Mit Unfixierter, Frozen Tissues Natural Mucin Verteilung Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die natürliche Verteilung der Glykosylierung des in Gewebeproben sezernierten Schleims zu erhalten. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst in optimalem Schneidetemperaturmedium (OCT) eingebettet wird, um die Gewebeverarbeitung zu minimieren, und anschließend die Detektion von Glykanstrukturen, Muzinen und Schleim ermöglicht wird. Die Schnitte werden mit Lektinen, Antikörpern und histologischen Farbstoffen inkubiert.

Die Bindung von Lektinen kann weiter durch kompetitive Inhibition oder enzymatische Spaltung von Glykan-Epitopen überprüft werden, um die Spezifität der Lektinbindung zu bestätigen. Letztendlich kann die Konservierung von Schleim und gefrorenen Gewebeproben mit der Konservierung von Schleim in paraffin-eingebetteten Proben durch mystische chemische Analyse verglichen werden. Die Hauptvorteile der Anwendung dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem Einbetten von Gewebe in Paren und der Fixierung mit Car-Noise-Lösung, bestehen darin, dass diese Methode keine Verwendung spezialisierter Fixiermittel erfordert und die Nutzung bereits vorhandener gefrorener Gewebeproben im Labor ermöglicht.

Als Erstes das schockgefrorene Gewebe durch Platzieren in einer Kryoschneidmikrotomkammer auf minus 20 Grad Celsius anwärmen lassen. In der Zwischenzeit ein Kühlbad herstellen, indem man zwei Methylbutan in eine flache Styroporschale gibt und anschließend Trockeneis zur Schale hinzufügt. Danach gerade so viel OCT hinzufügen, dass der Boden einer abziehbaren Gefriermatrize bedeckt ist, und das Gewebe dann in die Matrize legen.

Stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der gewünschten Orientierung auf dem Boden der Form liegt. Bedecken Sie das Gewebe mit weiterem OCT und stellen Sie dann die Form in das Gefriermittelbad. Die OCT-Substanz wird weiß, während das Gewebe gefriert. Sobald es gefroren ist, ziehen Sie die Form vom gefrorenen Block ab und legen den Block in einen beschrifteten Gefrierbeutel.

Bewahren Sie die gefrorenen Schnittblöcke bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie zum Schneiden des Gewebes verwendet werden. Stellen Sie die gewünschten gefrorenen Schnittblöcke etwa 30 Minuten lang in die Kammer des Kryomikrotoms, damit sie eine Temperatur von minus 20 Grad Celsius erreichen. Wenn die Blöcke ausreichend durchgekühlt sind, schneiden Sie einen drei bis fünf Mikrometer dicken Schnitt und legen anschließend einen positiv geladenen Objektträger auf den Schnitt.

Das Gewebe wird an dem Objektträger haften, nachdem die Gewebeproben 30 bis 60 Minuten luftgetrocknet wurden. Fixieren Sie die Objektträger mit 10 % gepuffertem Formalin für 30 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Objektträger anschließend dreimal in PB PBS durch 10 kurze Eintauchvorgänge in 250 Milliliter Puffer, um die Gewebe mit Aum zu färben. Zuerst blau einfärben, die Objektträger mit Wasser abspülen und dann drei Minuten in 3 %iger Essigsäure inkubieren.

Anschließend die Gewebe mit der AUM-Blau-Lösung inkubieren. Nach 30 Minuten die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser waschen und danach mit entsalztem Wasser spülen. Die Kerne fünf Minuten lang mit Kernschnellrot kontrastfärben und anschließend die Objektträger dreimal mit entsalztem Wasser waschen. Danach die Objektträger dehydrieren und klären, indem sie eine Minute lang in 95 % Ethanol inkubiert werden, gefolgt von drei schnellen Wechseln in 100 % Ethanol und anschließend drei Wechseln in Citruslösemittel je zwei Minuten lang.

Als Letztes eine Deckglas mit einem Resonanzmedium wie Cyto Seal 60 auf den Objektträger aufbringen, um Gewebe mit Periodsäure-Farbwechsel zu färben. Zunächst die Objektträger mit Wasser abspülen und dann fünf Minuten mit frisch zubereiteter 1 %iger Periodsäure inkubieren. Anschließend die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser waschen.

Tauchen Sie die Objektträger einmal in Milli-Q-Wasser und färben Sie die Gewebe anschließend mit Schiffschem Reagenz. Nach 15 Minuten waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser und tauchen sie dann einmal in destilliertes Wasser. Kontrastieren Sie die Kerne 30 Sekunden lang mit Schiff-Giemsa-Lösung und waschen Sie die Objektträger danach dreimal in DI-Wasser.

Schließlich die Objektträger 30 Sekunden lang inkubieren. In Scot's Leitungswasser-Blau-Reagenz dreimal in entionisiertem Wasser waschen und anschließend die Gewebe wie zuvor für die Calcium-Blau-Färbung beschrieben dehydrieren. Die Objektträger mit einem Deckglas auflegen, um mittels Lectinen Glycan-Epitope durch Fluoreszenznachweis zu detektieren.

Blockieren Sie zunächst den Objektträger mit BSA in PBS für 10 bis 30 Minuten. Anschließend blockieren Sie das endogene Biotin, indem Sie den Objektträger 15 Minuten mit Avadon inkubieren, gefolgt von einer PBS-Waschung und danach einer 15-minütigen Inkubation mit 0,01 % Biotin nach einer weiteren PBS-Waschung. Geben Sie den Objektträger in eine Färbebox und geben Sie auf jeden Gewebeschnitt eine frisch zubereitete Mischung der gewünschten Lektine, decken Sie die Lektinmischung dann vorsichtig mit Parfum ab.

Incubieren Sie die Probe nun eine Stunde lang im Dunkeln. Entfernen Sie vorsichtig das Parfum und waschen Sie die Probe dreimal mit PBS. Anschließend bedecken Sie die Probe mit streptavidin-konjugiertem SCI5 und inkubieren erneut 30 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Proben danach dreimal mit PBS und führen Sie anschließend eine Gegenfärbung der Kerne mit Dappy durch.

Schließlich montieren Sie den Objektträger mit einem Deckglas unter Verwendung eines wässrigen Mediums, wie beispielsweise Vector Mount Montagemedium, für die Sase-Enzymkontrolle. Geben Sie zunächst Wasser auf den Boden einer leeren Pipettenspitzenbox, um eine feuchte Kammer zu bilden. Legen Sie die Negativkontroll-Objektträger mit der Oberseite nach oben auf das obere Fach der Pipettenspitzenbox.

Tragen Sie 150 bis 200 Mikroliter einer US-Lösung auf die Gewebeschnitte auf und decken Sie danach jeden Objektträger mit einem Deckglas ab, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte. Schließen Sie den Deckel der Box und inkubieren Sie die Box nach zweieinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger dreimal bei Raumtemperatur mit PBS, um freie Slic-Säuren zu entfernen.

Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit SNA für die kompetitive Hemmung inkubieren. Kontrollaliquote von 200 Mikrolitern der Lektinmischung auf zwei Eppendorf-Gefäße aufteilen. Danach 200 Millimolar des Jacqueline-Inhibitors Meli-Bios zu einem der Gefäße geben und den SWGA-Inhibitor Chitinhydrolysat im Verdünnungsverhältnis 1:10 zum anderen Gefäß hinzufügen.

Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit den Inhibitoren enthaltenden Mischungen inkubieren. In dieser ersten Abbildung wurden Gewebeschnitte von Kümmel-Maus- oder Hühnerkolonproben, die entweder in OCT eingefroren oder in Paraffin eingebettet waren, mit Periodsäure-Schiff in Rosa oder Calciumblau in Blau angefärbt. Ein Vergleich zwischen in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und gefrorenen Geweben, die in OCT-Kryoschutzmittel eingebettet waren, zeigte auffällige Unterschiede in der Erhaltung und Qualität der Färbung von Mukin-Glykoproteinen in den gefrorenen Geweben.

Neben Muzin in Becherzellen war sekretierter Schleim ebenfalls sichtbar, wie durch die Pfeile in den in Paraffin eingebetteten Geweben angezeigt. Die Schleimfärbung beschränkte sich auf Becherzellen. In dieser Abbildung ist der erhebliche Verlust an Muzin und Gewebe, die in Zitruslösung inkubiert wurden, zu erkennen.

Serielle Schnitte von gefrorenen Dünndarmproben von Hühnern wurden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert und feucht gehalten, anschließend in Ethanol durch sequenzielle Inkubation in 70 %, 90 % und 100 % Ethanol jeweils 20 Minuten lang dehydriert oder dehydriert und danach eine Stunde lang mit Citrusall entfärbt. Die alleinige Dehydrierung in Ethanol sowie die Dehydrierung in Ethanol kombiniert mit der Entfärbung mittels Citrusall verbesserten die Gewebemorphologie. Eine zusätzliche ausschließliche Dehydrierung in Ethanol hatte keinen signifikanten Einfluss auf die blaue Färbung.

Im Gegensatz dazu reduzierte die Zitrus-All-Inkubation die blaue Färbung und beschränkte sie auf Becherzellen in einem Muster, das dem der Paraffin-eingebetteten Gewebe aus der vorherigen Abbildung ähnelte. Die Kästchen zeigen die Bereiche höherer Vergrößerung in den mit Allium-Blau gefärbten Gewebeschnitten an. In dieser nächsten Bildserie werden Hühnerileum-Proben, die entweder in OCT eingefroren oder in Paraffin eingebettet und anschließend mit Jacqueline in Blau, SWG in Grün und SNA in Rot markiert wurden, in gefrorenen Geweben dargestellt.

Die Bindung von Jacqueline an O-Link-Glykane zeigte Strukturen, die aus Becherzellen in das Lumen auszutreten schienen, wie durch die Pfeile im OCT-gefrorenen Gewebeschnitt angegeben. Im Gegensatz dazu war die Bindung von Jacqueline an paraffin-eingebettetes Gewebe auf Becherzellen und die Bürstensaumzone der Zotten beschränkt, wie durch diese Pfeile angezeigt. Die SWGA-Färbung von Beta-eins-vier-GL lokalisiert sich teilweise gemeinsam mit der Bindung des Jacqueline-Lektins sowohl in gefrorenen als auch in paraffin-eingebetteten Geweben, wie durch die Pfeile angegeben.

Im Gegensatz dazu bindet das mit Rot markierte SNA-Lektin, das durch die Pfeilspitzen gekennzeichnet ist, intrazellulär an alpha-2,6-verknüpfte Sialinsäuren und kolokalisiert nicht mit Jacqueline, das in Blau dargestellt ist und durch gestrichelte Pfeile angezeigt wird, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. Sialinsäure-Epitope wurden durch Verdauung des Gewebeschnitts mit einer US-Behandlung von Hühnerileumproben entfernt oder durch Inkubation in Natriumacetatpuffer belassen, wie hier gezeigt. Die US-Behandlung beseitigte die Färbung mit biotinyliertem SNA, die im unbehandelten Gewebe beobachtet wird, und bestätigt somit die Spezifität der SNA-Bindung an Sialinsäuren.

Die Spezifität von Lektinen kann ebenfalls durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors bestätigt werden, wie beispielsweise mely bios für die Jacqueline-Färbung oder Chitinhydrolysat für die SWGA-Färbung. Hühnerileum-Proben wurden erneut mit einer Mischung aus Jacqueline und SWGA inkubiert. Dieses Mal jedoch zusätzlich in Gegenwart spezifischer Lektin-Inhibitoren, nämlich mely bios oder Chitinhydrolysat. Die Jacqueline-Färbung wurde durch mely bios gehemmt, nicht jedoch durch Chitinhydrolysat. Umgekehrt wurde die SWGA-Färbung durch Chitinhydrolysat gehemmt, nicht jedoch durch mely bios.

Diese abschließende Bildserie zeigt, dass in der Klinik und in Forschungslabors routinemäßig gewonnene schockgefrorene Gewebeproben weiter in OCT eingebettet und zur Untersuchung von Glykanen an Mucinen, Glykoproteinen, Glykolipiden und Glykanen verwendet werden können. Diese Biopsien von kolorektalem Karzinom aus Gewebe von villösem Karzinom und Schleimkarzinom wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, in OCT eingebettet und erfolgreich für die verschiedenen angegebenen Mucin- und Glykan-Epitope gefärbt. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gewebe in OCT einbettet und wie man die Glykosylierung von Schleim und Gewebe mittels immunchemischer Methoden analysiert.