Name: Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Lernen Sie die Identifizierung und Isolierung langsam teilender Zellen in humanem Glioblastom mittels CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorheterogenität.

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Diese Arbeit wurde von der Florida Center for Brain Tumor Research, Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapie und den National Institutes of Health (1R21CA141020-01) unterstützt.

Ein. Vorbereiten Glioblastoma Single Cell Suspension <ol><li> Gliomasphere Kultur aufgebaut und gepflegt mit dem Neurosphäre Assay (NSA), wie zuvor beschrieben 2,11,12. </li><li> Zum geeigneten Zeitpunkt für Passagieren der gliomaspheres wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe sterilen Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet von Kugeln wird in 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3-5 min. </li><li> Ein gleiches Volumen von Sojabohnentrypsininhibitor wird dann verwendet, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. </li><li> Die Zellsuspension wird sanft auf und pipettiert auf Homogenität und eine vollständige Neutralisation der Trypsin-Aktivität zu gewährleisten. </li><li> Die Zellsuspension wird erneut bei 800 UpM für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden gewaschen und in 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium. </li><li> 10 ul der Einzelzell-Suspension wird mit 90μl der Trypanblau eine Zellzahl durchzuführen vermischt. </li></ol> 2. Färbung mit Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Green Fluorescent Dye <ol><li> Für jede 1 Mio. Zellen angefärbt werden, wird 1 ml Färbereagenz durch Zugabe von 1 ul 5 mM Zelle Trace CFSE Farbstoff (Molecular Probes, Invitrogen) zu 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium, um eine endgültige Färbung Konzentration von 5 uM geben bereit . </li><li> Das Färbereagens, welche die Zellen ist gut bis Homogenität gemischt und bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Während der Inkubation wird eiskalten NeuroCult NSC Basal Medium als Abschrecken Lösung hergestellt. </li><li> Um die Färbung zu beenden, wird ungefähr 5-10 Volumina eiskaltem Abschrecken Lösung der CFSE-beladenen Zellen zugegeben. </li><li> Die Lösung wird dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. </li><li> An thPunkt ist, sollte es ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens werden mit einem hell-grünen Farbton der Farbe, der angibt, die Färbung war erfolgreich. </li><li> Die Zellen werden durch Resuspendieren des Pellets in 1-2 ml frisches NeuroCult NSC Basal Medium, Zentrifugieren bei 800 UpM für 5 min und Verwerfen des Überstands gewaschen. Diese Prozedur wird für insgesamt drei Waschungen wiederholt. </li><li> Nach der dritten Wäsche werden die Zellen in 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium und eine Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird. </li><li> Die CFSE gefärbten Zellen werden dann in sterilem Gewebekulturflaschen in angemessener Dichte [50.000 Zellen / ml] plattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator. </li></ol> 3. CFSE Loading Verification <ol><li> Zellen in Kultur NSA ausplattiert können unter einem Fluoreszenzmikroskop zu CFSE Färbung überprüfen zu überwachen. In diesem Stadium weisen alle Zellen hellgrüne Farbe (Abbildung 1). Alternativ kann ein Tropfen der Zellsuspension ausCFSE gefärbten Zellen konnten auf einem Objektträger platziert und mit einem Deckglas abgedeckt, um Zellen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar zu machen. </li><li> Erfolgreiche CFSE Kennzeichnung ist ferner über Durchflusszytometrie bestätigt. So viele wie 1-5 x 10 5 Zellen von jeder Gruppe ist ausreichend für CFSE Färbung Verifikation. Die CFSE geladen Zellen und unbelasteten negativen Kontrollzellen jeweils in 1 x PBS-oder NeuroCult NSC Basal Medium bei einem Gesamtvolumen von 500 ul resuspendiert und in separaten FACS-Röhrchen. </li><li> Das Durchflusszytometer wird auf der Grundlage seiner Bedienungsanleitung Anweisungen für Parameter angepasst. CFSE eine Wellenlänge Anregungsmaximum von 492 nm und einer Emission von maximal 517 nm aufweist. </li><li> Zunächst werden die unbeladenen Kontrollzellen laufen und die erworbenen Ereignisse in Vorwärts-und side scatter (FSC vs SSC) und Histogramm aufgezeichnet und die wichtigsten Zellpopulation gated (Abbildung 2A). </li><li> Ähnlich werden die CFSE beladenen Zellen analysiert unter Verwendung der gleichen Parameters verwendet für Kontrollzellen (Abbildung 2B). </li></ol> 4. Isolierung der Slow-Division [dh CFSE Sicherungsring] Zellpopulation mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Nach Spaltung wird CFSE Intensität verringert und hGBM Zellen zu bilden, der aus Zellen gliomaspheres ausstellenden verschiedenen Ebenen der grünen Fluoreszenz-Intensität (Abbildung 3) zusammengesetzt sind. Wenn die gliomaspheres haben eine durchschnittliche Größe von etwa 150 bis 200 um Durchmesser (ca. 5 bis 10 Tage nach der CFSE Beladung in Abhängigkeit von der Zelllinie Wachstumsrate) erreicht, wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe steriler Gewebekultur Rohr und zentrifugiert bei 800 UpM für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Eine Einzelzell-Suspension wird hergestellt, wie im Stand der beschriebenen Schritte und die Zellen werden in PBS für eine Zellzahl resuspendiert, um eine Zellsuspension mit einer Dichte von bis zu 10 7 Zellen pro Milliliter vorzubereiten. </li><li> Achterner Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen PBS wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen, wenn sortiert / mittels Durchflusszytometrie analysiert zugegeben. </li><li> Zwei 15 ml steriler Gewebekultur Röhrchen mit jeweils 1 ml der vollständigen NeuroCult NSC Medium verwendet wird, um die sortierten langsamen teilende Zellen (CFSE Zurückhalten Zellen) und die schnellen teilenden Zellen (CFSE Verdünnen Zellen) zu sammeln. </li><li> Zuerst wird die Zellsuspension aus der unbelasteten Zellengruppe durch das Durchflusszytometer laufen. </li><li> Die Zellen (Ereignisse) basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) und Spannungsparameter für beide Parameter aufgetragen werden so eingestellt, dass die Mehrzahl der Zellen in der Strömung Parzelle enthalten sind. </li><li> Um tote Zellen auszuschließen oder beschädigt werden die Zellen basierend auf SSC gegen PI Reaktivität aufgetragen und die einzelne lebende Zellpopulation (PI negativ) ist gated. </li><li> Dann wird eine homogene Zellpopulation basierend auf f ausgewähltorward Scatter (FSC) versus seitliche Streulicht (SSC). </li><li> Die homogene einzelne lebende Zellpopulation wird dann in einem Histogramm Zelle Frequenz gegenüber CFSE Intensität auf einer logarithmischen Skala eingestellt Basis aufgetragen. Die CFSE Laserintensität eingestellt wird, um das negative Signal zwischen 0 und 100 zu platzieren. </li><li> Mit den gleichen Parametern und eine ähnliche Gating Strategie werden die markierten Zellen durch CFSE Durchflusszytometer laufen und analysiert (4C). </li><li> Anschließend werden ein langsames Dividieren Population von Zellen und einer Gesamtpopulation (schneller teilenden Zellen), basierend auf ihrer Fähigkeit, CFSE (CFSE Hochspitze 5% und CFSE niedrigem Boden 85%, jeweils) zu halten identifiziert. </li><li> Diese unterschiedlichen Zellpopulationen werden dann in separate 15 ml sterile Zellkultur Röhrchen 1ml von kompletten NSC Medium sortiert. </li><li> Sortierten Zellen werden dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert. </li><li> Überstand wird verworfen und das Pellet wird resuspendiert in einem entsprechendsprechende Volumen Medium (abhängig von der Anzahl der getrennten Ereignissen oder Pelletgröße) und einer Zellzahl erfolgt. </li><li> Zellen aus den verschiedenen sortierten Populationen werden dann bei 50.000 Zellen pro Milliliter in einer geeigneten sterilen Zellkulturflasche ausplattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator für 5-10 Tage, bevor sie seriell passagiert oder zur nachgeschalteten Experimenten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nach CFSE Laden, präsentieren alle Zellen eine intensive grüne Fluoreszenz sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Diese grün getönten Farbe kann sogar mit dem bloßen Auge (siehe Video) gesehen werden. Die Analyse dieser Zellen mit Durchflusszytometrie zeigt auch sehr intensive grüne Fluoreszenz im Vergleich zur Kontroll-Zellen (Abbildung 2). Nach plating CFSE geladen Zellen in Neurosphäre Kultur, vermehren sich diese Zellen und bilden 150-200 um gliomaspheres in 5-10 Tagen. Da die Zellen proliferieren, t<html> er Fluoreszenzfarbstoff gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Glioblastome sind funktionell heterogen und werden von Zellen proliferieren auf unterschiedlichen Zeitskalen zusammengesetzt. Das Verfahren in dieser beschriebenen Protokoll ermöglicht einem, zu identifizieren und zu isolieren, schneller und langsamer teilenden Zellen durch ihre Fähigkeit, zu verdünnen oder zu behalten CFSE bzw. (Abbildung 3, siehe auch die Video). Durchflusszytometrieanalyse von dissoziierten gliomaspheres aus CFSE-beladenen Zellen im Vergleich zur unbelasteten Zellen erzeugt zeigt diverse CFSE Retentionseigenschaften (Abbildung 4). Schnell teilende Zellen (unten 85%) oder langsam teilenden Zellen (die obersten 5% - CFSE hoch) Ausstellung gliomapshere Fähigkeit zur Bildung, wenn in den Neurosphäre Testbedingungen (Abbildung 5) kultiviert. gure 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Dissoziierte Tumorzellen unmittelbar nach dem Laden mit CFSE Farbstoff. Die Zellen zeigen hellgrüne Farbe zeigen erfolgreiche Kennzeichnung. Ursprüngliche Vergrößerung, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. CFSE Laden der Bestätigung mittels Durchflusszytometrie. A) unbeladen Zellen, B) CFSE geladen Zellen und C) im Vergleich CFSE Fluoreszenzintensität im beladenen gegenüber unbelasteten Zellen. Beachte, dass es mehrere Größenordnungen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den markierten und unmarkierten Zellen. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ein Vertreter gliomasphere aus einer CFSE-beladenen Zelle 6 Tage nach dem Ausplattieren abgeleitet. Einige Zellen weisen sehr hell CFSE Färbung. Ursprüngliche Vergrößerung, 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Bild 4&quot; /&gt; Abbildung 4. Vertreter Durchflusszytometrie Grundstücke / Histogramme zur Isolierung von schnellen und langsamen teilenden Zellen 6 Tage nach CFSE Färbung. A) FSC vs SSC den gesamten Zellpopulation zeigen, B) SSC vs PI Reaktivität, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, C) FSC vs SSC zum Gate eine homogene Live Zellpopulation, D) zeigt das Vorhandensein von CFSE Beibehaltung Zellen 6 Tage nach CFSE Kennzeichnung durch eine größere Intensität der Fluoreszenz im Vergleich zur negativen Kontrolle nachgewiesen. Das Histogramm zeigt auch, dass die CFSE Intensität über die Zeit. E verfiel) Histogramm zeigt die Gating-Strategie CFSE Beibehaltung Zellen (Top 5%) und CFSE Verdünnen Zellen (unten 85%) zu identifizieren. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Vertreter gliomaspheres generiert aus <strong&gt; A) schnell teilenden Zellen (CFSE niedrig) und B) langsam teilenden Zellen (CFSE hoch). Original Vergrößerung:. 10x und 20x bzw. C) Vertreter Zellzahl von schnell oder langsam teilenden Zelle abgeleitete Kultur Durchlaufzeit erhalten. P &lt;0,05, t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li>
<li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li>
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<li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li>
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<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
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<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine wachsende Zahl von Studien haben die Bedeutung eines langsamen teilende Unterabteil von Zellen in Krebszellen, die Tumorbildung und Therapieresistenz 2-8 beitragen demonstriert. Daher ist es wichtig, zu beschreiben und zu standardisieren experimentellen Methoden, mit denen das Studium dieser spezifischen Subpopulation von Zellen oder mehr allgemein Subpopulationen mit unterschiedlichen Wachstumsraten vergleichen. Mit CFSE zu identifizieren und zu isolieren, Sub-Fraktionen von Zellen auf ihre Rate der Zel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) </td><td> Medium Ergänzung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Sojabohnentrypsininhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25-Flasche </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit </td><td> Fluorescent Cell Division Markierungsfarbstoff </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identifizierung und isolierung von slow-teilenden zellen im menschlichen glioblastoma mit carboxyfluorescein succinimidyl ester (cfse)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumorheterogenität stellt eine grundlegende Funktion tragenden Tumor Robustheit und stellt eine zentrale Hindernis für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ein. Um das Problem der Tumorheterogenität zu überwinden, ist es wichtig, Tests und Tools ermöglichen phänotypische, (epi) genetische und funktionelle Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-Subpopulationen, die spezifische Krankheit Krankheiten zu fahren und stellen klinisch relevante Ziele zu entwickeln. Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass Tumore unterschiedlichen Sub-Fraktionen von Zellen mit unterschiedlichen Frequenzen der Zellteilung zeigen, und dass die funktionalen Kriterien der langsamen Rad positiv mit Tumorbildung Fähigkeit in mehreren Krebsarten einschließlich des Gehirns, der Brust, der Haut und die damit verbundenen Bauchspeicheldrüse sowie Leukämie 2-8. Der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) hat zum Verfolgen der Teilung Häufigkeit von Zellen in vitro und in vivo im Blut übertragbaren t verwendetumors und soliden Tumoren wie zB Glioblastoma 2,7,8. Das Zell-permeierenden nicht fluoreszierenden Prodrug CFSE wird durch intrazelluläre Esterasen in eine fluoreszierende Verbindung, die innerhalb der Zellen durch kovalentes Binden an Proteine ​​durch Reaktion seiner Succinimidyl-Komponente mit intrazellulären Amingruppen zu bilden stabile Amidbindungen 9 zurückgehalten wird umgewandelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zellzyklus Frequenz von bis zu 8-10 Runden Teilung 10. CFSE Rückhaltevermögen wurde mit Hirntumorzellen zur Identifizierung und Isolierung eines langsamen Rad Subpopulation (obere 5% Farbstoff haltenden Zellen) nachgewiesen, bei Krebs Stammzellaktivität 2 angereichert werden. Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Färbung von Zellen mit CFSE und die Isolierung einzelner Populationen innerhalb einer Kultur von menschlichen GlioBlastom (GBM)-abgeleiteten Zellen mit unterschiedlichen Teilungsraten mittels Durchflusszytometrie 2. Die Technik hat dazu gedient, zu identifizieren und zu isolieren, einen Hirntumor slow-cycling Population von Zellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die CFSE Kennzeichnung erhalten.

Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Die Tumorheterogenität stellt ein grundlegendes Merkmal dar, das die Robustheit von Tumoren unterstützt, und bildet ein zentrales Hindernis für die Entwicklung therapeutischer ...

Dieses Video-Protokoll demonstriert die Identifizierung und Isolierung langsam teilender Zellen in menschlichem Glioblastom unter Verwendung von Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Ester, CFSE. Glioblastom-Tumorzellen werden zunächst mit dem Neurosphären-Assay kultiviert. Anschließend werden die resultierenden Sphären in Einzelzellen dissoziiert und mit CFSE gefärbt.Die mit CFSE beladenen Zellen werden erneut ausplattiert. Bei der Neurosphärenkultur werden die entstandenen Sphären in Einzelzellen aufgespalten und durch das Durchflusszytometrie-Gerät geleitet. Langsam und schnell teilende Zellen werden anhand der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zellteilung identifiziert und sortiert.Die Frequenzheterogenität ist ein wesentliches Merkmal von Krebs. Diese Heterogenität trägt zur Tumorrobustheit bei und stellt eine große Hürde für die Entwicklung vollständig wirksamer Therapien dar. Daher ist es entscheidend, Werkzeuge und Assays zu entwickeln, um diese genetisch, phänotypisch und funktionell definierte Heterogenität zu untersuchen und zu verstehen.In diesem Video-Protokoll beschreiben wir eine etablierte Methode unter Verwendung der Flues und I-C-F-S-C. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung und Trennung einzelner Subpopulationen innerhalb einer Kultur humaner, aus Glioblastomen stammender Zellen mittels Durchflusszytometrie, wobei diese Subpopulationen unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen. Mithilfe dieser Technik haben wir eine Tumorzellpopulation isoliert und charakterisiert, die sich durch eine langsame Teilungsrate auszeichnet – eine funktionelle Eigenschaft, die mit der Tumorbildung in Verbindung gebracht wurde. Die Kultur von Gliom-Sphäroiden wird mit Hilfe des Neurosphären-Assays etabliert und gepflegt, welcher in einem separaten Video unter der auf dem Bildschirm angezeigten Adresse beschrieben ist.Wenn die Gliomsphären einen Durchmesser von 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben, wird das Medium, das die Sphären enthält, entfernt und in ein steriles Gewebekulturröhrchen passender Größe überführt. Anschließend wird fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 800 U/min oder 110 ×g zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen und das Pellet der Sphären in einem Milliliter vorgewärmtem Trypsin-EDTA resuspendiert und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend wird ein gleiches Volumen Trypsininhibitor unter vorsichtigem Auf- und Abpipettieren hinzugefügt, um die Sphären zu dissoziieren.Die Zellsuspension wird erneut zentrifugiert. Das Überstand wird entfernt und die Zellen werden in einem Milliliter neuronalem Stammzell-Grundmedium resuspendiert. 10 Mikroliter der Einzelzell-Suspension werden gründlich mit 90 Mikrolitern Trypanblau vermischt und eine Zellzählung wird für jeweils 1 Million zu färbende Zellen durchgeführt.Ein Milliliter Färbelösung wird hergestellt, indem ein Mikroliter fünfmillimolarer CFSE-Farbstoff zu einem Milliliter neuronalem Stammzell-Grundmedium gegeben wird, um eine endgültige Färbe-Konzentration von fünf Mikromolar zu erhalten. Anschließend wird die Färbelösung gründlich gemischt. Die gewünschte Anzahl an Zellen wird dann in ein separates Röhrchen überführt, zentrifugiert und das Überstand wird entfernt.Die CFSE-Färbelösung wird anschließend zum Pellet gegeben und vorsichtig bis zur Homogenität vermischt und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um den Färbeprozess zu stoppen. Fünf bis zehn Volumina eiskaltes neurostammzellbasiertes Basalmedium werden zu den mit CFSE beladenen Zellen gegeben und gut vermischt. Die Zellsuspension wird dann zentrifugiert und das Überstand wird verworfen.Zu diesem Zeitpunkt sollte sich ein Zellpellet am Boden des Röhrchens mit einer grünen Färbung befinden, was darauf hinweist, dass die Färbung erfolgreich war. Um überschüssigen CFSE-Farbstoff zu entfernen, werden zwei bis drei Waschschritte durchgeführt, indem das Pellet in einem Milliliter neurobasalem Stammzellmedium resuspendiert, zentrifugiert und der Überstand verworfen wird.Nach der dritten Wäsche werden die Zellen in einem ml neurobasalem Stammzellmedium resuspendiert, und eine Zellzählung wird wie zuvor beschrieben durchgeführt, um die Zellen zu plattieren. Dem vollständigen neurostamzellenspezifischen Medium wird EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml zugesetzt. Anschließend werden die Zellen aus den mit CFSE beladenen und unbehandelten Gruppen ihren jeweiligen Röhrchen hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 50.000 Zellen pro ml zu erreichen.Dann werden die Zellsuspensionen gründlich gemischt und in sterilen Zellkulturgefäßen ausplattiert. Die Gefäße werden anschließend beschriftet. Die Zellen können unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht werden, um die CFSE-Färbung zu überprüfen, und danach für fünf bis zehn Tage in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2 gestellt werden.Um die CFSE-Färbung mittels Durchflusszytometrie zu überprüfen, werden 500.000 Zellen aus mit CFSE beladenen und unbehandelten negativen Kontrollgruppen in separate FACS-Röhrchen überführt. Der Durchflusszytometer wird gemäß der Bedienungsanleitung für die entsprechenden Parameter eingestellt. Zunächst werden die unbehandelten Kontrollzellen gemessen und die Ereignisse anhand der Eigenschaften des Vorwärts- und Seitenstreulichts aufgezeichnet; anschließend wird in einem Histogramm, das die Zellfrequenz über der CFSE-Intensität darstellt, die Hauptzellpopulation markiert, um die Stärke der CFSE-Fluoreszenzintensität zu überprüfen.Danach werden die mit CFSE beladenen Zellen unter Verwendung der gleichen Parameter analysiert, die auch für die Kontrollzellen verwendet wurden, wie ersichtlich ist. Die CFSE-positiven Zellen weisen eine Fluoreszenzintensität auf, die um Größenordnungen höher liegt als die der Kontrollzellen. Wenn die Gliomsphäroide einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben.Die Sphäroide werden passagiert und eine Einzelzell-Suspension wird sowohl aus den mit CFSE beladenen als auch aus den unbehandelten Gruppen wie zuvor beschrieben hergestellt. Anschließend werden die Zellen in einem geeigneten Volumen steriler 1× PBS resuspendiert und eine Zellzählung durchgeführt, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen. Beim Sortieren mittels Durchflusszytometrie wird Propidiumiodid in einer Konzentration von einem Mikroliter pro Milliliter Zellsuspension zugegeben, um langsam und schnell teilende Zellen zu sammeln.Beim Sortieren werden zwei sterile 15-ml-Zellkulturröhrchen vorbereitet, die jeweils ein ml vollständiges Neurostammzellmedium enthalten. Anschließend werden die Zellen auf Eis gestellt, während sie zur Durchflusszytometrieanlage transportiert werden. Zunächst wird die Zellsuspension der unbehandelten Zellgruppe durch den Durchflusszytometer geleitet.Die Ereignisse werden basierend auf Forward Scatter gegenüber Side Scatter dargestellt, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen. Die Zellen werden basierend auf Side Scatter gegenüber PI-Reaktivität dargestellt, und eine einzelne Population lebender Zellen wird als Population eins selektiert. Anschließend wird anhand der Forward- und Side-Scatter-Eigenschaften eine homogene Zellpopulation aus Population eins ausgewählt und als Population zwei markiert. Danach wird Population zwei in einem Histogramm dargestellt, das die Zellfrequenz gegenüber der CFSE-Intensität auf einer logarithmischen Skala zeigt, unter Verwendung derselben Parameter und Gating-Strategie.Die mit CFSE markierten Zellen werden durch den Durchflusszytometer gegeben und analysiert. Anschließend werden die unteren 85 % der Zellen als schnell teilende und die oberen 5 % als langsam teilende Zellen ausgewählt. Diese verschiedenen interessierenden Zellpopulationen werden angereichert und in separate sterile Gewebekulturröhrchen mit 15 ml, die jeweils ein ml vollständiges Neurostammzellmedium enthalten, sortiert.Die Sortierraten-Schwellenwert sollte so eingestellt werden, dass er 2.500 Ereignisse pro Sekunde nicht überschreitet. Nach Abschluss der Sortierung werden die Zellen zentrifugiert, das Überstand wird verworfen und das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium resuspendiert, anschließend erfolgt eine Zellzählung. Danach werden die Zellen der verschiedenen sortierten Populationen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro ml ausplattiert.In vollständigem Neurostammzellmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro ml EGF, werden die Zellen anschließend fünf bis 10 Tage lang inkubiert, um Sphäroide zu bilden. Dies ist ein Beispiel für Zellen. Kurz nach der Beladung mit CFSE-Farbstoff weisen alle Zellen eine intensive grüne Fluoreszenz auf, die im Fluoreszenzmikroskop sichtbar ist.Dies ist ein Bild einer repräsentativen Gliomsphäre, die sechs Tage nach der Aussaat aus einer mit A-C-F-S-E beladenen Zelle gewonnen wurde. Beachten Sie, dass einige Zellen noch eine sehr intensive CFSE-Färbung aufweisen. Dies ist ein Beispiel für ein Durchflusszytometrie-Histogramm, das zeigt, dass die CFSE-Intensität im Laufe der Zeit abnimmt.Blau repräsentiert die frisch mit CFSE beladenen Zellen, die eine hohe Fluoreszenzintensität zeigen. Diese ist um Größenordnungen höher als die der unbeladenen Zellen, die rot dargestellt sind. Grün zeigt die nach sechs Tagen abgebaute Fluoreszenzintensität infolge der Zellteilung nach der Beladung mit CFSE.Dies sind repräsentative Sphäroide, die sieben Tage nach der Isolierung von schnell und langsam teilenden Populationen gezüchtet wurden. Die Frequenzen der Sphäroidbildung unterscheiden sich nicht zwischen den beiden Gruppen, jedoch wachsen die CFSC-beibehaltenden Zellen langsamer und bilden im Vergleich zu den CFSC-verdünnenden Zellen kleinere Sphäroide. Die Verwendung von CFSC zur Identifizierung und Isolierung von Zellsubpopulationen basierend auf der Zellteilungsrate stellt einen Ausgangspunkt für nachgeschaltete Experimente und weitere Charakterisierungen dar.Dieses Protokoll bietet ein Beispiel zur Identifizierung langsam teilender Zellen in aus humanem Gliom stammenden Kulturen, kann jedoch auch auf andere Tumorzelltypen oder nicht-krebsöse Systeme angewendet werden. Vielen Dank fürs Zuschauen und wir hoffen, dass Sie dieses Protokoll für Ihre Forschung hilfreich fanden.

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CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die genetische Veränderung von Gliomzellen, um infrarotes fluoreszierendes Protein oder iRFP zu exprimieren. Diese fluoreszenzmarkierten Gliomzellen sind für die Bildgebung von tiefem Gewebe nützlich, um die Entwicklung von Hirntumoren zu verstehen.

Fluoreszenzmarkierung von Gliomzellen: Eine lentivirale vektorbasierte Transfektionsmethode zur Gewinnung von Gliomzellen, die fluoreszierendes Protein für die Tiefenbildgebung exprimieren

Quelle: Parker, J. J., et al. Ein organotypisches Schnittkulturmodell des humanen Glioblastoms zur Untersuchung der Migration von Tumorzellen und der patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Medikamenten. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Bildgebung von Glioblastom-Gewebeschnitten, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie. Hochauflösende Bilder werden in gleichbleibenden Abständen aufgenommen, um die Bewegung und Richtung der...

Bildgebung der Migration von Tumorzellen im Glioblastomgewebe mittels konfokaler Zeitraffer-Scanning-Mikroskopie

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

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Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

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Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4+ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung 

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Lernen Sie die Identifizierung und Isolierung langsam teilender Zellen in humanem Glioblastom mittels CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorheterogenität.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) (Video) | JoVE Journal

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

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