Mit Unfixierter, Frozen Tissues Natural Mucin Verteilung Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die natürliche Verteilung der Glykosylierung, des sezernierten Schleims in Gewebeproben zu erhalten. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst in die optimale Schnitttemperatur, Medium oder OCT eingebettet wird, um die Gewebeverarbeitung zu minimieren, und dann die Detektion von Glykanstrukturen, Muzin und Schleim ermöglicht. Die Schnitte werden mit Lektinen, Antikörpern und histochemischen Färbungen inkubiert.

Die Lektinbindung kann durch kompetitive Hemmung oder enzymatische Spaltung von Glykanepitopen weiter herausgefordert werden, um die Spezifität der Lektinbindung zu bestätigen. Letztendlich kann die Konservierung von Schleim und gefrorenen Gewebeproben mit der Konservierung von Schleim in paraffineingebetteten Proben durch mystische chemische Analyse verglichen werden. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. dem Einbetten von Gewebe in Paren und der Fixierung mit Autogeräuschlösung, bestehen darin, dass diese Methode keine speziellen Fixiermittel erfordert und die Verwendung von gefrorenem Gewebe ermöglicht, das möglicherweise bereits im Labor vorhanden ist.

Lassen Sie das schockgefrorene Gewebe zunächst auf minus 20 Grad Celsius erwärmen, indem Sie es in eine Kryo-Mikrotomkammer legen. In der Zwischenzeit können Sie ein Gefrierbad herstellen, indem Sie zwei Methylbutan in eine flache Styroporbox geben und dann Trockeneis in die Box geben. Fügen Sie als Nächstes gerade so viel OCT hinzu, dass der Boden einer abziehbaren Gefrierform bedeckt ist, und legen Sie dann das Taschentuch in die Form.

Achten Sie darauf, dass das Taschentuch in der gewünschten Ausrichtung auf dem Boden der Form aufliegt. Bedecken Sie das Tuch mit mehr OCT und legen Sie die Form dann in das Gefrierbad. Die OCT-Verbindung wird weiß, wenn das Gewebe gefriert. Nach dem Einfrieren schälen Sie die Form vom gefrorenen Block ab und legen Sie den Block in einen markierten Gefrierbeutel.

Lagern Sie die gefrorenen Blöcke bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie das Gewebe schneiden. Legen Sie die gefrorenen Blöcke für etwa 30 Minuten in die Kryo-Mikrotomkammer, damit sie minus 20 Grad Celsius erreichen. Wenn die Wärmeblöcke einen drei bis fünf Mikrometer dicken Abschnitt schneiden und dann einen positiv geladenen Glasobjektträger auf den Abschnitt legen.

Das Gewebe haftet an dem Objektträger, nachdem das Gewebe 30 bis 60 Minuten lang an der Luft getrocknet wurde. Fixieren Sie die Objektträger mit 10 % gepufferter Formel für 30 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Objektträger dann dreimal in PB PBS, indem Sie 10 schnelle Tauchgänge in 250 Milliliter Puffer tun, um Gewebe mit Blinddarm zu färben. Zuerst blau, die Objektträger in Wasser abspülen und dann drei Minuten lang in 3%iger Essigsäure inkubieren.

Dann inkubieren Sie das Gewebe mit AUM Blue Solution Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten 10 Minuten lang in fließendem Leitungswasser und spülen Sie sie dann in DI-Wasser ab. Färben Sie die Kerne fünf Minuten lang mit Nuclear Fast Red und waschen Sie die Objektträger dann dreimal in DI-Wasser. Dehydrieren und reinigen Sie nun die Objektträger, indem Sie eine Minute lang in 95 % Ethanol inkubieren, gefolgt von drei schnellen Wechseln in 100 % Ethanol und dann drei Änderungen in Zitrusauflösung für jeweils zwei Minuten.

Montieren Sie abschließend ein Deckglas mit einem Resonanzmedium, wie z. B. Cyto Seal 60, auf den Objektträger, um Gewebe mit periodischer Säureverschiebung zu färben. Spülen Sie die Objektträger zuerst in Wasser ab und inkubieren Sie sie dann fünf Minuten lang mit frisch zubereiteter 1%periodischer Säure. Waschen Sie nun die Rutschen dreimal in Di Wasser.

Tauchen Sie die Objektträger einmal in Milli Q Wasser und färben Sie die Gewebe dann mit Shiff Reagenz. Nach 15 Minuten die Rutschen weitere 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser waschen und dann einmal in Wasser tauchen. Färben Sie die Kerne 30 Sekunden lang mit Sgio Metin und waschen Sie die Objektträger dann dreimal in DI-Wasser.

Inkubieren Sie die Objektträger schließlich 30 Sekunden lang. In Scot's Leitungswasser wird das Bläuereagenz noch dreimal in DI-Wasser gewaschen und dann nach dem Dehydrieren des Gewebes, wie gerade für die Kalziumblaufärbung gezeigt, gewaschen. Montieren Sie die Objektträger mit einem Deckglas für die Fluoreszenzdetektion von Glykan-Epitopen mit Hilfe von Lektinen.

Blockieren Sie zuerst die Folie mit BSA in PBS für 10 bis 30 Minuten. Blockieren Sie dann das endogene Biotin, indem Sie den Objektträger 15 Minuten lang mit Avadon inkubieren, gefolgt von einer PBS-Wäsche und dann einer 15-minütigen Inkubation mit 0,01 % Biotin nach einer weiteren PBS-Wäsche. Legen Sie den Objektträger in eine Färbebox, legen Sie eine frisch zubereitete Mischung der gewünschten Lektine auf jeden Gewebeschnitt und bedecken Sie dann die Lektinmischung vorsichtig mit Parfum.

Inkubieren Sie nun die Folie nach einer Stunde im Dunkeln. Entfernen Sie vorsichtig das Parfüm und waschen Sie den Objektträger dreimal mit PBS. Dann schichten Sie den Objektträger mit Streptokokken in konjugiertem SCI five und inkubieren Sie ihn nach 30 Minuten erneut im Dunkeln, waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und färben Sie die Kerne dann mit Dappy gegen.

Montieren Sie schließlich den Objektträger mit einem Deckglas unter Verwendung eines wässrigen Mediums, wie z. B. Vektor-Einbettmedien für die Sase-Enzymkontrolle. Beginnen Sie damit, Wasser auf den Boden einer leeren Trinkgelddose zu geben, um eine feuchte Kammer zu bilden. Legen Sie die negativen Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf das obere Fach der Spitzenbox.

Schichten Sie 150 bis 200 Mikroliter einer US-Lösung auf die Gewebeschnitte und bedecken Sie dann jeden Objektträger mit einem Deckglas, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Schließen Sie den Deckel der Box und inkubieren Sie die Box nach zweieinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS bei Raumtemperatur, um alle freien Schnittsäuren zu entfernen.

Dann inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit SNA, um die Wettbewerbshemmung zu gewährleisten. 200 Mikroliter des Lektinkmisches aliquotieren Sie in zwei Durchstechflaschen. Geben Sie dann 200 Millimolar des Jacqueline-Inhibitors Meli bios in eine der Durchstechflaschen und geben Sie den SWGA-Inhibitor Chitinhydrolysat in einer Verdünnung von eins bis 10 in die andere Durchstechflasche.

Dann inkubieren Sie die Objektträger mit dem Inhibitor, der die Mischungen enthält, eine Stunde lang bei Raumtemperatur. In diesem Gewebe der ersten Abbildung wurden Schnitte von Kreuzkümmel-, Maus- oder Hühnerdickdarmproben, die in OCT eingefroren oder in Paraffin eingebettet waren, mit periodischem saurem Shiff in rosa oder Kalziumblau in blau gefärbt. Ein Vergleich zwischen Gewebeproben, die in Paraffin eingebettet waren, mit gefrorenen Geweben, die in OCT-Kryoprotektiva eingebettet waren, ergab auffällige Unterschiede in der Konservierung und Qualität der Färbung von Muzin-Glykoproteinen in den gefrorenen Geweben.

Neben Muzin in den Becherzellen war auch sekretierter Schleim sichtbar, wie die Pfeile in den in Paraffin eingebetteten Geweben zeigen. Die Schleimfärbung beschränkte sich auf Becherzellen. In dieser Abbildung ist der erhebliche Verlust von Muzin und Geweben, die in Citrus Resolve inkubiert wurden, zu beobachten.

Serienschnitte von gefrorenen Hühner-Ileum-Proben wurden in 10 % gepuffertem Formin fixiert und hydratisiert, durch sequentielle Inkubation in 70 %90 % und 100 % Ethanol jeweils 20 Minuten lang in Ethanol dehydriert oder in Ethanol dehydriert und dann eine Stunde lang mit Zitrusfrüchten geklärt. Ethanol-Dehydrierung allein und Ethanol-Dehydrierung plus Zitrusfrüchte beseitigen die verbesserte Gewebemorphologie. Eine weitere Ethanol-Dehydratisierung allein hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Blaufärbung.

Im Gegensatz dazu reduzierte und beschränkte die Zitrus-Inkubation die Blaufärbung auf Becherzellen in einem Muster, das dem ähnelte, das für das in Paraffin eingebettete Gewebe in der vorherigen Abbildung beobachtet wurde. Die Kästchen zeigen die Bereiche mit höherer Vergrößerung in den Gewebeschnitten der Alliumblau-Färbung. In der nächsten Bilderserie werden Hühner-Ileum-Proben, die in OCT eingefroren oder in Paraffin eingebettet und dann mit Jacqueline in blau, SWG in grün und SNA in rot untersucht wurden, in gefrorenem Gewebe gezeigt.

Die Bindung von Jacqueline an Olink-Glykane offenbarte Strukturen, die aus Becherzellen in das Lumen zu sickern schienen, wie die Pfeile im OCT-Schnitt aus gefrorenem Gewebe zeigen. Im Gegensatz dazu war die Bindung von Jacqueline an in Paraffin eingebettetes Gewebe auf Becherzellen und auf den durch diese Pfeile angezeigten Zottenbürstenrand beschränkt. Die SWGA-Färbung von beta one four GL kolokalisiert teilweise mit der Bindung des Jacqueline-Lektins sowohl in gefrorenen als auch in paraffineingebetteten Geweben, wie durch die Pfeile angedeutet.

Im Gegensatz dazu bindet SNA-Lektin in rot, angezeigt durch die Pfeilspitzen, intrazellulär an alpha zwei sechsverknüpfte Sialinsäuren und kolokalisiert nicht mit Jacqueline, die blau ist und durch die gestrichelten Pfeile in dieser Abbildung gekennzeichnet ist. Die Slicacid-Epitope wurden von Hühner-Ileum-Proben gespalten, indem der Gewebeschnitt mit einem US verdaut wurde, oder sie wurden durch Inkubation und Natriumacetatpuffer gespalten, wie hier zu sehen. Die US-Behandlung beseitigte die Färbung mit biotinyliertem SNA, die im unbehandelten Gewebe beobachtet wurde, was die SNA-Bindungsspezifität an Sialinsäuren bestätigt.

Die Lektinspezifität kann auch durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors wie Mely Bios für die Jacqueline-Färbung oder Chitinhydrolysat für SWGA-Färbung bestätigt werden. Hühner-Ileum-Proben wurden wiederum mit einer Jacqueline- und SWGA-Mischung inkubiert. Auch diesmal wurde in Gegenwart von spezifischen Lektininhibitoren, Mely Bios oder Chitinhydrolysat die Jacqueline-Färbung durch Mely Bios, nicht aber durch Chitinhydrolysat gehemmt. Umgekehrt wurde die SWGA-Färbung durch Chitinhydrolysat gehemmt, nicht aber durch Mely-Bios.

Diese letzte Bilderserie zeigt, dass schockgefrorene Gewebeproben, die routinemäßig in der Klinik und in Forschungslabors gewonnen werden, weiter in die OCT eingebettet und zur Untersuchung von Glykanen auf Mucin, Glykoproteinen, Glykolipiden und Glykanen verwendet werden können. Diese kolorektalen Karzinombiopsien aus Zottenkarzinom- und Schleimkarzinomgeweben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, in OCT eingebettet und erfolgreich für die verschiedenen indizierten Muzin- und Glykan-Epitope gefärbt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gewebe in die OCT einbettet und wie man Schleim und Gewebeglykosylierung mit immunchemischen Methoden analysiert.