Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Dieses Video-Protokoll demonstriert die Identifizierung und Isolierung langsam teilender Zellen in menschlichem Glioblastom unter Verwendung von Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Ester, CFSE. Glioblastom-Tumorzellen werden zunächst mit dem Neurosphären-Assay kultiviert. Anschließend werden die resultierenden Sphären in Einzelzellen dissoziiert und mit CFSE gefärbt.

Die mit CFSE beladenen Zellen werden erneut ausplattiert. Bei der Neurosphärenkultur werden die entstandenen Sphären in Einzelzellen aufgespalten und durch das Durchflusszytometrie-Gerät geleitet. Langsam und schnell teilende Zellen werden anhand der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zellteilung identifiziert und sortiert.

Die Frequenzheterogenität ist ein wesentliches Merkmal von Krebs. Diese Heterogenität trägt zur Tumorrobustheit bei und stellt eine große Hürde für die Entwicklung vollständig wirksamer Therapien dar. Daher ist es entscheidend, Werkzeuge und Assays zu entwickeln, um diese genetisch, phänotypisch und funktionell definierte Heterogenität zu untersuchen und zu verstehen.

In diesem Video-Protokoll beschreiben wir eine etablierte Methode unter Verwendung der Flues und I-C-F-S-C. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung und Trennung einzelner Subpopulationen innerhalb einer Kultur humaner, aus Glioblastomen stammender Zellen mittels Durchflusszytometrie, wobei diese Subpopulationen unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen. Mithilfe dieser Technik haben wir eine Tumorzellpopulation isoliert und charakterisiert, die sich durch eine langsame Teilungsrate auszeichnet – eine funktionelle Eigenschaft, die mit der Tumorbildung in Verbindung gebracht wurde. Die Kultur von Gliom-Sphäroiden wird mit Hilfe des Neurosphären-Assays etabliert und gepflegt, welcher in einem separaten Video unter der auf dem Bildschirm angezeigten Adresse beschrieben ist.

Wenn die Gliomsphären einen Durchmesser von 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben, wird das Medium, das die Sphären enthält, entfernt und in ein steriles Gewebekulturröhrchen passender Größe überführt. Anschließend wird fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 800 U/min oder 110 ×g zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen und das Pellet der Sphären in einem Milliliter vorgewärmtem Trypsin-EDTA resuspendiert und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend wird ein gleiches Volumen Trypsininhibitor unter vorsichtigem Auf- und Abpipettieren hinzugefügt, um die Sphären zu dissoziieren.

Die Zellsuspension wird erneut zentrifugiert. Das Überstand wird entfernt und die Zellen werden in einem Milliliter neuronalem Stammzell-Grundmedium resuspendiert. 10 Mikroliter der Einzelzell-Suspension werden gründlich mit 90 Mikrolitern Trypanblau vermischt und eine Zellzählung wird für jeweils 1 Million zu färbende Zellen durchgeführt.

Ein Milliliter Färbelösung wird hergestellt, indem ein Mikroliter fünfmillimolarer CFSE-Farbstoff zu einem Milliliter neuronalem Stammzell-Grundmedium gegeben wird, um eine endgültige Färbe-Konzentration von fünf Mikromolar zu erhalten. Anschließend wird die Färbelösung gründlich gemischt. Die gewünschte Anzahl an Zellen wird dann in ein separates Röhrchen überführt, zentrifugiert und das Überstand wird entfernt.

Die CFSE-Färbelösung wird anschließend zum Pellet gegeben und vorsichtig bis zur Homogenität vermischt und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um den Färbeprozess zu stoppen. Fünf bis zehn Volumina eiskaltes neurostammzellbasiertes Basalmedium werden zu den mit CFSE beladenen Zellen gegeben und gut vermischt. Die Zellsuspension wird dann zentrifugiert und das Überstand wird verworfen.

Zu diesem Zeitpunkt sollte sich ein Zellpellet am Boden des Röhrchens mit einer grünen Färbung befinden, was darauf hinweist, dass die Färbung erfolgreich war. Um überschüssigen CFSE-Farbstoff zu entfernen, werden zwei bis drei Waschschritte durchgeführt, indem das Pellet in einem Milliliter neurobasalem Stammzellmedium resuspendiert, zentrifugiert und der Überstand verworfen wird.

Nach der dritten Wäsche werden die Zellen in einem ml neurobasalem Stammzellmedium resuspendiert, und eine Zellzählung wird wie zuvor beschrieben durchgeführt, um die Zellen zu plattieren. Dem vollständigen neurostamzellenspezifischen Medium wird EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml zugesetzt. Anschließend werden die Zellen aus den mit CFSE beladenen und unbehandelten Gruppen ihren jeweiligen Röhrchen hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 50.000 Zellen pro ml zu erreichen.

Dann werden die Zellsuspensionen gründlich gemischt und in sterilen Zellkulturgefäßen ausplattiert. Die Gefäße werden anschließend beschriftet. Die Zellen können unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht werden, um die CFSE-Färbung zu überprüfen, und danach für fünf bis zehn Tage in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2 gestellt werden.

Um die CFSE-Färbung mittels Durchflusszytometrie zu überprüfen, werden 500.000 Zellen aus mit CFSE beladenen und unbehandelten negativen Kontrollgruppen in separate FACS-Röhrchen überführt. Der Durchflusszytometer wird gemäß der Bedienungsanleitung für die entsprechenden Parameter eingestellt. Zunächst werden die unbehandelten Kontrollzellen gemessen und die Ereignisse anhand der Eigenschaften des Vorwärts- und Seitenstreulichts aufgezeichnet; anschließend wird in einem Histogramm, das die Zellfrequenz über der CFSE-Intensität darstellt, die Hauptzellpopulation markiert, um die Stärke der CFSE-Fluoreszenzintensität zu überprüfen.

Danach werden die mit CFSE beladenen Zellen unter Verwendung der gleichen Parameter analysiert, die auch für die Kontrollzellen verwendet wurden, wie ersichtlich ist. Die CFSE-positiven Zellen weisen eine Fluoreszenzintensität auf, die um Größenordnungen höher liegt als die der Kontrollzellen. Wenn die Gliomsphäroide einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben.

Die Sphäroide werden passagiert und eine Einzelzell-Suspension wird sowohl aus den mit CFSE beladenen als auch aus den unbehandelten Gruppen wie zuvor beschrieben hergestellt. Anschließend werden die Zellen in einem geeigneten Volumen steriler 1× PBS resuspendiert und eine Zellzählung durchgeführt, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen. Beim Sortieren mittels Durchflusszytometrie wird Propidiumiodid in einer Konzentration von einem Mikroliter pro Milliliter Zellsuspension zugegeben, um langsam und schnell teilende Zellen zu sammeln.

Beim Sortieren werden zwei sterile 15-ml-Zellkulturröhrchen vorbereitet, die jeweils ein ml vollständiges Neurostammzellmedium enthalten. Anschließend werden die Zellen auf Eis gestellt, während sie zur Durchflusszytometrieanlage transportiert werden. Zunächst wird die Zellsuspension der unbehandelten Zellgruppe durch den Durchflusszytometer geleitet.

Die Ereignisse werden basierend auf Forward Scatter gegenüber Side Scatter dargestellt, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen. Die Zellen werden basierend auf Side Scatter gegenüber PI-Reaktivität dargestellt, und eine einzelne Population lebender Zellen wird als Population eins selektiert. Anschließend wird anhand der Forward- und Side-Scatter-Eigenschaften eine homogene Zellpopulation aus Population eins ausgewählt und als Population zwei markiert. Danach wird Population zwei in einem Histogramm dargestellt, das die Zellfrequenz gegenüber der CFSE-Intensität auf einer logarithmischen Skala zeigt, unter Verwendung derselben Parameter und Gating-Strategie.

Die mit CFSE markierten Zellen werden durch den Durchflusszytometer gegeben und analysiert. Anschließend werden die unteren 85 % der Zellen als schnell teilende und die oberen 5 % als langsam teilende Zellen ausgewählt. Diese verschiedenen interessierenden Zellpopulationen werden angereichert und in separate sterile Gewebekulturröhrchen mit 15 ml, die jeweils ein ml vollständiges Neurostammzellmedium enthalten, sortiert.

Die Sortierraten-Schwellenwert sollte so eingestellt werden, dass er 2.500 Ereignisse pro Sekunde nicht überschreitet. Nach Abschluss der Sortierung werden die Zellen zentrifugiert, das Überstand wird verworfen und das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium resuspendiert, anschließend erfolgt eine Zellzählung. Danach werden die Zellen der verschiedenen sortierten Populationen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro ml ausplattiert.

In vollständigem Neurostammzellmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro ml EGF, werden die Zellen anschließend fünf bis 10 Tage lang inkubiert, um Sphäroide zu bilden. Dies ist ein Beispiel für Zellen. Kurz nach der Beladung mit CFSE-Farbstoff weisen alle Zellen eine intensive grüne Fluoreszenz auf, die im Fluoreszenzmikroskop sichtbar ist.

Dies ist ein Bild einer repräsentativen Gliomsphäre, die sechs Tage nach der Aussaat aus einer mit A-C-F-S-E beladenen Zelle gewonnen wurde. Beachten Sie, dass einige Zellen noch eine sehr intensive CFSE-Färbung aufweisen. Dies ist ein Beispiel für ein Durchflusszytometrie-Histogramm, das zeigt, dass die CFSE-Intensität im Laufe der Zeit abnimmt.

Blau repräsentiert die frisch mit CFSE beladenen Zellen, die eine hohe Fluoreszenzintensität zeigen. Diese ist um Größenordnungen höher als die der unbeladenen Zellen, die rot dargestellt sind. Grün zeigt die nach sechs Tagen abgebaute Fluoreszenzintensität infolge der Zellteilung nach der Beladung mit CFSE.

Dies sind repräsentative Sphäroide, die sieben Tage nach der Isolierung von schnell und langsam teilenden Populationen gezüchtet wurden. Die Frequenzen der Sphäroidbildung unterscheiden sich nicht zwischen den beiden Gruppen, jedoch wachsen die CFSC-beibehaltenden Zellen langsamer und bilden im Vergleich zu den CFSC-verdünnenden Zellen kleinere Sphäroide. Die Verwendung von CFSC zur Identifizierung und Isolierung von Zellsubpopulationen basierend auf der Zellteilungsrate stellt einen Ausgangspunkt für nachgeschaltete Experimente und weitere Charakterisierungen dar.

Dieses Protokoll bietet ein Beispiel zur Identifizierung langsam teilender Zellen in aus humanem Gliom stammenden Kulturen, kann jedoch auch auf andere Tumorzelltypen oder nicht-krebsöse Systeme angewendet werden. Vielen Dank fürs Zuschauen und wir hoffen, dass Sie dieses Protokoll für Ihre Forschung hilfreich fanden.