Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine große Anzahl von flüchtigen Substanzen der Wirtspflanze auf mögliche biologische Aktivität schnell zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst die flüchtigen Substanzen der interessierenden Wirtspflanze gesammelt und mittels GC-MS analysiert werden. Anschließend werden die chemischen Bestandteile identifiziert und verifiziert.

Der dritte Schritt besteht darin, die einzelnen Komponenten mittels elektrografischer Analyse in ausreichender Anzahl von Wiederholungen auf biologische Aktivität zu testen. Der letzte Schritt ist die Formulierung und Bewertung von Mischungen der wirksamen Komponenten. Letztendlich können die Ergebnisse eine verkürzte Reihe von Einzelkomponenten oder Komponentenmischungen liefern, die für weitere Untersuchungen in Verhaltensstudien mit dem betreffenden Insekt bereitstehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie zeitaufwändigen Verhaltensstudien, besteht darin, dass eine schnelle Untersuchung mittels elektrografischer Analyse die Anzahl der Verbindungen, die für weitere Studien benötigt werden, erheblich verringert, wie ein dargestelltes Verfahren zeigt. Ist Herr MR Wage Techniker in meinem Labor? Sobald die relevanten flüchtigen Substanzen mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie identifiziert wurden, ist es möglich, zunächst eine Elektroantennographie-Analyse (EAG) jeder verfügbaren flüchtigen Substanz durchzuführen.

Allerdings müssen die verfügbaren flüchtigen Substanzen vorbereitet werden. Bereiten Sie eine Lösung jeder flüchtigen Substanz in Pentan mit einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter in einem Behälter vor, der dicht verschlossen und bei vier Grad Celsius gelagert werden kann. Bereiten Sie anschließend die Stimulationspipetten vor.

Etikettieren Sie 10 Pastellen-Pipetten pro flüchtiger Substanz und umwickeln Sie deren Spitzen mit einem kleinen Stück Parafilm. 10 Pipetten reichen aus, um die flüchtige Substanz jedem Geschlecht in einem Vorversuch mit geringer Anzahl an Wiederholungen zuzuführen. Stellen Sie nun den verbleibenden Satz aus fünf Pipetten in einen Halter und geben Sie je eine Bioassay-Scheibe in das offene Ende jeder Pipette.

Falten Sie eine Scheibe vorsichtig mit einer Pinzette und führen Sie sie teilweise in das breite Ende der Pipette ein, sodass zwei bis drei Millimeter der Scheibe freiliegen. Geben Sie mithilfe eines Pipettiergeräts oder einer Spritze 10 Mikroliter der flüchtigen Lösung auf jede Scheibe. Es ist äußerst wichtig, die Lösungen korrekt zu berechnen, zu formulieren und herzustellen, um konsistente Wiederholungen sicherzustellen.

Lassen Sie zwei Minuten verstreichen und drücken Sie die Scheiben dann vollständig in ihre Pipetten. Dichten Sie jede Pipette nach dem Befüllen unverzüglich mit Parafilm ab. Wiederholen Sie diese Pipettenvorbereitung für die gewünschte Anzahl von Wiederholungen.

Unter Verwendung desselben Protokolls bereiten Sie eine negative Kontrolle ausschließlich mit Pentanen sowie positive Kontrollen – in diesem Fall Acetophenon und Sexualhormon – vor. Fahren Sie nun mit der Vorbereitung der Insektenantennen fort.

In diesem Experiment leitet ein Vorverstärker das Signal von einer Gabel-Elektrode zum EAG-Aufnahmegerät weiter. Die mit dem EAG-Gerät bereitgestellte Software muss entsprechend in der Software konfiguriert werden. Konfigurieren Sie die Einstellungen, indem Sie zunächst die Abtastrate auf 106,7 festlegen.

Stellen Sie den Korrektur-Schalter auf „know“ und den Filter auf 0 bis 42 Hertz unter der Registerkarte „Filter“ ein. Aktivieren Sie den EAG-Filter und stellen Sie die niedrige Grenzfrequenz auf 0,1 Hertz ein. Speichern Sie anschließend die Einstellungen in einer Konfigurationsdatei für die zukünftige Verwendung.

Die Bedienung des Programms ist dann so einfach, wie das Öffnen einer neuen Projektdatei, das Speichern unter einem bestimmten Namen und das Fortfahren mit einer Aufnahme. Das rote Dreieck-Symbol startet den Aufnahmeprozess und bleibt für jede einzelne Pustenstöße um eine vorbestimmte Zeit aktiv. Wenn alle Pustenstöße für die Antennen durchgeführt wurden, stoppt das schwarze X-Symbol die Aufnahme, um die EAG-Antworten genauer lesbar zu machen.

Ein kleines Lineal kann an der Basislinie des Signals auf dem Computerbildschirm befestigt werden. Die Antwort wird in Millimetern aufgezeichnet und anschließend in die Amplitude in Mikrovolt umgerechnet. Falls erforderlich, können die Aufzeichnungen zur weiteren Auswertung wiedergegeben werden.

In diesem Beispiel werden drei bis vier Tage alte Orangeneulen-Männchen und -Weibchen verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch an andere Insekten angepasst werden. Überführen Sie jedes Insekt in einen kleinen, mit Streu versehenen Plastikbehälter.

Am Tag der Analyse, unmittelbar vor dem Bioassay, wird das Insekt in die große Öffnung einer Pipettenspitze mit kleinerer Öffnung eingeführt, die gerade groß genug ist, um den Kopf aufzunehmen. Anschließend wird mithilfe einer kleineren Pipettenspitze das Insekt vorsichtig in Richtung der kleinen Öffnung geschoben, bis der Kopf unter einem Stereomikroskop freiliegt. Dabei ist sicherzustellen, dass die Antennen in der Halteröhre fixiert sind und die Basis der Antennen zur Entfernung frei zugänglich ist.

Positionieren Sie als Nächstes den Gabelhalter mit einem dünnen Film Elektroden-Gel in unmittelbarer Nähe zur Antenne; lockern Sie die Antennen vorsichtig mit einer feinen Schere und entfernen Sie dann beide Antennen. Starten Sie eine Stoppuhr, um die Zeit zwischen diesem Ereignis und den anschließenden Reizen aufzuzeichnen. Heben Sie mithilfe eines drahtbesetzten Werkzeugs, das an der Spitze eine kleine Menge Gel trägt, eine Antenne auf und platzieren Sie sie auf der Gabel. Achten Sie darauf, dass das Basalende der Antenne auf der nicht-roten indifferenten Gegenelektrode der Gabel liegt.

Wiederholen Sie dasselbe für die zweite Antenne. Platzieren Sie die Basis der Antenne auf derselben Seite der Gabel, zwei bis drei Millimeter auseinander, mit der Antenne in Position. Schneiden Sie die Spitzen der Antenne nach Bedarf ab.

Tragen Sie die Elektrode mit einem Pinsel auf das Gel auf und stellen Sie sicher, dass Basis und Spitze in Elektroden-Gel eingetaucht sind, sodass keine Luftblasen im Gel enthalten sind. Vermeiden Sie es, den mittleren Antennenabschnitt mit Gel zu bedecken, um die der Duftstoffpuff abgegebene Antennenoberfläche zu maximieren. Sobald die Präparation ordnungsgemäß verklebt ist, schließen Sie die Gabel an den Probenvorverstärker an.

Leiten Sie nun einen Strom von befeuchteter Luft über das Präparat, um die Vitalität eines Antennenpräparats aufrechtzuerhalten. Zehn Minuten nach der Entnahme beginnen Sie mit der Applikation des ersten Stimulus. Die Reihenfolge der Stimulation eines Präparats beginnt und endet mit einer positiven Kontrolle, dazwischen erfolgt die Stimulation mit einer randomisierten Abfolge von Verbindungen, wobei keine identischen Verbindungen direkt aufeinanderfolgen dürfen, sowie mindestens einer negativen Kontrolle; die Anzahl der applizierten Verbindungen pro Antenne variiert je nach Art.

Eine Vorbereitung der Orangenrüsslermotte kann länger als 30 Minuten aktiv bleiben, wodurch bis zu 10 flüchtige Substanzen mit geringer Wiederholungszahl leicht analysiert werden können. Dasselbe Prinzip der Probenapplikation gilt für nachfolgende Tests von Substanzgemischen, die in der Voruntersuchung Reaktionen hervorgerufen haben. Die erste Stimulationspipette muss 30 Sekunden vor der Applikation des Luftstoßes vorbereitet, geöffnet und in der Halterung so positioniert werden, dass sie den Luftstrom zwei bis drei Millimeter von den Antennen entfernt leitet, und zwar zehn Minuten nach der Entfernung der Antenne.

Geben Sie den ersten Stimulusstoß über eine bis zwei Sekunden bei 300 Milliliter pro Minute ab. Ersetzen Sie nun schnell die Pipette, sodass eine Minute nach dem ersten Stimulus der zweite appliziert wird. Eine konsistente Vorgehensweise zwischen den Proben minimiert die Variabilität der tatsächlich applizierten flüchtigen Mengen.

Nach der Verabreichung des letzten positiven Kontrollpuffs wird die Antenne entfernt und die Gabel gereinigt. Mit einem mit Ethanol getränkten Tuch abwischen und vor der nächsten Verwendung vollständig trocknen lassen. Um die Durchsatzrate der Assays zu erhöhen, sollte ein Assistent 10 Minuten vor dem Ende der vorherigen Vorbereitungen die nächste Antenne mit sauberen Gabeln vorbereiten.

Testablauf, für diese Methode ist mehr als eine Gabel notwendig. Nach jedem Experiment werden die Testmotten in einer Trockeneisumgebung euthanasiert und die Weibchen seziert, um ihren Paarungsstatus zu überprüfen. Es wird angenommen, dass die zusammenlebenden Männchen gepaart haben. Die Antennenpräparationen der Orangenschorfmotte wurden mit Zweisekunden-Puffs stimuliert, und Zehnsekundenaufzeichnungen wurden mit einem Zehnsekunden-Fenster auf einer Fünf-Millivolt-Skala durchgeführt.

Eine negative Ausschlagung war die typische Reaktion. Dennoch wurden die absoluten Werte aufgezeichnet. Alle Präparationen von Weibchen mit einer schwachen Reaktion auf die positive Kontrolle wurden verworfen.

Die durchschnittliche Antwort der verbleibenden Präparationen betrug 2.600 Mikrovolt. Ebenso lag die durchschnittliche männliche Antwort auf die pH-Kontrolle des Geschlechts typischerweise bei 3.000 Mikrovolt. Daher wurden Anani mit einer unterdurchschnittlichen Antwort verworfen; Daten von Antennen, die im Verlauf des Versuchs eine abnehmende Antwort zeigten, wurden ebenfalls verworfen.

Ein Abbau trat auf, wenn die Anton-Antwort auf die Puff-Dosis der endgültigen positiven Kontrolle entweder weniger als 75 % der ersten Puff-Dosis der Prä-Kontrollmessung betrug oder weniger als die zweite Puff-Dosis der Prä-Kontrollmessung für die verbleibenden experimentellen Durchläufe. Die Antwortwerte wurden analysiert, indem die Rohmesswerte jedes Durchlaufs herangezogen und die Antwort der negativen Kontrolle dieses Durchlaufs von jedem Wert innerhalb des Durchlaufs subtrahiert wurde. Anschließend wurden alle positiven Kontrollen jedes Durchlaufs gemittelt und auf 1000 Mikrovolt korrigiert, wobei das Korrekturverhältnis auf 1000 Mikrovolt für jeden Durchlauf notiert wurde.

Die Werte für die getesteten Verbindungen wurden anschließend mit dem Korrekturfaktor der positiven Kontrolle multipliziert. Abschließend wurde die durchschnittliche korrigierte Reaktion jeder getesteten Verbindung über alle Durchläufe hinweg verglichen, um die Eignung jeder Verbindung für weitere Untersuchungen zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Chemikalien äußerst gefährlich sein kann und stets angemessene Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.