Name: Mit den Eizellen Schistosoma mansoni Als ein In vivo Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Lernen Sie die Untersuchung von Lungenentzündung durch Schistosoma mansoni-Eier in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Th2-Immunantworten und Entzündungszell-Rekrutierung.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) AI091759 und dem Morbus Crohn und Colitis Foundation of America von William und Shelby Modell Family Foundation-Forschungspreis (bis Mn) unterstützt. Schistosome-infizierte Mäuse wurden von der NIAID Schistosome Resource Center (NIAID Contract N01 A130026) geliefert.

1. Reinigende Schistosoma mansoni Eier <ol><li> Infect Swiss-Webster-Mäusen mit schistosome Cercarien, die das infektiöse Stadium des Lebenszyklus Schistosoma 8 ist. Alternativ erhalten schistosome-infizierten Mäusen aus dem NIAID Schistosomiasis Resource Center ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Lassen Mäuse für 6-7 Wochen nach der Infektion, in welcher Zeit-Punkt, Eier sind in der Leber vorhanden und können wiederhergestellt werden, wie unten beschrieben (siehe Abb. 1). </li><li> Einschläfern Mäuse mit CO 2, und benetzen mit 70% Ethanol. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken. Verwenden Sie stumpfen Pinzette und Schere weggeschnitten Haut und des darunterliegenden Bauchfell. Excise die Leber, die unter dem Brustkorb und Zwerchfell entfernt. </li><li> Fein hacken Lebern und 20 ml pro Leber der Verdauung Mischung von Collagenase / Dispase (0,5 mg / ml), Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 ug / ml) in PBS zusammengesetzt. Setzen Sie mixture in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und über Nacht in einem 37 ° C geschüttelt. </li><li> Zentrifugieren Mischung bei 400 xg / 3 min / 20 ° C. Vorsichtig abgießen und die überschüssige Flüssigkeit füllen Rohr mit PBS. Zentrifugieren und wiederholen PBS waschen. Nach letzten Zentrifugation, Pellet in 25 ml PBS. </li><li> Strain die resuspendierten Pellets über eine Standard-Küche metallischen Sieb (mit einem 50-ml-Kolben der Spritze, um die Maische durch Leber Stücke in ein Becherglas), indem man das Gemisch durch ein feines Sieb (10 ml Spritze verwenden, um durch die Mischung feines Sieb drücken, gefolgt in ein zweites Becherglas). </li><li> Setzen gespannten Mischung in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 400 xg / 5 min / 20 ° C. Füllen Sie vorsichtig heraus, ohne Überstand Pellet. Pellet in 3 ml PBS. </li><li> Overlay vorsichtig mischen, auf einen 20% Percoll, 40 ml Gradienten von 8 ml Percoll und 32 ml 0,25 M Saccharose (FW = 342,3 so 8,56 g Saccharose/100 ml H 2 0). </li><li> Zentrifuge 10 min / 800 × g / 20 ° C Abpipettieren eind verwerfen gallertartige oberste Schicht der Leberzellen. Entfernen Ei Pellet am Boden mit einer Transferpipette und in ein 15 ml Falcon Röhrchen. </li><li> Wash Pellet 3X in 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA mittels Zentrifuge Einstellungen: 3 min / 30 ug / 20 ° C Resuspendieren in 500 ul PBS. </li><li> Overlay Mischung auf eine neue 25% Percoll, 10 ml-Gradienten (2,5 ml Percoll und 7,5 ml 0,25 M Saccharose) unter Verwendung Zentrifuge Einstellungen: 10 min / 800 × g / 20 ° C </li><li> Waschen in 10 ml PBS mit Zentrifuge Einstellungen 3X: 3 min / 30 xg / 20 ° C. </li><li> In den letzten 10 ml Wasch-, entfernen Sie 100 ul, um Eier zu zählen. Eier schnell absetzen, so dass die Falcon-Röhrchen und muss vor dem Entfernen Probe gemischt werden. Verdünnen Sie die Probe mit 100 ul 900 ul PBS. 100 ul der Mischung sollte als Tröpfchen auf einem Objektträger mit einem Binokular (1:10 Verdünnung) gezählt werden. Wide-Bohrung Pipettenspitzen verwendet werden sollte. </li><li> Resuspendieren Eier bei 50.000 Eier / ml in PBS. Eier können für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden und aufgetaut einmal oder TWICe für die Verwendung. Vor dem Einsatz unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Eier noch intakt sind (siehe Abb. 1) zu inspizieren. </li></ol> 2. Intraperitoneale Sensibilisierung mit S. mansoni Eier: Tag 0 <ol><li> Planen Eier bei 5000 eggs/100 ul PBS in einem 5 ml SnapCAP Rohr. Für die Injektion schätzen 50% mehr Eier als nötig. </li><li> Legen Sie eine 23 Gauge 3/4inch Nadel und einer 1 ml Spritze mit 100 ul Ei Suspension pro Maus. Eier absetzen, so Last Nadel mit Eiern unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Felsen Spritze hin und her, um Eier vor jeder Injektion zu mischen, und injizieren intraperitoneal 100 L Suspension pro Maus. </li></ol> 3. Retroorbitalen intravenöse Challenge mit S. mansoni Eier: Tag 14 <ol><li> Bereiten Eier wie oben bei 5.000 eggs/100 ul. </li><li> Anesthetize Mäuse in speziellen Kammer mit Isofluran (4%) oder intraperitoneal mit Xylazin (10 mg / kg) und Ketamin (120 mg / kg). Tiefe von Anesthesia wird durch Quetschen der Fußsohle und die Gewährleistung keine körperliche Reaktion bestimmt. </li><li> Nach der Beladung mit 1 ml Spritze und 23 Gauge Nadel mit 3/4inch Eier, mit einer Pinzette, um die Nadel in einem Winkel von 90 ° mit der Schräge nach unten in den Winkel zu biegen. Sicherstellen, dass keine Luftblasen entstehen. </li><li> Bewegen Sie die Maus auf einer Seite. Einfahren Haut so Auge ragen, und injizieren 100 ul in die Gefäße hinter den Augapfel in einem 45 ° Winkel zur Nase. </li><li> Ziehen Sie Nadel und leichten Druck auf Blutungen zu kontrollieren. </li></ol> Alle diese Verfahren sind mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, und Mäuse müssen überwacht, bis sie aus der Narkose erholen werden. Diese Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. 4. Experimentelle Ernte: Tag 22 <ol><li> Einschläfern Mäuse mit CO 2. </li><li> Nasse Maus mit 70% Ethanol, und am Rücken. </li><li> Mit stumpfer FORCeps, fassen Sie die Maus Bauch und machen einen kleinen Schnitt in der Haut. Entfernen Sie vorsichtig die Haut mit einer Schere und entlarven den Brustkorb und Bauchfell. </li><li> Schneiden Sie das Bauchfell. Schneiden Sie die Bauchaorta, um das Blut mit einer Pasteurpipette zu erholen. Auf Eis lagern. </li><li> Bewegen Sie die Leber nach unten, um die Membran freizulegen. Verwenden einer feinen Schere, um die Membran geschnitten. Vorsichtig aufgeschnitten den Brustkorb auf das Lungengewebe zu entlarven. </li><li> Recover parathymic die Lymphknoten, die Lunge mit feinen Pinzetten abtropfen lassen. Diese werden unter dem Brustkorb gesteckt, auf beiden Seiten des Thymus 9. Store auf dem Eis in 1ml steriles Medium (DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, alle erhältlich von Invitrogen ergänzt). </li><li> Um die BAL zu erholen, und pumpen die Lungen für die histologische Analyse, müssen intratracheale Intubation durchgeführt werden. Setzen Sie die Luftröhre, indem Sie die Speicheldrüsen zur Seite, und pLacing feinen Pinzette unter der Luftröhre. Mit feinen Schere, schnitt ein Loch in der Mitte der Luftröhre, und legen Sie Schlauch in die Lunge. Befestigen Sie Schlauch durch das Binden mit chirurgischen Faden. </li><li> Bringen Sie PBS-gefüllten 1 ml-Spritze auf den Schlauch und pumpen die Lungen mit 1 ml PBS. Sorgfältig abrufen BAL Wäsche mit Spritze. Auf Eis lagern. </li><li> Bringen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS-gefüllten 1 ml-Spritze mit dem Schlauch aufpumpen und in die Lunge. </li><li> Entfernen Sie die Schläuche, und ziehen Sie die chirurgischen Faden zu verhindern Auslaufen des PFA. </li><li> Sorgfältig sezieren aus Lungengewebe und in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit 5 ml 4% PFA. </li></ol> 5. Vorbereitung der Recovered Gewebe <ol><li> Serum: Nach der Lagerung auf Eis für 30 min bis 2 h für Blutgerinnung, Serum aus dem Blut durch Zentrifugieren (13.000 × g / 10 min / 4 ° C). Serum wird bei -20 ° C gelagert und kann für Zytokin-ELISAs oder S verwendet werden mansoni Ei Antigen-spezifischen IgG-Isotyp ELISAs <sup&gt; 6, 10. </li><li> Lymphknoten: Einzelne Zellsuspensionen hergestellt und Zellzahl verwendet, um die Größe der Immunantwort zu beurteilen. Um Th2-Zell-Polarisation zu untersuchen, werden die Zellen mit S. restimuliert mansoni Ei-Antigen für 72 Stunden. Intracellar Zytokinfärbung kann mittels Durchflusszytometrie untersucht werden, und die Überstände kann zurückgewonnen und bei -20 ° C für ELISA von Th2-Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: Zellen werden pelletiert (400 × g / 5 min / 4 ° C). BAL-Flüssigkeit gewonnen und bei -20 ° C zur Analyse von Th2-Zytokinen durch ELISA. BAL-Zellen Zahlen werden als eine Anzeige für Entzündung der Atemwege verwendet. Zubereitungen von 10.000-100.000 Zytozentrifuge Zellen (500 U / 5 min / 4 ° C), wird gefolgt von Färbung Diffquik ermöglichen Aufzählung entzündliches Infiltrat 4, 6. Alternativ kann BAL-Zellen mittels Durchflusszytometrie 6 untersucht werden. </li><li> Lungengewebe: Lungengewebe ist stored über Nacht bei 4 ° C. Feste Gewebe in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Objektträger für histologische und Immunfluoreszenz-Analyse. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll Details alle notwendigen Schritte, um (i) Vorbereitung gereinigt Schistosoma mansoni Eier zur Verwendung in vivo (Abb. 1), (ii) zu sensibilisieren und fordern Mäuse mit diesen Eiern und (iii) erholen Organe zur Untersuchung der Lunge Entzündungsreaktion. Diese In-vivo-Modell reproduzierbar treibt eine starke Th2-Lungen-Entzündung. Dies wird durch Entzündung der Atemwege und Eosinophilie gezeigt als visualisiert von BAL-Zellzahlen und Zyto Zubereitungen (Abb. 2). H &amp; E-gefärbten Lungen-Abschnitte können für Ei-induzierte Granulome (Abb. 3a) untersucht werden, und Immunfluoreszenzfärbung von Lungen-Abschnitten ermöglicht die Visualisierung der alternativ aktivierten Makrophagen und Th2-Zytokin-induzierte Gene wie ResisZinn-ähnliches Molekül (RELM) α (Abb. 3b). Die Antigen-spezifische CD4 Th2-Cytokin-Antwort wird durch ELISA für IL-5 untersucht, IL-4 und IL-13 der Antigen-stimulierten parathymic Lymphknotenzellen (4). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schistosoma mansoni Ei Injektion Modell repräsentative Bilder von granulomatösen Lebern, die charakteristisch für hohe Belastungen S.mansoni-Ei, und der S.mansoni Eier werden gezeigt -.. Durchschnittliche Größe (L) 120 mu m durch (W) 50 um. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Abbildung 2. S. mansoni Ei Injektion treibt Entzündung der Atemwege. A. BAL Zellzahlen (x10 5) aus naiven (N) oder S.mansoni (Sm) Ei-injizierten Mäusen. * P &lt;0,05. B. Zytozentrifuge Vorbereitung der BAL-Zellen. Mac, Makrophagen; Eos, Eosinophilen, Lymphe, Lymphozyten. Bar, 10 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung der pulmonalen Granulome und alternativ aktivierten Makrophagen rund um das Ei S.mansoni. A. Pulmonale Granulom rund um das Ei Sm (schwarzer Pfeil) visualisiert wurde in H &amp; E-gefärbten Lungen-Abschnitten. B. Immunfluoreszenzfärbung für RELMα (grün), Mannose-Rezeptor (rot) und DAPI (blau) zeigt alternativ aktivierten Makrophagen (weißer Pfeil) in der Umgebung des Granuloms autofluoreszierenden Sm Ei (schwarzer Pfeil). Bar, 50 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> 4. S.mansoni Ei Antigen-spezifischen Th2-Cytokin-Antwort. Entleeren parathymic Lymphknotenzellen aus naiven (N) oder Sm Ei-injizierten Mäusen wurden mit Sm stimuliert &lt;/ Em&gt; Ei-Antigen für 72 Stunden, durch ELISA der Überstände für IL-4, IL-5 und IL-13 an. Scale, ng / ml. * P &lt;0,05.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier wird ein Modell beschäftigt Schistosoma mansoni Eier zu Typ-2-Lungen-Entzündung zu induzieren beschrieben. Charakteristische Merkmale dieses Modells sind die potenten Th2-Immunantwort, Entzündung der Atemwege und Lungen Granulombildung. Da diese Parameter in Abhängigkeit vom Th2 CD4-Zell-Antworten 11 sind, ist dies ein nützliches Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Protein-spezifischen oder Linie-spezifische Deletionen auf Th2-Zell-Reaktionen zu untersuchen. Hier die Anzeigen würde Quan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Größe / Beschreibung </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Packen </td><td> Fisher Scientific Co. LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Flüssigkeit </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon 50 ml </td><td> Packen </td><td> Falke </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE-Schlauch </td><td> 0,58 mm </td><td> Becton Dickinson und Co. </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> 250 ml </td><td> Abt Tiergesundheit </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge Animal Health </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Mannose-Rezeptor-Antikörper </td><td> Biotin </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metallic Schmutzfänger </td><td> Standard-Küchensieb </td><td> Ziel </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Wissenschaften </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 Liter </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 0891 17 01 </td></tr><tr><td> RELMα Antikörper </td><td> 50 ug </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Chirurgischen Faden </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Chirurgische Spezialgebiete Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Spritzennadel </td><td> 23g, 3/4 Zoll </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> US Standardtestsiebe Sieve </td><td> 150 um, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc. </td><td> ASTME-11, Spec. Nr. 100 </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> 20 mg / ml </td><td> Butler </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

mit den eizellen<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; als ein<em&gt; in vivo</em&gt; modell von helminthen-induzierten lungenentzündung

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma Parasiten sind Blut-Egel, die schätzungsweise 200 Millionen Menschen weltweit ein infizieren. Bei der chronischen Infektion mit Schistosoma, die schwere Pathologie, einschließlich Leberfibrose und Splenomegalie, wird durch die Immunantwort gegen den Parasiten Eier anstatt den Parasiten selbst 2 verursacht. Parasiteneier Induktion einer Th2-Antwort durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-13, die alternative Aktivierung von Makrophagen und die Ansammlung von Eosinophilen ist. Hier beschreiben wir Injektion von Schistosoma mansoni Eier als Modell, um Parasiten-spezifische Th2-Zytokin Reaktionen in der Lunge und Lymphknoten, die Bildung von Granulomen pulmonalen rund um das Ei, und Entzündung der Atemwege zu untersuchen. Nach intraperitonealer Sensibilisierung und intravenöse Herausforderung, S. mansoni Eier werden in die Lunge über den Lungenarterien, wenn sie im Lungenparenchym eingeschlossen transportiertdurch Granulome von Lymphozyten, Eosinophilen und alternativ aktivierten Makrophagen 3-6 besteht. Verbunden mit Granulombildung, Entzündung in den bronchoalveolären Raum, Ausdehnung der Lymphknoten-und CD4-T-Zell-Aktivierung beobachtet werden kann. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zur Isolierung von Schistosoma mansoni Eier aus infizierten Lebern (modifiziert nach 7), Sensibilisierung und herausfordernd Mäuse, und die Rückgewinnung der Organe (bronchoalveoläre Lavage (BAL), Lunge und Lymphknoten) für die Analyse. Wir berücksichtigen auch Vertreter histologischen und immunologischen Daten und Vorschläge für weitere immunologische Analyse. Insgesamt liefert diese Methode ein in vivo Modell zu Helminthen ausgelösten immunologischen Reaktionen in der Lunge zu untersuchen, was ist breit anwendbar auf das Studium der Th2 entzündlichen Erkrankungen einschließlich Wurminfektionen, fibrotische Erkrankungen, allergische Entzündungen und Asthma. Vorteile dieses Modells für die Untersuchung von typ.e 2 Entzündung in der Lunge sind die Reproduzierbarkeit eines potenten Th2-Entzündungsreaktion in der Lunge und Lymphknoten, die Leichtigkeit der Beurteilung von Entzündungen, die durch die histologische Untersuchung der Granulome rund um das Ei, und das Potenzial für langfristige Lagerung des Parasiten Eier.

Schistosoma mansoni Eier sind potente Stimulatoren der T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) Immunantwort, die charakteristisch für Parasitenbefall, Asthma und allergische Entzündung. Dieses Protokoll nutzt S. mansoni Ei Injektion an einen CD4 Th2-Zytokin-induzierte Entzündungsreaktion in der Lunge, Lunge durch Granulombildung um das Ei gekennzeichnet, Eosinophilie und Makrophagen-Aktivierung Alternative zu generieren.

Mit den Eizellen<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als ein<em&gt; In vivo</em&gt; Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung

Schistosoma-Parasiten sind Blutegel, die schätzungsweise 200 Millionen Menschen weltweit infizieren 1. Bei einer chronischen Schistosoma-Infektion ist die schwere ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Lungenentzündung und die Immunzellantworten zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Helmintheneier aus mit SHTA infizierten Lebern gereinigt werden. In einem zweiten Schritt werden Mäuse immunisiert und mit gereinigten Eiern herausgefordert, wodurch eine starke entzündliche Reaktion in der Lunge ausgelöst wird.Anschließend werden Lungen und drainierende lymphatische Organe der Mäuse isoliert, um die Stärke der entzündlichen Reaktion auf das Helminthen-Ei zu bewerten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine starke, durch das Helminthen-Ei induzierte Lungenentzündung, basierend auf der Rekrutierung entzündlicher Zellen in die Lunge und der Beobachtung der eindringlichen Lungenpathologie. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik neu sind, anfangs Schwierigkeiten haben, da Sorgfalt und Präzision bei der Dissektion von Lunge und Lymphknoten sowie bei der Injektion der Eier erforderlich sind.Jedoch lohnt sich die Perfektionierung dieser Technik, da sie die Visualisierung einer starken entzündlichen Lungenreaktion auf die Helmuth-Eier ermöglicht. Demonstriert wird die Technik von Karen und Will, Technikern im Labor von Nyer und Greenberg. Legen Sie eine mit Schistosoma circ infizierte, euthanasierte Maus auf den Rücken und schneiden Sie die Haut auf, um das Peritoneum freizulegen. Entfernen Sie die Leber, die sich unterhalb des Rippenbogens und des Zwerchfells befindet. Zerkleinern Sie die Lebern fein und geben Sie 20 Milliliter pro Leber der Verdauungsmischung hinzu, die aus Kollagenase, Dys, Base, Penicillin und Streptomycin in PBS besteht. Geben Sie diese Mischung in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag. Zentrifugieren Sie die Mischung. Gießen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab und füllen Sie das Röhrchen mit PBS; zentrifugieren Sie erneut und wiederholen Sie die PBS-Waschung. Nach der letzten Zentrifugation ist die Waschung abgeschlossen.Suspendieren Sie das Pellet in 25 Milliliter PBS. Anschließend filtrieren Sie das resuspendierte Pellet durch ein metallisches Sieb, gefolgt von einer Filtration durch ein Sieb. Geben Sie diese filtrierte Mischung in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie es.Geben Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter PBS. Überlagern Sie die Mischung vorsichtig mit einem 40-Milliliter-Gradienten aus acht Milliliter pro Anruf und 32 Milliliter 0,25-molarer Saccharose und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 800 × g und 20 °C.Entfernen Sie anschließend die oberste Schicht der Leberzellen mit einer Transferpipette. Heben Sie das Eipellet am Boden ab und geben Sie es in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Waschen Sie das Pellet dreimal mit je 10 Milliliter PBS, das EDTA und EGTA enthält, und zentrifugieren Sie. Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikroliter PBS. Überlagern Sie diese Mischung mit einem neuen 10-Milliliter-Gradienten, der 2,5 Milliliter Per Call und 7,5 Milliliter 0,25-molarer Saccharose enthält, und zentrifugieren Sie. Waschen Sie das Pellet dreimal in 10 Milliliter.PBS und Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass der Falcon-Röhrchen gut gemischt ist, und entnehmen Sie 50 Mikroliter aus der letzten Waschung. Um die Eier zu zählen, verdünnen Sie die 50 Mikroliter.Vermischen Sie mit 450 Mikrolitern PBS und geben Sie 100 Mikroliter dieser Mischung auf einen Objektträger auf dem Objekttisch eines Stereomikroskops, um die Tröpfchen zu zählen. Resuspendieren Sie die Eier in PBS auf eine Konzentration von 50.000 Eiern pro Milliliter. Die Eier können mehrere Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert und zum Gebrauch ein- oder zweimal aufgetaut werden. Vor der Verwendung prüfen Sie die Eier unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie noch intakt sind, in einem 5-Milliliter-Schraubglas mit Schnappdeckel.Bereiten Sie die Eier mit 5.000 Eiern pro 100 Mikroliter PBS für die Injektion vor. Schätzen Sie 50 % mehr Eier als notwendig ein. Befüllen Sie eine 23-Gauge-Nadel mit einer Länge von fünf Achtel Zoll und eine Ein-Milliliter-Spritze mit je 100 Mikrolitern Eiersuspension pro Maus.Schwenken Sie die Spritze hin und her, um die Eier vor jeder Injektion zu mischen, und injizieren Sie 100 Mikroliter Suspension pro Maus intraperitoneal am 14. Tag nach der Sensibilisierung. Bereiten Sie die Eier wie zuvor mit 5.000 Eiern pro 100 Mikroliter zu und füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze und eine 23-Gauge-Nadel mit den Eiern. Biegen Sie die Nadel mit einer Pinzette im 90-Grad-Winkel und stellen Sie sicher, dass keine Bläschen vorhanden sind.Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf die Seite. Injizieren Sie 100 µL Suspension in die Gefäße hinter dem Auge in einem Winkel von 45 Grad zur Nase. Acht Tage nach der intravenösen Herausforderung euthanasieren Sie die Maus und führen einen kleinen Schnitt in der Bauchhaut durch.Öffnen Sie das Peritoneum und lokalisieren Sie die Bauchaorta. Durchtrennen Sie die Aorta, um Blut mit einer Pasteurpipette zu gewinnen, und lagern Sie es auf Eis. Bewegen Sie die Leber nach unten, um das Zwerchfell freizulegen.Verwenden Sie feine Scheren, um das Zwerchfell zu durchtrennen, und schneiden Sie vorsichtig. Öffnen Sie den Brustkorb, um das Lungengewebe freizulegen. Die parathymischen Lymphknoten befinden sich unterhalb des Brustkorbs oberhalb der Lunge und auf beiden Seiten des Thymus.Entnehmen Sie die Lymphknoten mit feinen Pinzetten und lagern Sie sie auf Eis in einem Milliliter steriler Kulturmedien. Um die Intubationsprozedur zu beginnen, schieben Sie die Speicheldrüsen zur Seite, um die Luftröhre freizulegen. Legen Sie eine feine Pinzette unter die Luftröhre und verwenden Sie feine Scheren.Schneiden Sie ein Loch in die Mitte der Luftröhre und führen Sie einen Schlauch in die Lunge ein. Sichern Sie den Schlauch, indem Sie ihn mit chirurgischem Faden festbinden. Befestigen Sie nun eine mit PBS gefüllte Ein-Milliliter-Spritze am Schlauch und füllen Sie die Lunge mit einem Milliliter PBS auf.Entnehmen Sie vorsichtig die BAL-Spülung mit der Spritze und stellen Sie diese auf Eis. Befestigen Sie anschließend eine mit 4 % Paraformaldehyd in PBS gefüllte Ein-Milliliter-Spritze an der Kanüle und blähen Sie die Lunge auf. Entfernen Sie danach die Kanüle und ziehen Sie den chirurgischen Faden fest, um ein Austreten des PFA zu verhindern.Schließlich wird das Lungengewebe vorsichtig präpariert und in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit fünf Millilitern 4 % PFA in PBS gegeben. Nach einer Inkubation von 0,5 bis zwei Stunden auf Eis wird das gesammelte Blut zentrifugiert, um die Serum-Schicht zu gewinnen; das Serum kann für ELISA-Analysen zur Bestimmung antigenspezifischer IgG-Isotypen gegen S. mansoni-Ei-Antigen verwendet werden. Resektivierte parasaïtäre Lymphknoten können mit S. mansoni-Ei-Antigen re-stimuliert werden, um antigenspezifische TH2-Zytokine zu analysieren. Nach Zentrifugation und Pellettieren der Zellen wird die BAL-Flüssigkeit gewonnen und zur Analyse von TH2-Zytokinen mittels ELISA verwendet. BAL-Zellen werden für die Zytospin-Präparation gewonnen.Lungenproben, die für histologische und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen über Nacht fixiert wurden, sind hier abgebildet; zu sehen sind Bilder von granulomatösen Lebern, die charakteristisch für hohe Belastungen mit Esman-Eiern sind. Abgebildet sind außerdem Esman-Eier. Diese Abbildung zeigt eine Atemwegsentzündung, die durch die Injektion von Essman sooni-Eiern ausgelöst wurde.Der Graph auf der linken Seite zeigt, dass die Anzahl der BAL-Zellen bei mit s. mansoni-Eiern injizierten Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen deutlich höher ist. Die Bilder auf der linken Seite sind repräsentative Zytospinfunktionspräparate von BAL-Zellen, bei denen das entzündliche Infiltrat, bestehend aus Makrophagen, Eosinophilen und Lymphozyten, deutlich sichtbar ist.Ein pulmonales Granulom, das das Esson-Ei umgibt, ist in einem mit H und E gefärbten Lungenpräparat dargestellt. Diese Aufnahme zeigt eine immunfluoreszenzfarbliche Markierung für Realm Alpha, dargestellt in Grün. Der Mano-Rezeptor, dargestellt in Rot, und die DPI-Färbung, dargestellt in Blau, machen alternativ aktivierte Makrophagen sichtbar, die durch den weißen Pfeil gekennzeichnet sind.Die auf das S. mansoni-Ei-Antigen spezifische TH2-Zytokinantwort in den parazitären Lymphknoten von naiven und mit S. mansoni behandelten Mäusen wird hier gezeigt. Zellen aus den Lymphknoten jeder Gruppe wurden 72 Stunden lang mit S. mansoni-Ei-Antigen stimuliert. Anschließend wurde ein ELISA der Überstände auf IL-4, IL-5 und IL-13 durchgeführt.Die Konzentrationen aller drei entzündungsfördernden Zytokine waren nach der Entwicklung deutlich höher in den mit Esman behandelten Mäusen. Diese Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der Allergie und Helm-Infektion eine einfache Möglichkeit, die im Mausmodellorganismus als Reaktion auf eine Infektion mit parasitären Helmen und Allergien rekrutierten Immunzellen zu untersuchen.

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