of+cryogenic+fluids%22">Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids</a>. , Plenum Press. New York. (1996).</li>
<li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouncil%2C+NR+%22Prudent+Practices+in+the+Laboratory%3A+Handling+and+Management+of+Chemical+Hazards%22">Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues%3A+checkpoint+towards+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li>
<li>Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLynch%2C+PT+%22Encyclopedia+of+Rose+Science%22">Encyclopedia of Rose Science</a>. , 106-111 (2003).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine der gängigsten Methoden zum Abrufen und Cryoboxen Kryoröhrchen aus dem Boden des Dewar-Tank ist in flüssigen Stickstoff in einen freien Behälter umfüllen und ziehen Sie die Proben im Kolben verbliebene oder schwebend in der dekantiert flüssigem Stickstoff. Dies ist jedoch eine unsichere Praxis, die kryogene Verbrennungen oder Erstickung durch längere Exposition gegenüber flüssigem Stickstoff 2 Dämpfe verursachen können. Andere gemeinsamen Weg bei der Abfrage von gefallenen Kryoröhrchen beinhaltet die Ver...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hillman-Gruppe überzog Schlitz Flache 1-3/8 x 4 Meter; 14 Gauge </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> N / A </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE Stainless Steel # 6 - 32 x 3/8 Zoll Oval Leiter Phillips Laufwerk Maschinenschraube </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 42281 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE 3/8 Zoll x 1-1/2 Zoll Stahl verzinkt Fender Unterlegscheiben </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 20122 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE verzinkt # 8-32 Maschinenschraube Nuss </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 18512 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie BC40Z 4 In.x4 in. halbe Basis </td><td> Lokale Hardwarebestellen </td><td> Model # BC40Z </td><td> 2 Stück erforderlich </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie 6 Zoll x 6 Zoll T Strap </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 66T </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;Mesh-Sieb </td><td> Lokale Geschäft </td><td> Model # 7859W </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Der Hillman Gruppe verzinkt Sechskantmuttern 3/8-16 </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model #: 810509 </td><td> 6 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Der Hillman Gruppe verzinkt Sechskantschrauben 3/8- 16 </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Schaum zur Dämmung </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Schraubendreher </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Zange </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself einrichtung zur rückgewinnung von kryokonservierten proben versehentlich fallengelassen in kryo-lagerbehälter

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

Flüssiger Stickstoff ist farblos, geruchlos, extrem kalt (-196 ° C) Flüssigkeit unter Druck gehalten. Es wird allgemein als ein kryogenes Fluid für die langfristige Lagerung von biologischen Materialien wie Blut, Zellen und Geweben 1,2 verwendet. Die kryogene Natur des flüssigen Stickstoffs, während sich ideal für Probenkonservierung, kann dazu führen, schnelles Einfrieren von lebenden Gewebe in Berührung - bekannt als &quot;Kryo-burn&quot; 2, was zu schweren Erfrierungen in nahe stehende Personen in Ein-und Auslagerung von Proben aus Dewars beteiligt führen. Zusätzlich kann, wie flüssigem Stickstoff verdampft reduziert die Sauerstoffkonzentration in der Luft und kann dazu führen, Asphyxie, in geschlossenen Räumen, 2. In Labors werden biologische Proben oft in Kryoröhrchen Kryoboxen oder in Edelstahl-Racks in den Dewar-Tanks 1 gestapelt gelagert. Diese Regale sind mit einem langen Schaft zu Boxen Herausrutschen aus den Regalen zu verhindern und in den Boden zur Verfügung gestelltDewars während der routinemäßigen Handhabung. Allzu oft jedoch rutschen Kisten oder Flaschen mit wertvollen Proben heraus und sinken auf den Boden von flüssigem Stickstoff gefüllten Tank. In solchen Fällen könnten Proben mühsam nach der Übertragung des flüssigen Stickstoffs in einem freien Container oder verwerfen sie abgerufen werden. Die Kästen und Flaschen können dann relativ sicher von Dewar geleert erholt. Jedoch macht es die kälteerzeugenden von flüssigem Stickstoff und Expansionsrate versunkenen Probe Abruf gefährlich. Es wird allgemein von Sicherheit Büros empfohlen, die Probe Retrieval nie durchgeführt werden, indem eine einzelne Person. Eine weitere Alternative ist im Handel erhältlich kühlen Grabber oder Zange benutzen, sich aus der Fläschchen 3. Allerdings stellt eingeschränkter Sicht in den dunklen Flüssigkeit gefüllt Dewars eine große Einschränkung in ihrer Verwendung. In diesem Artikel beschreiben wir den Bau einer Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung, die Probe macht Abruf von Dewar mit kryogenen Flüssigkeiten sowohl sicher als einND einfach.

Hier präsentieren wir Ihnen eine kostengünstige, langlebige cryotolerant Gerät zur Probe Abruf von Dewar Tanks mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Die Einfachheit der Konstruktion und der modulare Aufbau des Gerätes macht den Prozess der Probe Abruf aus kryogenen Tanks sicher und einfach.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Flüssigstickstoff ist eine farblose, geruchlose, extrem kalte (-196 °C) Flüssigkeit, die unter Druck gehalten wird. Er wird häufig als kryogenes Fluid für die langfristige ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entnahme von Proben aus Kryo-Boxen und Kryo-Röhrchen aus mit flüssigem Stickstoff gefüllten Duo-Tanks mithilfe einer einfach herzustellenden Vorrichtung zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein oder zwei Gefriergutträger aus dem Tank entfernt werden, um Platz für die Handhabung zu schaffen und die Vorrichtung vertikal in den Tank einzuführen. Der zweite Schritt besteht darin, vorsichtig mit der Vorrichtung entlang des Tankbodens zu schaben.Ziehen Sie anschließend das Gerät entlang der Wände des Behälters nach oben, um die Gefriertablette aus dem Tank zu heben. Der letzte Schritt besteht darin, die aus dem Boden des Behälters entnommene Box zu greifen und die entfernten Gefrierregale wieder einzusetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Abgießen, bei dem der Behälter vollständig mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, liegt darin, dass sie eine einfache, sichere und schnelle Alternative bietet, die die Probenechtheit erhält und von einer einzelnen Person durchgeführt werden kann. Um mit dem Zusammenbau des kryotoleranten Geräts zu beginnen, verwenden Sie eine Zange, um eine Seite ein

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