Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine standardisierte Nachbeobachtung des in vivo-Verhaltens von Stammzellen zu erreichen, die in das Gehirn von Mäusen transplantiert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die aus dem Knochenmark stammenden Stromazellen markiert werden, die EGFP und Luciferase mit fluoreszierenden mikrometergroßen Eisenoxidpartikeln coexprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, die MPIO-markierten BMCs in das Hirngewebe der Maus zu injizieren.

Anschließend werden das Überleben und die Lokalisation von Zelltransplantaten nicht-invasiv mit Hilfe von Biolumineszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie verfolgt. Der letzte Schritt besteht darin, die Ergebnisse der In-vivo-Bildgebung mit Hilfe einer postmortalen histologischen Analyse zu validieren. Diese Methode kann Aufschluss über das Verhalten von Stammzellen nach der Transplantation in das Gehirn von Mäusen geben, aber auch auf andere Systeme wie Modellorganismen und Studien zu einer Krankheit angewendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte im Umgang mit den Tieren schwer zu erlernen sind, da intravenöse und intrazerebrale Injektionen schwierig durchzuführen sind und gewisse Risiken für das Überleben der Tiere bergen. Um dieses Verfahren zu starten, fügen Sie 75 mal 10 zu den sechs glazialen blauen Mikrometer-Eisenoxidpartikeln zu einer subkonfluent wachsenden Zellkultur hinzu. Inkubieren Sie sie weitere 16 Stunden lang, um die Partikelaufnahme durch Endozytose zu ermöglichen, und waschen Sie dann die restlichen Partikel weg.

Lassen Sie die Zellen weitere 24 Stunden wachsen, um eine Zellkofluenz und eine homogene Verteilung des G-B-M-P-I-O zu erhalten. Verwenden Sie danach die Fluoreszenzmikroskopie, um die Partikelaufnahme visuell zu validieren, indem Sie das Verhältnis von EGFP-positiven und G-B-M-P-I-O-positiven Zellen zur Gesamtmenge der EGFP-positiven Zellen berechnen. Waschen Sie anschließend die G-B-M-P-I-O, markierten BMSC-Luciferase-EGFP-Zellen zweimal mit 10 Millilitern.

PBS behandeln die Zellen mit Tripsin EDTA und ernten sie anschließend. Belohnen Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Endkonzentration von 133 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in PBS. Bewahren Sie die Zellen schließlich bis zur Transplantation auf Eis auf.

Bei diesem Verfahren wird die Maus durch intraperitoneale Injektion des Gemisches aus Ketamin in einer Menge von 80 Milligramm pro Kilogramm und Xylazin in einer Menge von 16 Milligramm pro Kilogramm anästhesiert. Warten Sie fünf Minuten, bis die Maus eingeschlafen ist, und rasieren Sie dann ihren Kopf, um sterile Manipulationen zu ermöglichen. Platzieren Sie anschließend die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und desinfizieren Sie die Haut mit Alkohol.

Tragen Sie danach Salbe auf die Augen auf Um Austrocknung zu verhindern. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie, um den Schädel freizulegen und den Hippocampus zu erreichen. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer zwei Millimeter posterior und zwei Millimeter lateral ein Loch in den Schädel.

An dieser Stelle die Zellsuspension kurz vortexen und dann die Zellsuspension in der Spritze aspirieren. Senken Sie anschließend die Nadelspritze bis zu einer Tiefe von 2,5 Millimetern unter die Dura ab und lassen Sie eine Minute lang einen Druckausgleich zu. Ziehen Sie die Nadel nach einer Minute bis zu einer Position von zwei Millimetern unter die Dura zurück.

Injizieren Sie dann drei Mikroliter Zellsuspension mit einer automatisierten Mikroinjektionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,70 Mikrolitern pro Minute. Warten Sie nach der Injektion weitere fünf Minuten, um einen Rückfluss der injizierten Zellsuspension zu verhindern. Ziehen Sie dann die Nadel langsam zurück.

Desinfizieren Sie anschließend die Hautränder und nähen Sie die Haut. Injizieren Sie 300 Mikroliter 0,9%ige Natriumchloridlösung subkutan, um eine Dehydrierung zu verhindern. Legen Sie die Maus zum Schluss unter eine Heizlampe, um sich von der Narkose zu erholen und eine Biolumineszenzbildgebung durchzuführen.

Betäuben Sie die Maus mit einer Mischung aus 3% ISO, Fluor und Sauerstoff. Platzieren Sie dann die Maus in den Photonen-Imager. Reduzieren Sie den Anästhesiespiegel, indem Sie den Fluorspiegel auf 1,5 % einstellenAls nächstes injizieren Sie d Lucifer intravenös in einer Menge von 150 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.

Nehmen Sie fünf Minuten lang Bilder mit der Foto-Vision-Software auf. Führen Sie danach die Bildverarbeitung mit der M three Vision Software durch und quantifizieren Sie das beobachtete Signal anhand fester Regions of Interest. Um eine Magnetresonanztomographie durchzuführen, betäuben Sie die Maus mit 3%igem ISO-Fluor in einem Gemisch aus Sauerstoff und Stickstoffmonoxid.

Platzieren Sie dann die Maus in der Halterung eines horizontalen 9,4 Tesla MR-Systems. Reduzieren Sie den Anästhesiepegel, indem Sie den Fluoranteil auf 1% einstellenAls nächstes tragen Sie Salbe auf die Augen der Maus auf, um eine Austrocknung zu verhindern. Verwenden Sie danach eine rektale Sonde, um die Körpertemperatur zu überwachen.

Platzieren Sie dann einen Sensor unter dem Mausbauch, um die Atemfrequenz zu überwachen. Halten Sie die Atemfrequenz bei 110 plus oder minus 10 Mal pro Minute und halten Sie die Körpertemperatur konstant in einem engen Bereich von 37 plus oder minus 0,5 Grad Celsius. Platzieren Sie dann die Oberflächen-HF-Spule auf dem Mauskopf.

Positionieren Sie die Maus in der Mitte des Magneten. Öffnen Sie anschließend ParaVision 5.1 Stellen Sie die Sequenzparameter gemäß dem beigefügten Manuskript ein. Nehmen Sie dann einen Satz von 10 koronalen T-Bildern mit zwei gewichteten Spin-Echo-Bildern auf, um spezifische anatomische Informationen zu erhalten.

NT zwei sterngewichtete Gradienten-Echobilder zur Untersuchung der Stammzellmigration mit einer Auflösung von 70 Mikrometern im Quadrat. Opfere in diesem Schritt die Maus und entferne das Gehirn. Fixieren Sie das Gehirngewebe bei Raumtemperatur in 4% Paraldehyd in PBS für zwei Stunden.

Nach zwei Stunden. Dehydrieren Sie das Gehirngewebe, indem Sie es in verschiedene Saccharosegradienten bei vier Grad Celsius legen. Frieren Sie am nächsten Tag das Hirngewebe mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie das Gewebe bei minus 80 Grad Celsius bis zum Schnitt, wenn es fertig ist.

Schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Kryostaten in 10 Mikrometer dicke Schnitte. Anschließend werden die ungefärbten Kryoschnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop auf blaue Fluoreszenz aus den G-B-M-P-I-O-Partikeln und grüne Fluoreszenz aus den EGFP-exprimierenden Zellen untersucht. Untersuchen Sie dann die ungefärbten Kryoschnitte auf grün-rote Hintergrundfluoreszenz der Entzündungszellen.

Das beschriebene glazialblaue MPIO-Markierungsverfahren führt zu einer hocheffizienten Markierung von BMSC, Luciferase EGFP-Zellen, die leicht durch Fluoreszenzmikroskopie validiert werden kann. Als nächstes kann nach der Transplantation von G-B-M-P-I-O, markierten BMSC-Luziferase-EGFP-Zellen in das ZNS von Mäusen das Überleben des zellulären Transplantats durch in vivo Biolumineszenz-Bildgebung auf der Grundlage der Luciferase-Aktivität überwacht werden. Zusätzlich kann die genaue Lokalisation der transplantierten Zellen durch in vivo Magnetresonanztomographie auf Basis des Eisengehalts des glazialblauen MPIO überwacht werden.

Schließlich zeigt die histologische Analyse die Validierung der Ergebnisse, die durch Biolumineszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie erzielt wurden. Das stabile Überleben wurde durch eine stabile EGFP-Expression rechtzeitig nach seiner Entwicklung bestätigt. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der molekularen Bildgebung, um zelluläre und molekulare Ereignisse nach einer Stammzelltransplantation in verschiedenen Tiermodellen für neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie molekulare Bildgebung durchführen, Biolumineszenz und Magnetresonanztomographie anwenden und In-vivo-Ergebnisse durch histologische Postmortalbewertung angemessen validieren.