Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine große Anzahl von flüchtigen Substanzen der Wirtspflanze schnell auf mögliche biologische Aktivität zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die flüchtigen Substanzen der Wirtspflanze von Interesse gesammelt und mittels GC-MS analysiert werden. Anschließend werden die chemischen Bestandteile identifiziert und verifiziert.

Der dritte Schritt besteht darin, die einzelnen Komponenten mittels elektrografischer Analyse in ausreichender Anzahl von Wiederholungen auf biologische Aktivität zu testen. Der letzte Schritt ist die Formulierung und Bewertung von Mischungen aus aktiven Komponenten. Letztendlich können die Ergebnisse eine verkürzte Reihe von Komponenten oder eine Kombination von Komponenten liefern, die für weitere Untersuchungen in Verhaltensstudien mit dem betreffenden Insekt bereitstehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie zeitaufwändigen Verhaltensstudien, besteht darin, dass eine schnelle Untersuchung mittels elektrografischer Analyse die Anzahl der Verbindungen, die für weitere Studien benötigt werden, erheblich verringert, was einen Ablauf demonstriert. Ist Herr MR Wage ein Techniker für mein Labor? Sobald die relevanten flüchtigen Substanzen durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie identifiziert wurden, ist es möglich, zunächst eine Elektroantennographie-Analyse (EAG) jeder verfügbaren flüchtigen Substanz durchzuführen.

Allerdings müssen die verfügbaren flüchtigen Substanzen vorbereitet werden. Bereiten Sie eine Lösung jeder flüchtigen Substanz in Pentan mit einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter in einem dicht verschließbaren Behälter vor und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie anschließend die Stimulationspipetten vor.

Beschriften Sie 10 Pasteur-Pipetten pro flüchtiger Substanz und wickeln Sie deren Spitzen mit einem kleinen Stück Parafilm ein. 10 Pipetten reichen aus, um die flüchtige Substanz jedem Geschlecht in einem Vorversuch mit geringer Anzahl an Wiederholungen zuzuführen. Stellen Sie nun den verbleibenden Satz aus fünf Pipetten in einen Gestellhalter und geben Sie eine Bioassay-Scheibe in das offene Ende jeder Pipette.

Falten Sie eine Scheibe vorsichtig mit einer Pinzette und führen Sie sie teilweise in das große Ende der Pipette ein, sodass zwei bis drei Millimeter der Scheibe herausragen. Geben Sie mithilfe eines Pipettiergeräts oder einer Spritze jeweils 10 Mikroliter der flüchtigen Lösung auf jede Scheibe. Es ist äußerst wichtig, die Lösungen korrekt zu berechnen, zu formulieren und vorzubereiten, um konsistente Wiederholungen sicherzustellen.

Lassen Sie zwei Minuten verstreichen und drücken Sie die Scheiben dann vollständig in ihre Pipetten. Dichten Sie jede Pipette nach dem Befüllen unverzüglich mit Parafilm ab. Wiederholen Sie diese Pipettenvorbereitung für die gewünschte Anzahl an Wiederholungen.

Unter Verwendung desselben Protokolls bereiten Sie eine negative Kontrolle ausschließlich mit Pentanen sowie positive Kontrollen – in diesem Fall Acetophenon und Sexualhormon – vor. Fahren Sie nun mit der Vorbereitung der Insektenantennen fort.

In diesem Experiment leitet ein Vorverstärker das Signal von einer Gabel-Elektrode zum EAG-Aufnahmegerät weiter. Die mit dem EAG-Gerät bereitgestellte Software muss entsprechend in der Software konfiguriert werden. Konfigurieren Sie die Einstellungen, indem Sie zunächst die Abtastrate auf 106,7 einstellen.

Stellen Sie den Korrektur-Schalter auf „know“ und den Filter auf 0 bis 42 Hertz unter der Registerkarte „Filter“ ein. Aktivieren Sie den EAG-Filter und stellen Sie die niedrige Grenzfrequenz auf 0,1 Hertz ein. Speichern Sie anschließend die Einstellungen in einer Konfigurationsdatei für die zukünftige Verwendung.

Die Bedienung des Programms gestaltet sich dann so einfach, dass man eine neue Projektdatei öffnet, sie unter einem bestimmten Namen speichert und mit der Aufnahme fortfährt. Das rote Dreieck-Symbol startet den Aufnahmeprozess und bleibt für jede einzelne Puff-Düse eine vorbestimmte Zeit lang aktiv. Wenn alle Puff-Düsen für die Antennen durchgeführt wurden, stoppt das schwarze X-Symbol die Aufnahme, um die EAG-Antworten genauer und leichter lesbar zu machen.

Ein kleines Lineal kann am unteren Rand des Signals auf dem Computerbildschirm befestigt werden. Die Antwort wird in Millimetern aufgezeichnet und anschließend in die Amplitude in Mikrovolt umgerechnet. Falls erforderlich, können die Aufzeichnungen zur weiteren Auswertung wiedergegeben werden.

In diesem Beispiel werden drei bis vier Tage alte Orangenschwärmer-Männchen und begattete Weibchen verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch an andere Insekten angepasst werden. Überführen Sie jedes Insekt in einen kleinen, mit Streu versehenen Plastikbehälter.

Am Tag der Analyse, unmittelbar vor dem Bioassay, wird das Insekt in die große Öffnung einer Pipettenspitze eingesetzt, die eine kleinere Öffnung aufweist, die gerade groß genug ist, um den Kopf aufzunehmen. Anschließend wird mithilfe einer kleineren Pipettenspitze das Insekt vorsichtig in Richtung der kleineren Öffnung geschoben, bis der Kopf unter einem Stereomikroskop freiliegt. Stellen Sie sicher, dass die Antennen innerhalb des Halterohrs fixiert sind und die Basis der Antennen für die Entfernung frei zugänglich ist.

Bringen Sie als Nächstes den Gabelhalter mit einem dünnen Film Elektrolygel in unmittelbare Nähe zur Antenne; lösen Sie mit einer feinen Schere vorsichtig, dann entfernen Sie beide Antennen und starten Sie eine Stoppuhr, um die Zeit zwischen diesem Ereignis und den anschließenden Reizen zu erfassen. Nehmen Sie mit einem drahtigen Werkzeug, das an der Spitze etwas Gel trägt, eine Antenne auf und platzieren Sie sie auf der Gabel. Stellen Sie sicher, dass das Basalglied der Antenne auf der nicht-roten indifferenten Bezugselektrode der Gabel aufliegt.

Wiederholen Sie denselben Vorgang für die zweite Antenne. Platzieren Sie die Basis der Antenne auf derselben Seite der Gabel, zwei bis drei Millimeter auseinander, mit der Antenne in Position. Schneiden Sie die Spitzen der Antenne bei Bedarf zurecht.

Tragen Sie die Elektrode mit einem Pinsel auf das Gel auf und stellen Sie sicher, dass ihr Schaft und ihre Spitze vollständig in das Elektrodengel eingetaucht sind, sodass keine Luftblasen im Gel verbleiben. Vermeiden Sie es, den mittleren Antennenabschnitt mit Gel zu bedecken, um die Oberfläche der Antenne, die der Duftstoffpuff aben kann, zu maximieren. Sobald die Präparation ordnungsgemäß mit Gel versehen ist, schließen Sie die Gabel an den Probenvorverstärker an.

Leiten Sie nun einen Luftstrom über die Präparation, der mit Feuchtigkeit angereichert ist, um die Vitalität eines Antennenpräparats aufrechtzuerhalten. Zehn Minuten nach der Entnahme wenden Sie den ersten Reiz an. Die Reihenfolge der Reizung eines Präparats beginnt und endet mit einer positiven Kontrolle, dazwischen erfolgt die Stimulation mit einer randomisierten Sequenz von Substanzen, wobei keine identischen Substanzen direkt aufeinanderfolgen dürfen, und mindestens eine negative Kontrolle enthalten sein muss. Die Anzahl der Substanzen, die einer Antenne zugeführt werden, variiert je nach Art.

Eine Vorbereitung der Orangenwickler-Motte kann über 30 Minuten aktiv bleiben, wodurch bis zu 10 flüchtige Substanzen mit einer geringen Anzahl an Wiederholungen leicht analysiert werden können. Das gleiche Prinzip der Probenapplikation gilt für nachfolgende Untersuchungen von Gemischen, die in der Voruntersuchung Reaktionen hervorgerufen haben. Die erste Stimulationspipette muss 30 Sekunden vor der Applikation des Puff-Stimulus vorbereitet werden; öffnen Sie die Pipette und platzieren Sie sie im Halter, sodass der Luftstrom zwei bis drei Millimeter von den Antennen entfernt auf diese trifft, zehn Minuten nach der Antennentrennung.

Geben Sie den ersten Stimulusstoß über eine bis zwei Sekunden bei 300 Milliliter pro Minute ab. Ersetzen Sie nun schnell die Pipette, sodass eine Minute nach dem ersten Stimulus der zweite abgegeben wird. Eine konsistente Vorgehensweise zwischen den Proben minimiert die Variabilität der tatsächlich applizierten flüchtigen Mengen.

Nach der Verabreichung des letzten positiven Kontrollpuffs wird die Antenne entfernt und die Gabel gereinigt. Mit einem mit Ethanol getränkten Tuch abwischen und vor der nächsten Verwendung vollständig trocknen lassen. Um die Durchsatzrate der Assays zu erhöhen, sollte ein Assistent 10 Minuten vor dem Ende der vorherigen Vorbereitungen die nächste Antenne mit sauberen Gabeln vorbereiten.

Testsequenz, für diese Methode ist mehr als eine Gabel notwendig. Nach jedem Experiment die Testmotten in einer Trockeneis-Umgebung euthanasieren und die Weibchen sezieren, um ihren Paarungsstatus zu überprüfen. Es wird angenommen, dass die zusammenlebenden Männchen paariert haben. Antennenpräparationen des Navel-Orange-Wurms wurden mit zwei Sekunden langen Puffs stimuliert, und zehnsekündige Aufnahmen wurden mit einem zehnsekündigen Fenster auf einer Skala von fünf Millivolt durchgeführt.

Eine negative Ausschlagung war die typische Reaktion. Dennoch wurden die absoluten Werte aufgezeichnet. Alle Präparationen von Weibchen mit einer schwachen Reaktion auf die positive Kontrolle wurden verworfen.

Die durchschnittliche Antwort der verbleibenden Präparationen betrug 2.600 Mikrovolt. Ebenso lag die durchschnittliche Antwort der Männchen auf die pH-Kontrolle des Geschlechts typischerweise bei 3.000 Mikrovolt. Daher wurden Daten von Anani mit unterdurchschnittlicher Antwort verworfen; ebenso wurden Daten von Antennen verworfen, die im Verlauf des Versuchs eine abnehmende Antwort zeigten.

Ein Abbau trat auf, wenn die Anton-Antwort auf die Puff-Dosis der letzten positiven Kontrolle entweder weniger als 75 % der ersten Puff-Dosis der Prä-Kontrollmessung betrug oder weniger als die zweite Puff-Dosis der Prä-Kontrolle für die verbleibenden experimentellen Durchläufe. Die Antwortwerte wurden analysiert, indem die Rohmesswerte jedes Durchlaufs herangezogen und von jedem Wert dieses Durchlaufs die Antwort der negativen Kontrolle desselben Durchlaufs abgezogen wurde. Anschließend wurden alle positiven Kontrollen jedes Durchlaufs gemittelt und auf 1000 Mikrovolt korrigiert, wobei das Korrekturverhältnis auf 1000 Mikrovolt für jeden Durchlauf notiert wurde.

Die Werte für die getesteten Verbindungen wurden anschließend mit dem Korrekturfaktor der positiven Kontrolle multipliziert. Abschließend wurde die durchschnittliche korrigierte Wirkung jeder getesteten Verbindung über alle Durchläufe hinweg verglichen, um die Eignung jeder Verbindung für weitere Untersuchungen zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Chemikalien äußerst gefährlich sein kann und stets geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.